关键词：
克隆测序（精选六篇）
克隆测序 篇1
瘦素 (leptin) 是脂肪细胞分泌的一种肽类激素[1] , 它可以调控机体中脂类、蛋白质和糖类代谢, 能够在动物脂肪沉积、繁殖等多方面都起到重要作用[2,3,4,5,6,7]。瘦素的作用是通过靶细胞膜上的受体 (OBR) 和相应的信号转导系统实现的。OBR是Ⅰ类细胞因子超家族受体, 具有单一的跨膜结构。OBR基因转录后进行选择性剪接翻译后生成多种异构体, 它们的胞外区相同, 但胞内结构域长度和序列不同。
1 材料与方法
1.1 试验动物
沙维马特鹌鹑, 每只采血5 mL, EDTA抗凝, -20 ℃保存备用, 取20 μL血液提取基因组。
1.2 试剂
PCR试剂和rTaq酶, 购自哈尔滨伊事达生物工程有限公司, 胶回收 (小量) 试剂盒和小量质粒抽提纯化试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司;质粒PMD18-Tvector, 购自Promega公司;转化宿主细胞JM109大肠杆菌, 由东北农业大学动物遗传育种实验室制备;氨苄西林, 购自哈尔滨宝泰克公司;限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ, 购自上海华舜生物工程有限公司。
1.3 PCR引物
鹌鹑的OBR基因未见报道, 根据鸡的OBR基因对鹌鹑的OBR基因外显子设计了一对引物, 引物序列如下:F1 5′-CACTGTATGGTCCACGAGATT-3′;R1 5′-AACTGGCGTTGTTATTGCTC-3′。
1.4 方法
1.4.1 DNA提取和检测
按照常规酚/氯仿抽提法进行DNA提取, 并溶于TE中, -20 ℃保存。用紫外分光光度计法检测DNA浓度, 并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度, 将DNA稀释至50 ng/μL备用。
1.4.2 PCR扩增
PCR扩增总体积为25 μL, 其中灭菌水16.3 μL, 10×Buffer (含镁离子) 2.5 μL, dNTP (10 mmol/L) 2.0 μL, 上、下游引物 (10 pmol/L) 各1 μL, rTaq聚合酶0.2 μL, DNA模板2 μL。扩增反应在PCR仪上进行, PCR循环参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 51.8 ℃复性30 s;72 ℃延伸40 s, 32个循环;72 ℃延伸7 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4.3 电泳及观察分析
取5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶上120 V电泳30 min, 经溴乙锭染色后在UVP凝胶成像系统上观察并记录结果。
1.4.4 PCR扩增产物的克隆
将PCR扩增产物回收并从琼脂糖上割下放入1.5 mL EP管中, 经胶回收试剂盒纯化后与PMD18-Tvector载体连接之后将10 μL连接产物转化到100 μL的JM109感受态宿主菌中;取150 μL转化产物涂在含氨苄西林 (100 mg/L) 的LB平板上, 37 ℃烘箱培养10～12 h;挑取经PCR鉴定后的阳性白色菌斑放入LB液体培养基中37 ℃培养8～12 h, 然后用小量质粒抽提纯化试剂盒提取质粒。
1.4.5 质粒酶切鉴定和测序
用BamH Ⅰ-Hind Ⅲ双酶切后鉴定确认, 将鉴定确认后的质粒快速邮递到华大生物技术有限公司测序。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
以鹌鹑DNA为模板进行PCR扩增, 扩增得到长约208 bp的基因片段, 阴性对照没有出现条带, 证明扩增的条带真实可靠, 见图1。
1～9.PCR扩增产物;10.阴性对照;11.DL-2 000 Marker。
2.2 测序结果
经华大生物技术有限公司测定, 鹌鹑的OBR基因外显子部分序列长度为208 bp, 现已将序列提交到GenBank上 (分析号GQ867177) 。
3 分析与讨论
将所测序列通过GenBank中的Blast比较分析, 长度为208 bp的OBR基因外显子部分序列与鸟纲中鸡形目中原鸡的同源性为100%, 与火鸡的同源性为91%, 与雁形目中绿头鸭的同源性为83%, 与雀形目中珍珠鸟的同源性为70%, 这些结果说明鹌鹑与稚科物种亲缘关系最亲, 与鸟纲其他物种也有较高的同源性, 通过与哺乳纲、两栖纲、鱼纲的动物比较, 同源性均低于50%, 而同一纲动物OBR基因之间具有很高的同源性, 如人、猪、牛、羊的OBR基因的同源性达到 80%以上, 说明OBR基因的该段序列属鸟纲特有的, 在进化上具有很高的物种特异性。
OBR基因在禽类和哺乳动物中所转录异构体的数量是不同的。目前, 在禽类中仅发现2种异构体——长受体和短受体, 而在哺乳动物小鼠中有6种异构体——OBR-a、OBR-b、OBR-c、OBR-d、OBR-e、OBR-f。在氨基酸水平上, 鸡leptin长受体与哺乳动物leptin长受体约有50%的同源性, 而且在各组织表达部位也有较大的差异。这说明OBR氨基酸序列也具有很高的物种特异性。
4 小结
研究利用PCR技术对鹌鹑OBR基因部分序列进行了克隆, 并且将该序列提交GenBank上, 通过序列比较, 鹌鹑的OBR基因与鸟纲中鸡形目的原鸡、火鸡的同源性分别为100%和91%, 与鸟纲中其他目中动物也有较高的同源性, 但是在与哺乳纲、两栖纲、鱼纲动物的OBR基因相比时, 同源性均很低, 说明OBR基因在进化上具有一定的物种特异性。试验只是对鹌鹑OBR基因进行了初步探索, 希望为OBR基因的进一步研究提供重要的参考价值。
参考文献
[1]ZHANG Y Y, RICARDO P, MARGHERITA M, et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J].Na-ture, 1994, 372:425-432.
