关键词：
青霉素浓度（精选八篇）
青霉素浓度 篇1
关键词：香葱,赤霉素,对比试验
香葱为百合科多年生簇生草本, 鳞茎外包鳞膜;叶基生, 线形, 中空, 绿色;花茎由叶丛中抽出, 头状花序顶生, 花多数;蒴果近圆形, 细小;花期6月。香葱原产于亚洲中部, 我国各地均有栽培。全株特别是鳞茎含有挥发成分, 主要为巴豆醛和多种硫化物;主要食用其鳞茎或全株, 味辛, 性温, 可作调味和装饰菜, 有助消化、解热、通便的作用。
赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素, 在打破休眠和促进植物生长方面有许多报道, 但在葱类植物生长的研究还未见报道, 仅限于对种子出芽率影响的研究。近几年, 香葱在我国北方地区已开始保护地栽培, 供应冬春季节的蔬菜淡季市场, 经济效益较高。为了更好促进香葱生长, 本人尝试在香葱栽培上应用赤霉素处理, 旨在研究不同浓度的赤霉素对香葱生长的影响, 从而判断赤霉素在香葱栽培上的应用效果, 为生产提供实践依据。
一、材料与方法
1. 试验材料
市售优质香葱种苗、赤霉素;辽宁农业职业技术学院日光温室。
2. 试验方法
(1) 处理方法。选择健壮无病虫害植株栽植, 待定植恢复生长后, 选择四畦长势相同的植株, 并分别标记一、二、三、四区, 选择晴朗无风的上午, 用消过毒的剪刀将地上部2厘米以上的部分剪掉。第二天, 待伤口愈合后进行不同浓度的赤霉素处理 (一次处理) , 均匀喷洒于地上部分, 二、三、四区处理浓度分别为5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升, 一区为空白对照, 以后每隔两天测株高一次, 两周后测其产量。
(2) 指标测定。植株长势测定。植株生长恢复正常, 每个试验区任意选取10株, 每两天测一次株高, 并对其求均值。
(3) 产量测定。两周后, 按照上次茬将地上2厘米以上部分剪下, 分别对不同处理的对象进行测定, 从单株重、横切茎、叶片数、分蘖入手。
二、结果与分析
1. 不同浓度赤霉素处理后生长情况
从表1中可以看出, 未处理前空白组长势最旺盛, 用赤霉素处理后, 二、三、四区植株长势明显强于未处理的空白组一区。由此说明, 赤霉素对香葱的生长具有促进作用, 而且促进长势比较稳定均一。从表1分析可以看出, 当赤霉素浓度为5毫克/升时, 该组长势最为突出。
2. 各区平均株产量比较
从表2可以看出, 赤霉素对其促进作用明显, 从单产量看, 均高出3克左右;从平均横切茎来看, 赤霉素处理过的细于未处理的, 随浓度的升高愈加细弱;就叶数和分蘖来看, 赤霉素对其影响作用不明显。
三、结果与讨论
1. 上述试验表明, 赤霉素对香葱的生长具有促进作用, 浓度为5毫克/升时促进作用最为明显, 高浓度赤霉素还可使植株变得细弱, 随浓度的增高植株愈加细弱, 易倒伏。
2. 上述试验表明, 赤霉素对香葱的分蘖情况并无明显影响, 对植株叶片数叶没有明显作用, 香葱的分蘖数反映了香葱的品质以及栽培管理的水平, 原因尚不明确, 今后还有待于进一步试验和研究。
3. 在越冬栽培期间, 由于苗期在温度管理上有疏忽, 导致先期抽薹, 经济效益下降。栽培技术等方面的限制, 导致分蘖数较少, 产量下降。本实验的不足之处, 栽培基质的物理性质对香葱的影响未做出相应的试验, 有待以后研究。
参考文献
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烟草潮霉素抗性浓度的筛选与研究 篇2
烟草潮霉素抗性浓度的筛选与研究
潮霉素是植物基因工程研究中使用较为广泛的转化体筛选抗生素,本文对烟草种子萌发及叶片外植体组织再生进行潮霉素抗性浓度筛选与研究.实验结果表明,培养基是否添加潮霉素及潮霉素浓度的大小对烟草的种子萌发率没有影响,但对种苗发育和烟草叶片组织的分化具有明显的`抑制作用.烟草K326种苗的筛选浓度极限为20mg/L,而其叶片直接诱导分化再生苗的潮霉素筛选浓度最高也可达20mg/L.