[2] FRIDEMAN J M, JEFFREY L H. Leptin and the regulation of bodyweight inmammals[J].Nature, 1998, 395:763-770.
[3] MARY A P, MARY J C, MARYBETH B, et al. Effect of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice[J].Science, 1995, 269:540-543.
[4] JEFFREY L H, KETAN S G, MARGHERITA M, et al. Weight-reducing effects of the plasma protein encode by the obese gene[J].Science, 1995, 269: 543-546.
[5]CAMPFIELD LA, SMITH F J, GUISEZ Y, et al.Recombinant mouse OB protein:evidence for a peripheral signal linking adipos-ityand central neural networks[J].Science, 1995, 269:546-549.
[6]DENBOW D M, MEADE S, ROBERTSON A, et al.Leptin-in-duced decrease in food Intake in chickens[J].Physiol Behav, 2000, 69:359-362.
基因测序分外热闹 篇2
PacBio是一家很有代表性的新兴生物技术公司。这家公司由一群最著名的VC投资，上市前已经融资4亿多美元，上市时又融资2亿多美元。他们的技术来自哈佛大学，从公司管理到产品技术都有各路知名牛人参与，CEO也是硅谷大佬。起初，大伙儿对其产品有很高的期待，但是后来因为产品不过关，出现各种问题，期望变失望，公司的价值也随之蒸发。现在很多人在问：这家公司最终能不能生存下来？
5年前，基因测序技术领域充满了活力：大量VC投资蜂拥而入，大批新公司如雨后春春般诞生。PacBio和我创建的ForteBio咫尺之遥，我们几乎同时拿到第一笔VC投资，而且是同一家VC领投的。可以说，我是看着PacBio从十几个人的创业团队增加到浩浩荡荡的几百号人，然后上市，后来又慢慢陷入困境的。
与PacBio同期的另一家新兴基因测序技术公司Ion Torrent，其技术源自斯坦福大学，两年前以6亿多美元的价格卖给Life Technologies。从技术指标上看，PacBio的性能要超越Ion Torrent；但是PacBio的产品质量迟迟不过关，而Ion Torrent把产品做好了，而且卖得相当轰动。
另外一家美国的基因检测技术公司Illumina刚刚经历了一场吞并和反吞并的战斗，硝烟还未散尽。Illumina最早是做基因芯片的，后来陆续收购了基因测序技术，发展成为测序领域的大拿。据说有中国政府背景的深圳华大基因一次就采购了128台Illumina的测序仪，每台售价可能近百万美元。企图吞并Illumina的是赫赫有名的罗氏公司。罗氏自己也有测序技术，但不是非常成功。罗氏想通过恶意收购，在未来的基因测序领域卡位，同时提升罗氏自身的肿瘤药物的伴随诊断。Illumina董事会认为罗氏出价过低，一口回绝收购意向。罗氏不断进攻，把收购价格抬高到67亿美元，并且企图控制Illumina董事会。最终，Illumina董事会祭出“毒丸”战术，击败了罗氏的恶意收购。今天Illumina的市值已经冲到65亿美元，在测序领域的三分天下中占了一分。
前不久，深圳的华大基因宣布以1.176亿美元收购硅谷的一家基因测序公司Complete Genomics。这是中国生物技术公司在美国的大手笔，欲为中国在基因测序产业获得领先地位而进行的努力。Complete Genomics曾经是生物技术领域的一颗明星，但是随着技术的发展和竞争的加剧，基因测序的价格从2010年到2011年的一年里跌掉了2/3，使得该公司营收锐减。正是在这种情况下，华大基因出手，将其揽进怀里。两家在生意上有互补性，更重要的是他们能为将来的临床应用基因测序做技术准备，虽然这条路可能还很长很长。
2012年生物技术领域总体上是寒风凛冽，但是基因测序却分外热闹。基因测序技术的发展对未来医药研发、疾病诊断及治疗影响深远。迄今为止，最有影响力和竞争力的基因测序技术公司都在美国。基因测序技术涉及到生物、半导体、光学、精密机械、自动化、软件、数学等等领域，属于真正的高科技。从PacBio、Ion Torrent、Illumina等公司的事例中，我们其实能认识和学习到很多东西。
第一，电商不是高科技，基因测序才是。
在国内经常看到“电商”被誉为“高科技”的情况。经营电商是有些技术活儿，但绝对不是高科技。高科技的定义是处于最前沿的技术，是迄今为止最先进的技术。评判是否为高科技的一种办法是看研发的强度：研发强度越大的产业，其技术含量越大，自然就是高科技了。根据“世界经济合作与发展组织”的研究结果，其中，生物和制药、航空和航天、医疗/精密/光学仪器的研究总强度处于前三位。国家要强大，社会要进步，生活要更好，需要发展高科技，所以国内媒体应该多多弘扬高科技创业。
第二，高科技投资肯定是高风险的，在这儿“点石成金”只是神话。
PacBio投资几亿美元，VC迄今为止基本上没有回收一分钱。但是，Ion Torrent的投资就有了很好的回报。高科技一旦成功，除了财务收获外，一方面是巨大的成就感，另外一方面是推进人类社会的进步。PacBio的技术是在一个微米级别的小孔内把基因的碱基一个接一个扯下来，然后给它们安上不同颜色的荧光，用近场光学系统检测荧光颜色，这样就能测出基因的序列。在一块小玻璃片上，做出成千上万个这样的小孔，就能同时检测海量的基因。
Ion Torrent则利用半导体技术把酸度计做得比针尖还小，然后在一块芯片上制造出成千上百个比跳蚤还小的小孔，在每个小孔安放一个这样的微型酸度计。使用时，把被测的单链基因放置在小孔内，按序把含有不同碱基的试剂灌进小孔。如果微型酸度计检测出基因和碱基结合时释放出的氢离子，就记录一个相应的碱基；如果没有测到氢离子，就表示没有这个碱基。重复这样的步骤亿万次，就能测出整个基因的序列。
这些技术是不是听起来特玄？确实如此。高科技的东西往往就是如此玄乎，但是最终却能成为生产力。这个过程往往漫长、艰辛，充满失败的风险。这些领域中，VC发挥了独特的作用。一旦成功，高风险的投资理所当然地获得高额回报。美国就是有一批这样的风险投资，专门投身异想天开的项目或公司里去。中国的风投在眼光、胆量和能力上比美国同行还有不少差距。
第三，失败是成功之母。
PacBio还不算一家真正成功的公司，但是这不妨碍我们对这家公司及其创业者的尊重和对其创新的赞叹。从PacBio的坎坷经历中，我们可以领会到一些道理：首先，大牌人物和顶级VC不是万能的，不能保证产品和公司的最后成功；其次，好技术往往还需要好运气才有可能成为好产品；另外，高科技创业应该寻找有耐心、懂产品研发流程的投资者，以获得他们的长期支持。
纵观2012年，虽然基因测序产业充满风风雨雨，但真正的战争还没开始，新一代测序技术正在酝酿之中。我预计今后5到10年内会出现更大的争夺战。虽然我们自己无法置身于这个产业之中，但测序技术革命会对人类的健康和未来起到巨大影响，完全值得我们去密切关注。
（作者系连环创业客，曾创办ET Healthcare、Wave Crossing、ForteBio等公司。）
克隆测序 篇3
Roberts S B等[3]首次在大马哈鱼体内发现两种MSTN mRNA, 将其分别命名为MSTNⅠ和MSTNⅡ, 并测得MSTNⅠmRNA由2 346个核苷酸组成, MSTNⅡmRNA由1 409个碱基组成, 二者同源性为93%[4,5];2004年, Biga P R等[6]报道在斑马鱼体内亦存在2个MSTN的mRNA;Kerr T等[7]通过试验进一步证明在鱼体内普遍存在MSTN mRNA, 将这2个亚科分别称为MSTN-1和MSTN-2;Garikapati D K等[8]报道, 在大马哈鱼体内普遍存在4种不同的MSTN基因, 分别命名为rtMSTN-1a、rtMSTN-1b、rtMSTN-2a和rtMSTN-2b, 二者保守区的同源性达94%。2008年, 李新华等[9]首次报道在寿光鸡腿肌中发现三种不同大小的MSTN基因转录子。试验拟以乌鸡作为小型家禽的代表, 确定乌鸡中MSTN转录子的存在情况, 从而为进一步确定家禽体内是否普遍存在3种MSTN基因转录子提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
无菌条件下采取纯种乌鸡 (由沈阳农业大学鸡场提供) 的腿肌组织, 迅速放入液氮中冷冻并置于-80 ℃超低温冰箱中保存。
大肠杆菌DH5α感受肽细胞和pMDl8-T Simple 载体、 RNAiso Reagent、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 、BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0胶回收试剂盒、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、核酸分子质量marker, 均为TaKaRa公司产品;琼脂糖 (BBI) 、溴化乙锭 (Amresco) 、LB Broth, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR引物的设计与合成
根据GenBank中家禽MSTN基因序列, 利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计1对寡核苷酸引物, 并在上、下游引物的5′端分别加入保护碱基和酶切位点。引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。引物序列:上游引物5′- GCGCTCGAGATGCAAAAGCTAGCAGTCTATGTTT -3′ (下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点) ;下游引物5′- AGGGATCCTCATGAGCACCCGCAACGATCTACAA -3′ (下划线部分为XhoⅠ酶切位点) 。
1.2.2 乌鸡和鸽子总RNA的提取
取出冰箱中保存的肌肉组织, 利用RNAiso Reagent提取肌肉中的总RNA。
1.2.3 反转录及MSTN cDNA的PCR扩增
参照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0的说明书进行。反转录反应条件:42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 5 ℃ 5 min。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸150 s, 共35个循环;72 ℃终止5 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外灯下进行观察。
1.2.4 目的cDNA片段的回收
按照TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0胶回收试剂盒的说明进行, 对回收产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.5 MSTN cDNA的克隆和测序