作 者：王哲 孙敬克 王世翔 肖婧婧 WANG Zhe SUN Jing-ke WANG Shi-xiang XIAO Jing-jing 作者单位：河南城建学院,河南,平顶山,467044 刊 名：河南城建学院学报 英文刊名：JOURNAL OF PINGDINGSHAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 年，卷(期)： 18(4) 分类号：Q78 关键词：烟草 潮霉素 抗性浓度青霉素浓度 篇3
一、材料和方法
1. 材料
(1) 测定品种太和红油香椿3年生苗木, 平均苗高1.1～1.3m, 茎粗约2.0cm左右, 密度为30cm×30cm。
(2) 供试试剂上海溶剂厂生产的4%赤霉素乳液。
2. 方法
试验在露地生产条件下进行, 2011年3～4月浇解冻水和催芽水, 随水施入磷酸二铵10kg、尿素15kg, 并在5月中旬追施同量的尿素和磷酸二铵。试验时间为2011年3月下旬至6月中旬, 共设4个处理:即赤霉素50、100、150、200mg/L, 以清水作为对照, 每个处理重复3次, 试验期间共喷施两次。
3. 指标的测定
每处理随机选定10株作为观测对象, 进行各项指标的测定。单芽重、单株产量及单位面积产量采用天平进行称重;粗蛋白含量测定采用中华人民共和国ISO 5983-1979《动物饲料———氮含量的测定和粗蛋白含量》计;粗脂肪含量采用《饲料中粗脂肪测定方法》进行测定;粗纤维含量采用《饲料中粗纤维测定方法》 (高温消煮法) 测定。
二、结果与分析
1. 不同浓度赤霉素对香椿根蘖芽产量的影响
试验结果表明, 除50mg/L赤霉素处理与对照差异不显著, 其余各处理根蘖芽产量均比对照明显增产, 说明适当浓度赤霉素处理对根蘖芽产量有明显提高作用。赤霉素100mg/L处理增产效果最为明显, 其生长势旺盛、芽茎粗、叶片大、节间长, 平均单芽重、单株产量、单位面积产量均达到了最大值, 分别为8.62g、12.35g、563.68g/m2, 比对照分别增加了46.6%、49.33%和53.21%。但随着赤霉素浓度的提高, 各指标出现了下降的趋势, 说明用赤霉素处理时, 选择适合的浓度很关键。
2. 不同浓度赤霉素对香椿根蘖芽品质的影响
(1) 不同赤霉素对椿芽粗蛋白的影响试验结果表明, 不同浓度赤霉素对椿芽粗蛋白含量有明显影响, 各浓度均与对照有显著差异, 使粗蛋白含量大幅下降, 其中100 mg/L赤霉素处理粗蛋白含量到达了最低值59.98 g/kg, 比对照下降了33.81%。但是随着赤霉素浓度的提高, 粗蛋白含量有上升的趋势。
(2) 不同赤霉素对椿芽粗脂肪的影响除50mg/L赤霉素处理与对照没有显著差异外, 其他浓度均与对照有显著差异, 其中100mg/L赤霉素处理粗脂肪的含量达到了最低值16.34g/kg, 比对照下降了34.53%。但是随着赤霉素浓度的提高, 粗脂肪出现了上升的趋势。
(3) 不同赤霉素对椿芽粗纤维的影响研究表明, 不同浓度赤霉素处理与对照均有显著差异, 说明赤霉素对椿芽粗纤维含量有明显影响。其中100mg/L赤霉素处理粗纤维含量最低, 达到了21.54g/kg, 比对照下降了39.64%。但是随着赤霉素浓度的提高, 粗纤维含量有上升的趋势。
三、结论与讨论
1. 不同浓度赤霉素对香椿产量有明显影响
其中赤霉素100mg/L处理增产效果最为明显, 平均单芽重、单株产量、单位面积产量均达到了最大值, 分别为8.62g、12.35g、563.68g/m2, 比对照分别增加了46.6%、49.33%和53.21%。主要原因在于赤霉素对香椿的椿芽和根蘖芽生长有促进作用, 其机理在于赤霉素能促进细胞分裂和伸长, 增加细胞壁的伸展性。因此椿芽生长粗壮、速度快、叶片大、复叶数多, 能显著增加单芽重量, 从而显著提高单株产量, 同时使椿芽从萌芽到采收时间缩短, 可以提早采收, 提高经济效益。