用回收的目的cDNA片段作为插入DNA, 按照pMD18-T Simple 载体试剂盒说明书进行连接反应, 于16 ℃条件下连接12 h以上, 构建重组质粒pMD18-T-MSTN。然后转化DH5α感受态细胞, 取100 μL涂布于含100 μL/mL氨苄西林 (Amp) 、IPTG和X-gal的LB培养基中培养, 37 ℃恒温培养12 h;挑取单个白色菌落接种于加入Amp (100 μg/mL) 的液体LB培养基中恒温培养12～16 h。按照TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0说明书提取质粒;使用菌液PCR和双酶切 (BamHⅠ与XhoⅠ) 鉴定, 将初步确定为阳性的重组质粒送宝生物工程 (大连) 有限公司进行测序。
2 结果与分析
2.1 MSTN基因的RT-PCR扩增
MSTN 基因RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图1。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.乌鸡MSTN基因的RT-PCR扩增产物。
由图1可见, 扩增产物呈现3条清晰的电泳条带, 一条电泳带在1 100 bp处, 与预期的鸡MSTN cDNA全长序列大小相符;另外, 在1 000 bp和750 bp处也均有清晰条带。
2.2 MSTN cDNA的重组质粒菌液PCR鉴定
PCR产物经电泳分离, 回收1 100 bp、1 000 bp及750 bp处的目的片段, 分别命名为cbMSTN-1、cbMSTN-2和cbMSTN-3。将这3个目的片段分别与pMD18-T Simple 载体连接, 转化DH5α大肠杆菌感受态细胞, 在LB培养基中培养。通过蓝白斑筛选后, 分别随机挑取1瓶阳性菌液进行菌液PCR鉴定, 结果可见3种不同大小的目的片段 (见图2) 。
M.DL-2 000 Marker;1.cbMSTN-1;2.cbMSTN-2;3.cbMSTN-3。
2.3 MSTN cDNA的重组质粒双酶切鉴定
BamHⅠ与XhoⅠ双酶切pMD-cbMSTN-1、pMD-cbMSTN-2和pMD-cbMSTN-3 重组质粒, 电泳结果可见1 100 bp、1 000 bp及750 bp预期片段 (见图3) , 表明3种目的基因均已成功克隆入pMDl8-T载体。将PCR鉴定和双酶切鉴定均为阳性的克隆分别命名为pMD-cbMSTN-1、pMD-cbMSTN-2和pMD-cbMSTN-3。
M1.DL-2 000 Marker;1.pMD-cbMSTN-1;2.pMD-cbMSTN-2;3.pMD-cbMSTN-3。
2.4 乌鸡MSTN cDNA序列测定结果
将pMD-cbMSTN-1、pMD-cbMSTN-2和pMD-cbMSTN-3质粒送交北京华大基因公司进行测序。测定序列包括载体上的上、下游通用引物和保护碱基、酶切位点及MSTN cDNA全部序列, 测序结果见图4。
注:...表示缺失序列。
序列测定结果表明:乌鸡中存在3种不同大小的MSTN基因转录子。cbMSTN-1由1 128 bp组成, cbMSTN-2由985 bp组成, cbMSTN-3由754 bp组成。cbMSTN-2与cbMSTN-1相比, 缺失了374～517 bp处的143 bp碱基;cbMSTN-3与cbMSTN-1相比, 缺失了374～748 bp处的374 bp碱基;cbMSTN-3与cbMSTN-2相比, 缺失了374～748 bp处的231 bp碱基。
通过序列比对可知, cbMSTN-2与cbMSTN-1、cbMSTN-3与cbMSTN-1、cbMSTN-2与cbMSTN-3的同源性均为99%, 分别有4, 6, 4个碱基不同。
2.5 氨基酸预测分析
将测定的乌鸡MSTN cDNA序列与李新华等[9]报道的寿光鸡MSTN cDNA序列进行比较, 并进行编码氨基酸预测, 结果发现:cbMSTN-1与csMSTN-1的同源性为99.38%, 存在7个不同的碱基, 翻译出4个不同的氨基酸 (见表1) ;而cbMSTN-2与csMSTN-2的同源性为99.49%, 存在5个不同的碱基, 翻译出2个不同的氨基酸 (见表2) ;cbMSTN-3与csMSTN-3的同源性为96.42%, 存在27个不同的碱基, 翻译出8个不同的氨基酸 (见表3) 。
3 讨论
乌鸡源自于中国的江西省的泰和县武山, 它们不仅喙、眼、脚是乌黑的, 而且皮肤、肌肉、骨头和大部分内脏也都是乌黑的。乌鸡适应性较强, 胆小怕惊, 喜群居, 善走喜动, 且遗传性能稳定。试验通过RT-PCR 扩增、克隆和测序发现乌鸡的肌肉中至少存在3种MSTN基因转录子。将本试验结果与李新华等[9]报道的寿光鸡中的MSTN转录子相比较发现, csMSTN-1和cbMSTN-1的同源性为99.38%, 有7个碱基不同;csMSTN-2和cbMSTN-2的同源性为99.49%, 有5个碱基不同;csMSTN-3和cbMSTN-3的同源性为96.42%, 有27个碱基不同。从结果上看, MSTN的基因序列具有高度保守性。而csMSTN-3和cbMSTN-3的碱基差异较大, 能翻译出多种不同的蛋白质, 很可能出现不同的生物学特性。李新华等[9]的试验结果表明, 寿光鸡腿肌中的csMSTN-1和csMSTN-2转录子的同源性很高, 只有5个碱基不同, 而csMSTN-1和csMSTN-3、csMSTN-2和csMSTN-3则分别有26个和25个碱基不同, 推断csMSTN-3与csMSTN-1、csMSTN-2是由不同的DNA区段转录生成。本试验结果表明, cbMSTN-1与cbMSTN-2、cbMSTN-1与cbMSTN-3、cbMSTN-2与cbMSTN-3的同源性均为99%, 分别有4, 6, 4个碱基不同。对于3个片段是否是由不同的DNA区段转录生成的, 还需要进一步的试验证明。研究结果证实, 家禽1 128 bp的MSTN转录子能表达出43 ku蛋白, 而985 bp和754 bp的MSTN转录子是否都能表达并发挥作用, 还需要进一步证明。它们的作用及具体功能还需要人们来探索。
摘要：以3周龄乌鸡腿肌为试验材料, 提取RNA进行RT-PCR反应、TA克隆和测序, 并进行序列测定。结果表明:乌鸡腿肌中存在3种不同的MSTN基因转录子, 分别将其命名为cbMSTN-1、cbMSTN-2和cbMSTN-3;cbMSTN-1由1128bp组成, cbMSTN-2由985bp组成, cbMSTN-3由754bp组成;cbMSTN-2与cbMSTN-1相比缺失了374～517bp处的143bp碱基, cbMSTN-3与cbMSTN-1相比缺失了374～748bp处的374bp碱基;cbMSTN-2、cbMSTN-3与cbMSTN-1的同源性均为99%。
关键词：MSTN基因,乌鸡,克隆,序列分析
参考文献
[1]McPHERRON A C, LAWLER A M, LEE S J.Regulation of skele-tal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member[J].Nature, 1997, 387 (6628) :83-90.
[2]GROBETL, MARTIN L J, PONCELETD.A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J].Nat Genet, 1997, 17 (1) :71-74.
[3]ROBERTS S B, GOETZ F W.Differential skeletal muscle expression of myostatin across teleost species, and the isolation of multiple myo-statin isoforms[J].FEBS Lett, 2001, 491 (3) :212-216.
[4]OOSTBYE T K, GALLOWAY T, NIELSEN C.The two myostatin genes of Atlantic salmon (Salmo salar) are expressed in a variety of tissues[J].Eur J Biochem, 2001, 268 (20) :5249-5257.
[5]RESCAN P Y, JUTEL I.Two myostatin genes are differentially ex-pressed in myotomal muscles of the trout (Oncorhynchus mykiss) [J].J Exp Biol, 2001, 204 (20) :3523-3529.
[6]BIGA P R, HARDY R W, SCHELLING G T.Growth hormone dif-ferentially regulates muscle myostatin1and2and increases circulat-ing cortisol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J].Gen Comp Endocrinol, 2004, 138 (1) :32-41.
[7]KERR T, ROALSON E H, RODGERS B D.Phylogenetic analysis of the myostatin gene sub-family and the differential expression of a novel member in zebrafish[J].Evol Dev, 2005, 7 (5) :390-400.
[8]GARIKIPATI D K, GAHR S A, ROALSON E H.Characterization of rainbowtrout myostatin-2genes (rtMSTN-2a and-2b) :genom-ic organization, differential expression, and pseudogenization[J].Endocrinology, 2007, 148 (5) :2106-2115.
基因测序的高调应用 篇4
安吉丽娜·朱莉切除双侧乳腺之后，引发了普通人对基因测序的关注。基因测序及分析业务市场相比10年前，有了更合适的土壤。
遗传病研究人员对DNA测序都不会陌生，但当人均基因组测序费用降到1500美元时，会有越来越多人来尝试。而这需要更多机器设备和研究员来对大量测序结果的数据进行分析，寻找突变位点。如果研究中心对于海量数据分析的压力难以承受，他们可选择将这部分业务外包出去，流程如下：把客户的测序数据上传到云端，同时还可以通过这套云计算系统与远在另一个国家的医生同行进行及时交流，而这一切操作都不需要再像以往那样因网速问题而惴惴不安。
越来越多生物信息咨询公司借助网络技术开展这项业务。除了医生还有大量制药企业和生物技术公司依赖测序技术，并需要在获得测序数据之后进行解析。测序行业巨头Illumina也在去年发布了一款名为BaseSpace的APP应用，客户可以将数据上传到其云计算平台上，然后从这款APP上挑选适合的分析工具对这些数据进行分析。Oracle也开发了一款产品，帮助临床医生和科研人员对测序数据进行分析。
事实上，10年前生物信息学家们就开始了第一拨创业热潮，但当时发现致病的遗传位点离开发出可以治疗疾病的药物还有很大距离。测序和分析业务，并没有像今天那样有了相对明确的临床意义。
克隆测序 篇5
1 材料
7～8 周龄、体重为30～35 g的成年雄性昆明白小鼠5只[质量合格证号为scxk(吉)2007-0003],吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供,用颈椎脱臼法处死后取睾丸放入液氮,而后移入-70 ℃冰箱保存,备用。
大肠杆菌DH5α株,吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程重点实验室保存。