2. 不同浓度赤霉素对香椿品质有显著影响
其中赤霉素100mg/L在各处理中对品质影响最显著, 粗蛋白、粗脂肪及粗纤维均达到了最低值, 分别为59.98g/kg, 16.34g/kg, 21.54g/kg, 比对照分别下降了33.81%、34.53%及39.64%。主要原因在于赤霉素能够促进细胞伸长, 在增加香椿产量的同时, 使得香椿根蘖芽含水量比对照大幅度提高, 在降低了椿芽纤维含量的同时, 使得蛋白质和脂肪含量大幅下降。
青霉素浓度 篇4
苦荞是一种优良的黄酮类化合物。据文献报道, 荞麦子叶中的总黄酮含量高达6.16%[4], 黄酮具有很强的抗氧化性和清除自由基功能[5], 还是生产芦丁的重要原料[6]。其药理和化学成分研究表明:荞麦中的类黄酮物质芦丁对高血压、糖尿病、心血管疾病等具有良好的治疗效果[7]。
荞麦生理生化和分子生物学上已有一定的研究并取得成功, 主要技术是杂交、多倍体和诱变育种[8]。近年来, 对荞麦主要致力于它的化学组成[9], 关于荞麦组织培养的研究报道较少。
卡那霉素是氨基糖苷类抗生素[10], 转基因试验中, 常作为区分转基因植物细胞与非转基因植物细胞的标记[11]。它作为一个广泛使用的选择剂, 在对于转化研究、提高作物产量、拓展药源微生物菌株资源, 以及在选育环境治理优良菌株等领域也具有巨大的潜在应用前景[12]。
本试验目的是获得九江苦荞的再生体系, 并且筛选出能够促使荞麦愈伤组织芽分化的最低卡那霉素浓度, 为农杆菌介导和遗传转化提供参考。
1 材料和方法
1.1 外植体材料
挑选由山西省农科院研究所提供的九江苦荞种子, 选取籽粒饱满的成熟种子, 用75%酒精处理1 min, 漂洗4～5次, 再用0.1%升汞处理8 min, 漂洗4～5次, 将灭菌后的种子接种到附加3%蔗糖、0.75%琼脂粉无激素的MS培养基中, 在温度25℃, 日照时数12h条件下培养4～5天, 获得无菌苗。选取无菌苗的下胚轴作为外植体试验材料。
1.2 试验用培养基
基本培养基为MS培养基。
1.3 试验试剂
卡那霉素浓度的筛选中, 选用的剂量分别为0 mg/L、15mg/L、25 mg/L、35 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。
1.4 方法
九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导, 分别取生长5～15d的九江苦荞无菌苗的下胚轴在75%的乙醇中浸泡1 min, 蒸馏水漂洗4～5次, 0.1%升汞溶液消毒8min, 蒸馏水漂洗4～5次, 无菌环境中将下胚轴切为约0.5 cm×0.5 cm的切块, 接种于不同激素配比的MS培养基上 (表1) , 温度25℃, 湿度75%的条件下暗培养1周并观察记录愈伤情况。诱导出的愈伤组织分别接种于已经设置好的不同培养基中 (表2) , 培养在相同环境中, 并观察记录分化情况。
1.5 数据分析
试验数据在Excel2003软件中进行初步的录入和处理, 计算平均值和标准差, 并进一步生成图表。处理间 (不同激素配比) 的差异显著性在SPSS 15.0软件中采用单因素方差分析 (ANOVA) 进行分析, 统计显著性P=0.05。
2 结果与分析
2.1 九江苦荞下胚轴再生体系的建立
2.1.1 激素配比对九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导。