克隆载体pMD18-T、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、反转录酶(AMV)、RNase、Olig-dT18、RNase抑制剂,均购自TaKaRa公司; DL-50 bp DNA Marker、质粒提取试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒,均购自北京Tiangen公司;Trizol试剂,购自Invitrogen公司;焦磷酸二乙酯(DEPC)、琼脂糖,均购自Sigma公司;其他常用试剂,购自长春宝泰克公司。
2 方法
2.1 引物设计
根据GenBank发表的Ets1、Ets2的全序列设计并合成2对特异性引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。Ets1的上、下游引物分别为5′-ACAGCTTTGTTGTCCATCTG-3′,5′-CAGGAAGGATGGACAGATCT-3′,扩增片段大小为166 bp;Ets2的上、下游引物分别为5′-CAGAGGCCTAATCCTCAGTC-3′,5′-GAAGGTTTTGTAATTTGGCC-3′,扩增片段大小为172 bp。
2.2 睾丸组织总RNA的提取
参照试剂盒说明和参考文献[4,5],采用Trizol一步法提取睾丸组织总RNA。取5 μL RNA用1%甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳检测,判断其完整性。
2.3 RT-PCR
反转录:将睾丸组织总RNA 4 μL、Oligo-dT18(10 pmol/μL)1 μL、无核酸酶水2 μL依次加入0.5 mL Eppendorf管内,混合均匀,70 ℃水浴5 min;立即放到冰上,静置5 min;在冰上操作,向Eppendorf管中依次加入无核酸酶水4.5 μL、AMV 5×RT反应缓冲液4 μL、dNTP 混合物(10 mmol/L) 2 μL、核酸酶抑制剂(20 U)0.5 μL、AMV 2 μL,使总体积为20 μL。反应程序:42 ℃水浴1 h,90 ℃水浴5 min, 0 ℃水浴5 min。
PCR反应体系(25 μL):10×PCR Buffer (含Mg2+) 2.5 μL,双蒸水17.5 μL,Ex Taq (5 U/μL) 0.5 μL,反转录后的cDNA模板1.5 μL,上、下游引物 (25 pmol/μL) 各 0.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.0 μL。
PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,94 ℃退火30 s(Ets1、Ets2的退火温度分别为53.5℃、50 ℃),72 ℃延伸1 min,72 ℃扩增10 min,共35个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,在紫外灯下观察结果并拍照。采用DNA片段凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
2.4 克隆载体的构建及测序
将回收的PCR产物分别与pMD18-T 载体于4 ℃连接过夜,构建重组克隆质粒pMD-Ets1、pMD-Ets2,反应体系均为PCR回收纯化产物7.5 μL,10×Ligase Buffer 1 μL,pMD18-T载体0.5 μL,T4 DNA Ligase 1 μL。经重组质粒转化、阳性克隆筛选、重组质粒提取、PCR鉴定后,将正确的阳性菌液制成甘油菌,送北京英俊生物技术有限公司进行核酸序列测定。用DNAStar、DNAMan软件分析测序结果。
3 结果与分析
3.1 睾丸组织总RNA的提取
凝胶电泳后在紫外灯下观察,可以见到2条清晰的电泳条带,分别为28 S和18 S,说明RNA提取成功(见图1)。
1,2.小鼠睾丸组织总RNA。
3.2 Ets1、Ets2的PCR扩增
RT-PCR扩增后,Ets1、Ets2的扩增产物见图2,与预期目的条带大小相符,说明扩增成功。
1.50 bp DNA Marker;2.Ets2; 3.Ets1。
3.3 Ets1、Ets2序列的测定
测序结果显示,获得的Ets1、Ets2 cDNA完全正确(见图3、图4)。表明试验正确克隆了Ets1、Ets2基因,与预期结果相符。
4 讨论与小结
Trizol一步法提取RNA避免了传统提取方法的繁琐过程和质量不理想等问题。为了获得质量较高的RNA,在提取过程中应注意以下几点:所有用具均经过RNA酶强抑制剂DEPC过夜处理,玻璃器皿于180 ℃干烤8 h以上,提取前于无菌操作间紫外照射2 h以上;在操作中经常更换手套,防止皮肤上带有的RNA酶降解组织中的RNA;此外,还要注意内源性RNA酶所造成的RNA降解;处死小鼠后应迅速取出睾丸并立即放入液氮,为了保证RNA的提取率,同时也有利于下一步的RNA纯化,取材量要大;加入Trizol试剂后的反应时间适当延长,从而保证组织充分裂解;加大氯仿用量和延长反应时间,离心后只取上清液,这样从睾丸组织中提取的总RNA回收率很高,质量也较为理想。有了高质量的总RNA,采用常规RT-PCR程序即可获得目的基因的cDNA,从电泳结果及序列分析结果来看,2个分子的片段大小及核酸序列与预期完全一致。本试验结果为下一步利用荧光定量PCR、原位杂交等方法深入分析其表达量及准确部位,以及揭示其与睾丸发育、精子发生等的关系奠定了基础。
摘要：为了研究转录因子Ets1、Ets2在睾丸组织中有无表达,试验采用Trizol法提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA,RT-PCR反应后进行序列测定。结果表明:转录因子Ets1、Ets2在正常小鼠睾丸组织中均有表达。
关键词：Ets转录因子,睾丸,小鼠
参考文献
[1]CHEN C,OUYANG W,GRIGURA V,et al.ERM is required fortranscriptional control of the spermatogonial stem cell niche[J].Nature,2005,436:1030-1034.
[2]SCHLESSER H N,SIMON L,HOFMANN M C,et al.Effects ofPEA3(ets variant gene 5)on testis and body growth,time course ofspermatogonial stem cell loss,and fertility in mice[J].Biol Re-prod,2008,78:483-489.
[3]GUTIERREZ-HARTMANN A,DUVAL D L,BRADFORD A P.Ets transcription factors in endocrine systems[J].Trends Endocri-nol Metab,2007,18(4):150-158.
[4]奥斯伯F,布伦特R,金斯顿R E,等.精编分子生物学实验指南[M].严子颖,王海林,译.北京:科学出版社,1998.
克隆测序 篇6
DDAH(EC 3.5.3.18)是一种胞浆蛋白酶,包括DDAH1和DDAH2两种亚型,主要水解代谢一氧化氮合酶(NOS)抑制物———非对称性二甲精氨酸(AD-MA),在机体内NOS催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和一氧化氮(NO),是催化生成NO最主要的酶。C.T.Tran等[9]在培养的内皮细胞中发现,增加DDAH抑制剂会导致ADMA的积累,抑制了NOS的活性,从而减少了NO的生成,这表明DDAH的活性或表达量对于NO的生成起着重要的调控作用。有研究显示,低浓度的NO可促进小鼠睾酮分泌[10],但过量的NO对精子有毒害作用,影响精子活力和活率,增加不活动精子数量,且精子受毒害程度与NO浓度成正比[11]。NOS和NO参与了睾酮的分泌,在精子生成、受精及精子脂质过氧化反应等过程中起着重要调节作用,因此,DDAH对于NO所参与的睾酮分泌的调控最终对于雄性生殖产生深远影响,可能是导致犏牛雄性不育的原因之一。本研究通过基因克隆的方法获得了牦牛DDAH1及DDAH2基因的完整编码区序列,并比较了牦牛与普通牛的基因序列及氨基酸序列,同时利用实时荧光定量PCR方法分析了DDAH1和DDAH2基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的mRNA水平,以探索其在表达水平上与犏牛雄性不育的关联。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
试验用成年牦牛(n=9)及犏牛(n=7)睾丸组织于秋季采自四川成都市青白江区屠宰场,采集后立即放入液氮速冻后带回实验室。所有样品均置于-80℃保存,待用。
1.2 DDAH1和DDAH2基因的克隆测序
利用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)按照其产品操作说明从睾丸组织中提取总RNA。采用Revert AidTMFirst Strand c DNA Synthesis Kit(购自Thermo公司)以牦牛总RNA为模板、Oligo(d T)18为反转录引物进行反转录获得c DNA第一链。根据已公布普通牛的DDAH核酸序列(Gen Bank登录号见表1),用Primer Premier 5.0软件在序列的CDS区两侧设计PCR特异引物(见表1)。以c DNA为PCR模板,扩增程序为:95℃预变性4 min;95℃变性30 s,引物退火30 s(温度见表1),72℃延伸90 s,共35个循环;72℃延伸8 min。预期能分别扩增出包含DDAH1和DDAH2基因CDS区在内长为959 bp和1 091 bp的2个基因片段。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。RT-PCR产物经纯化后依次连接到p MD19-T载体(购自Ta KaRa公司)并转化至DH5α宿主中进行克隆。抗氨苄重组筛选后挑选出20个阳性单克隆进行扩大培养,经菌液PCR鉴定后利用载体通用引物M13F及M13R进行双向测序,序列信息使用Bank It工具提交至Gen Bank。
1.3 牦牛DDAH1及DDAH2基因生物信息学分析
将所测序列在NCBI数据库中使用BLAST工具与野牦牛(Bos mutus)及普通牛序列进行同源性比对,并在该数据库中比对其编码的氨基酸序列。使用蛋白质性质在线分析软件Prot Param(http://web.expasy.org/protparam/)对DDAH1和DDAH2基因编码的氨基酸序列基本性质进行预测。
1.4 牦牛及犏牛睾丸中DDAH1和DDAH2基因丰度的检测
采用实时荧光定量PCR方法对牦牛及犏牛睾丸组织中的DDAH1与DDAH2基因mRNA表达水平进行检测。根据克隆测序后的c DNA序列以及普通牛内参基因Gapdh、18S RNA序列信息,借助Primer Premier 5.0软件分别设计定量PCR特异引物(见表1)。