愈伤组织诱导过程 (激素配比见表1) , 暗培养1周后再转至光下, 2周后形成完整的愈伤组织, 随着2, 4-D浓度升高而明显膨大, 颜色多为红色和黄绿色, 当浓度为4 mg/L时整个愈伤组织变为水渍状, 随着浓度升高而褐变 (表3) 。
由表3可知:九江苦荞下胚轴在MS+2, 4-D 3 mg/L+6-BA 0.1 mg/L培养基中, 愈伤组织为绿白色, 致密, 愈伤率为92%, 为最适培养基, 在诱导愈伤组织过程中, 2, 4-D浓度过高, 愈伤组织易发生水渍状, 褐化;浓度过低, 愈伤组织生长缓慢, 不利于分化。
2.1.2 不定芽的分化。
九江苦荞由下胚轴诱导出的愈伤组织, 将其切为0.5 cm×0.5 cm的切块, 接种于不同的培养基中 (激素配比见表2) , 诱导不定芽的产生 (表4) 。通常在培养基中添加细胞分裂素6-BA和生长素IBA等, 可获得再生植株。
表4可知:适当浓度的细胞分裂素和生长素的配比, 可提高芽的分化率, 下胚轴外植体所诱导的愈伤组织均在MS+6-BA 3 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培养基组合上, 分化率最高为26.9%, 但伴有玻璃化现象。
2.2 根的诱导
当苗长到2～3 cm高时, 将2种外植体材料经过愈伤组织的诱导进而分化出的不定芽由MS+6-BA 3 mg/L+IBA 0.1mg/L和MS+6-BA 3 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培养基中转接至无激素添加的MS培养基中, 诱导其生根, 生根率达90.9%。
2.3 卡那霉素浓度的筛选
本试验选用九江苦荞下胚轴所诱导的愈伤组织和不定芽为试验材料, 卡那霉素筛选剂量分别为0 mg/L、15 mg/L、25mg/L、35 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L附加在6-BA 1.5mg/L+IBA 0.3 mg/L的培养基中 (见表5) 。
由表5看出, 随着Km浓度增加, 死亡频率明显增加, 大部分颜色为绿色, 但是分化率很低, 仅为2.21%, 说明外植体对高浓度Km的耐性较低, Km浓度为15 mg/L时, 接种10天左右, 产生愈伤组织, 但是分化频率极低, 不定芽生长良好, Km浓度为25 mg/L时, 接种10天左右, 愈伤组织颜色为白绿色, 生长良好, 分化频率进一步降低。当Km浓度为35 mg/L时, 愈伤组织和不定芽仍然生长良好, 浓度为50 mg/L和75mg/L时, 接种1个月以后, 分化率为0, 不定芽有死亡现象, 浓度达到100 mg/L时, 部分褐化和死亡。所以, Km浓度高于35mg/L时, 抑制了荞麦愈伤组织芽分化和生长。而低浓度的Km (≤25 mg/L) , 有不同程度的芽分化抑制作用。
3 讨论
3.1 愈伤组织诱导
愈伤组织的诱导是应用细胞全能性原理, 通过诱导愈伤组织发生和芽的分化而获得再生植株, 愈伤组织的诱导与培养基、外植体、光照、外源激素等都有一定影响[12]。光照:光暗培养有利于愈伤组织各种蛋白、核酸物质的积累[13]。外源激素:加入过高或者过低的2, 4-D和IBA会生长不良, 水渍状甚至褐化。而本试验中采用2, 4-D和IBA 2种激素获得了良好的诱导效果, 生长素与细胞分裂素的比值决定了有利于根或芽的分化, 比值适中时可维持原组织生长而不分化。
3.2 不定芽诱导
植物组织培养研究表明, 细胞分裂素有利于芽的分化和增殖[14]。芽的分化与激素配比有关。细胞分裂素浓度高时, 利于形成芽, 细胞分裂素浓度低时, 利于形成根。MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5 mg/L诱导出的芽分化率最高, 但是有玻璃化现象, 芽翠绿透明、脆弱, 生长缓慢, 部分失绿。这些与生长调节剂、温湿度、消毒时间、光照等都有重要关系, 降低玻璃化现象的发生: (1) 必须控制在8min, 避免诱导和分化过程中易褐化或者出现玻璃化。 (2) 在培养过程中芽分化时适当降低IBA浓度, 高浓度细胞分裂素有利于促进芽分化, 但也会使玻璃化苗发生的比例提高。 (3) 控制温度和湿度, 温度升至30℃左右, 愈伤组织含水量增加, 也会引起玻璃化的现象。 (4) 光照:加强光照, 延长光照时间[15], 调节激素配比来降低玻璃化现象的发生。
3.3 卡那霉素的筛选
筛选过程中, 卡那霉素浓度增加, 植株受损严重, 不附加卡纳霉素的培养基中, 植株生长正常, 随着卡那霉素浓度升高, 器官会出现停止生长, 褐变甚至死亡现象。结果表明:浓度过低, 不会影响芽分化的形成;浓度过高, 尽管未观察到大量愈伤组织和不定芽死亡, 但严重地抑制了芽的分化和生长。我们将通过农杆菌侵染愈伤组织, 以便进一步挑选适合筛选的卡那霉素浓度。
4 存在的问题
荞麦获得再生植株的频率较低, 且分化率较低[16]。目前荞麦品种极度退化, 严重影响其产量和品质的进一步提高, 所以, 建立荞麦再生体系这一研究具有可行性。培养过程中的一些问题 (如褐化、不定芽增值过程中出现脱叶现象, 玻璃化再生苗) , 是卡那霉素筛选体系不够完善, 针对这些问题还有待于进一步解决和改进。
5 结论
(1) 九江苦荞下胚轴诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2, 4-D 3 mg/L+6-BA 0.1 mg/L, 诱导芽的最佳培养基为MS+6-BA 3 mg/L+IBA 0.5 mg/L。
(2) 荞麦对卡那霉素反应较为敏感, 低于25 mg/L的卡那霉素, 对愈伤组织芽分化和生长有不同程度的抑制作用。卡那霉素的筛选为进一步的遗传转化提供了基础。
摘要：本试验以九江苦荞为研究材料, 下胚轴为外植体, MS为基本培养基, 建立组织培养再生体系。通过添加不同浓度的生长素和细胞分裂素, 设计不同激素配比组合, 相同的培养条件下, 研究九江苦荞下胚轴愈伤组织诱导和分化, 筛选出诱导九江苦荞愈伤组织和芽分化的最适培养基, 为基因工程提供参考。并在不同卡那霉素浓度条件下, 研究对愈伤组织和芽分化生长的影响, 为农杆菌介导转化的研究奠定基础, 为基因工程改良荞麦芦丁生物合成提供了理论依据及技术保证。研究表明:下胚轴诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2, 4-D3mg/L+6-BA0.1mg/L, 芽分化和生长的最适培养基为MS+6-BA3mg/L+IBA0.5mg/L。荞麦对卡那霉素反应较为敏感, 卡那霉素浓度高于25mg/L, 可抑制愈伤组织形成芽。
青霉素浓度 篇5
1 资料与方法
1.1 临床资料
因慢性鼻鼻窦炎、鼻息肉、鼻中隔偏曲术后、鼻外伤术后出现鼻腔粘连等患者102例, 其中男64例, 女38例;年龄8～76岁;发病时间为术后1周～3个月不等。慢性鼻鼻窦炎、鼻息肉46例, 鼻中隔偏曲术后16例, 鼻外伤术后13例, 鼻中隔与下鼻甲粘连12例, 鼻中隔与中鼻甲粘连11例, 中鼻甲与鼻腔外侧壁粘连4例。
1.2 方法
局部表面麻醉采用浸有1%丁卡因加适量0.1%肾上腺素的棉片作麻醉后, 用剥离子或中鼻甲剪分离粘连的肉芽组织。然后随机分别取0.4mg/mL或0.1mg/mL的丝裂霉素C1.5mL, 用棉片浸润后, 置于贴覆创面约5min后取出。用生理盐水冲洗创面10min, 术后患者口服抗生素一周, 生理盐水每日冲洗鼻腔1～2次, 持续1个月;清理鼻腔内血痂和伪膜。嘱患者清淡饮食、预防上呼吸道感染;嘱患者勿挖鼻, 避免用力擤鼻, 忌烟酒, 随访3个月。