提取的总RNA经质检合格后,取4μg利用上述试剂盒自带的随机六聚体引物R6进行反转录合成c DNA作为定量模板。PCR反应体系(25μL):Quanti FastTMSYBRGreen PCR Master mix(QIAGEN公司)12.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,dd H2O9.5μL。PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性15 s,引物退火20 s(温度见表1),72℃延伸15 s,共40个循环。定量PCR检测分为牦牛组和犏牛组,组内每个样品同时检测目的基因和2个内参基因,每个基因设3个平行重复。
1.5 数据的统计与分析
每个样品的检测结果利用2个内参基因Ct值的几何平均数对目的基因进行校正。牦牛和犏牛组间相对表达水平使用2-△△Ct法[12]进行计算;数据用“平均值±标准差”表示,用SPSS18.0软件对两组数据进行独立样本t检验分析,P<0.05作为差异显著标准。
2 结果
2.1 牦牛DDAH1和DDAH2基因的克隆测序结果
对牦牛睾丸组织中DDAH1和DDAH2基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,获得特异的与预期大小相一致的DNA片段(见图1)。
克隆测序结果表明,两片段长度分别为959 bp以及1 091 bp,均包含长858 bp的完整CDS区,与普通牛DDAH序列比对证实片段为牦牛DDAH基因序列。
1.DDAH1基因PCR产物;M.DL-2 000 Marker;2.DDAH2基因PCR产物。
2.2 牦牛DDAH1及DDAH2基因的序列特征
见图2。
注:括号外数字表示核苷酸数目,括号内数字表示相应推导的氨基酸数目;*表示野牦牛或普通牛DDAH基因碱基序列与牦牛序列一致。
克隆所获牦牛DDAH1基因(Gen Bank登录号为KT223011)序列长度为959 bp。该序列与预测野牦牛序列(XM_005888439)相似性为100%;与普通牛序列(NM_001102201)相似性为99.58%,存在4个碱基差异,且差异碱基均位于CDS区内,在CDS区的第333,375,390,777位碱基牦牛依次为C、C、C、T,普通牛依次为A、T、T、C。根据牦牛DDAH1基因测序结果推导的氨基酸序列共包含285个氨基酸,该序列与野牦牛氨基酸序列完全相同,与普通牛存在一个氨基酸差异,即第111位氨基酸在牦牛序列中为Asn,普通牛为Lys(见图2A)。
克隆牦牛DDAH2基因(KT223012)序列总长度为1 091 bp,其与预测野牦牛的序列(XM_005904203)相似性为99.63%,有4个碱基存在差异,其中1个差异碱基位于CDS区;与普通牛(NM_001034704)序列相似性为99.91%,存在1个碱基差异,该差异碱基就位于CDS区。位于CDS区的差异碱基皆在CDS区的第8位,在牦牛序列中为A,野牦牛和普通牛中为C。牦牛DDAH2基因推导的氨基酸序列由285个氨基酸组成,其与野牦牛及普通牛氨基酸序列存在一个氨基酸差异,牦牛的第3位氨基酸为Lys,而野牦牛及普通牛皆为Thr(见图2B)。
Prot Param工具预测结果表明:牦牛DDAH1基因编码的氨基酸序列分子质量为31.27 ku,预测等电点(p I)为5.54;普通牛分子质量为31.28 ku,预测p I为5.67,由于第111位氨基酸差异导致了二者p I的较大差异。牦牛DDAH2基因推导的氨基酸序列预测分子质量为29.80 ku,预测p I为5.82;野牦牛与普通牛预测分子质量为29.78 ku,预测p I为5.66,牦牛与野牦牛及普通牛的第3位Lys与Thr的差异导致了p I的明显差异。
2.3 牦牛和犏牛睾丸中DDAH1和DDAH2基因mRNA表达水平
根据克隆获得DDAH1及DDAH2序列及内参基因信息设计特异定量引物(见表1),定量PCR扩增获得的熔解曲线峰形单一,扩增特异性好;所建立的所有基因标准曲线扩增效率均符合相应算法要求。定量PCR结果表明:DDAH1和DDAH2基因在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达,DDAH1基因在犏牛睾丸组织中的表达量显著高于牦牛(P<0.05),是牦牛睾丸表达量的1.5倍(见图3 A);DDAH2基因在犏牛睾丸组织中的表达量与牦牛接近(见图3 B)。
注:*表示与牦牛相比差异显著(P<0.05),未标*表示差异不显著(P>0.05)。
3 讨论
研究通过基因克隆方法成功获得了牦牛睾丸组织DDAH1和DDAH2基因的c DNA序列。牦牛DDAH1基因c DNA序列与野牦牛序列完全相同,表明在野牦牛的驯化进程中该基因具有高度的保守性。牦牛DDAH1基因与普通牛存在4个碱基差异且均位于CDS区内,但其中3个碱基差异并未引起氨基酸的变化,推测牛种间这种“同义突变”可能是调节蛋白质翻译效率以及稳定性的需要[13];另一个碱基的差异导致了氨基酸的变化,从D.Frey等[14]对牛DDAH1基因的研究结果表明,该差异氨基酸并不位于DDAH1酶的活性口袋也不在催化活性中心,因此牦牛与普通牛DDAH1基因在功能上的差异可能不大,但Asn与Lys的电荷差异是否会引起蛋白酶空间结构的变化从而导致功能的差异尚待进一步研究。牦牛DDAH2基因c DNA序列与普通牛相差1个碱基,该碱基差异导致了DDAH2基因一个氨基酸的改变,但二者蛋白质的分子质量及p I的差异并不明显,是否蛋白酶的功能有所差异尚需研究;与野牦牛相差的4个碱基中的3个位于CDS区以外,这些碱基差异或许与mRNA的稳定性以及转录后编辑过程有关[15]。