有效:治愈:各鼻道通畅, 原粘连创面上皮化正常, 鼻腔黏膜水肿、无炎性反应, 随访3个月无复发;显效:各鼻道通畅, 原粘连创面上皮化正常, 鼻腔黏膜存在充血、水肿等炎症反应。无效:停止鼻腔冲洗及清理后, 连粘复现。
1.3 统计方法
采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析, 采用χ2检验, P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
本组102例中, 治愈67例 (65.7%) , 显效15例 (14.7%) , 无效20例;总有效率80.4%;0.4mg/mL浓度的丝裂霉素C组57例, 有效50例其中42例治愈, 显效8例;无效7例;0.1mg/mL浓度的丝裂霉素C组45例, 有效32例其中25例治愈, 显效7例;无效13例。复诊时, 均未见鼻腔粘膜萎缩、鼻腔干燥、反复鼻腔出血及嗅觉减退等并发症;采用SPSS13.0统计软件包进行χ2检验, P=0.036<0.05, 两组疗效有统计学差异。
3 讨论
鼻腔粘连是鼻科术后常见的并发症, 术腔粘连发生率在术后2周～2个月为40%。粘连发生的原因相当复杂, 与鼻腔狭窄、黏膜过度水肿、肉芽组织过度增生、黏膜上皮功能不良、术后中鼻甲漂移、瘢痕收缩、换药不及时和鼻腔清理不及时等均有关。出现鼻腔粘连后对粘连部位的清理剪除亦是一种损伤, 因创面渗血, 血痂形成, 会引起新一轮的鼻黏膜炎症反应及组织对损伤的修复过程, 易产生新的肉芽组织和粘连, 因此, 单纯行鼻腔粘连分离后再发生粘连的机会的极高。本文102例患者经丝裂霉素C治疗后, 治愈率达到80.4%, 与文献报道相同[6], 但丝裂霉素C的疗效与剂量、浓度关系密切, 浓度过大, 作用时间过长, 可产生严重的并发症, 在鼻腔术后粘连手术中丝裂霉素C的应用还不广泛、严重的并发症报道偏少但丝裂霉素C在眼科手术中应用广泛如在青光眼和翼状胬肉手术中的应用曾出现严重并发症, 胬肉术后出现巩膜坏死、感染、继发性青光眼、白内障、角膜穿孔等;青光眼术后出现的眼内炎、感染和低压性黄斑病变;韩德民提出鼻腔术后粘连手术中大剂量使用丝裂霉素C甚至可造成不可逆转的毒性反应[8];浓度太小可能无效, 与过低浓度丝裂霉素C达不到有效地抑制DNA的合成、抗成纤维细胞增殖作用有关;本文选择了文献报道常用的浓度0.1mg/mL和0.4mg/mL进行比较, 经过统计学分析提示0.4mg mL的丝裂霉素C具有疗效好, 治愈率高等优点, 提示可能是治疗鼻腔术后粘连较为合适的浓度选择。
参考文献
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青霉素浓度 篇6
1 仪器试剂
1.1 仪器
日本岛津高效液湘色谱仪 (LC-2010, 紫外检测器, CLASS-VP工作站) 、XW-80旋涡混合器、Sartorius电子天平、GS-15R高速冷冻离心机、台湾艾柯实验室专用超纯水机等。
1.2 试剂
罗红霉素片 (石家庄制药集团欧意药业有限公司, 批号20071209规格0.1g) 、罗红霉素对照品 (中国生物制品检定所, 批号20060615) 、甲醇 (色谱纯) 、超纯水、其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱分析条件
日本岛津高效液湘色谱仪 (LC-2010, 紫外检测器, CLASS-VP工作站) , Diamonsil C18柱 (5μm, 4.6mm×150mm, 迪马公司) , 流动相:流动相为甲醇∶水=80∶20 (v/v) , 流速1.0ml/min, 检测波长254nm, 柱温30℃, 此色谱条件下测定罗红霉素的保留时间为3.5min (见图1) 。
2.2 罗红霉素标准液的配制
精密称取罗红霉素对照品50mg, 置50ml容量瓶中, 先加少量的流动相使其溶解, 然后再加流动相至刻度, 即得1mg/ml的标准储备液;再取该标准储备液1ml置100ml容量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 得10mg/L标准工作液备用[2]。
2.3 样品的预处理
取血清1ml, 加入0.1mol/LNa OH, 混匀, 再加乙酸乙酯的混合提取液4ml, 置旋涡振荡器上振荡提取2min, 4000r/min离心5min, 定量取出有机相3ml, 置40℃N2吹干有机相, 用100μl流动相定容待测。
2.4 血清标准曲线的绘制
取6支10ml玻璃尖底刻度离心管, 分别加入罗红霉素标准工作液, 浓度分别是100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000ng/ml各100μl, 分别加空白血浆900μl, 混匀, 即得制备血样, 照样品预处理项下方法操作, 20μl注入色谱仪分析。记录峰面积, 以峰面积外标法定量, 浓度 (c对峰面积 (S) 进行线性回归, 线性关系良好, 线性范围20~5000ng/ml, 回归方y=110.63x+256.47, r=0.9996, 最低检测浓度20ng/ml。
2.5 回收率及精密度测定
制备20, 200, 3000ng/ml罗红霉素血样, 每一浓度做平行管3份, 照样品预处理项下操作测定, 每份样品同日内进样5次, 1周内测定4次 (d1, 2, 3, 7) 。其平均回收率为97.36%, 各浓度的日内、日间RSD, 结果见表1。
2.6 样品测定
罗红霉素片1g口服, 连续使用2~5d, 于次日给药前抽取静脉血, 4000r/min离心, 分离血清1~2ml, 照样品预处理项下测定, 用回归方程计算血药浓度。其血清药物浓度在20~5000ng/ml之间, 在所做血清线性范围内。
3 讨论
罗红霉素吸收好, 血药浓度高, 作用时间长, 且味不苦, 适合于儿童用药。适用于敏感葡萄球菌、各组溶血性链球菌、肺炎链球菌等。罗红霉素物理性质与红霉素相似, 且结构中无共轭体系紫外吸收较弱, 特别是在测定低血药浓时, 可考虑加已知浓度的标样, 增加血中浓度, 尽量使结合型的罗红霉素游离出来, 再行测定。
用本方法测定了临床使用罗红霉素患者的血药浓度, 其浓度范围符合本法所控制的线性范围。目前的血药浓度测定方法处理较为繁琐, 杂质、杂峰较多, 优化后方法简单, 易于操作掌握, 可供广大基层医院及相关机构对该药的血药浓度测定。本法也为今后的研究提供了一种可靠的体内分析方法。
摘要：目的:优化罗红霉素血药浓度的测定方法。方法:采用RP-HPLC紫外检测法, ODSC18柱, 流动相为:流动相为甲醇:水=80:20 (v/v) , 流速1.0ml/min, 检测波长254nm, 柱温30℃。结果:线性范围在20～5000ng/ml, 检测下限为20ng/ml, 平均回收率分别为97.36%, 日内、日间测定RSD分别为2.56%-5.19%和3.98-7.23%。结论:本法简便, 分析速度快, 重复性好, 灵敏度较高, 基本能适用于临床血药浓度测定及药动学研究。
关键词：罗红霉素,血药浓度,高效液相色谱法
参考文献
[1]谭鸿毅, 阳国平, 裴奇, 等.高效液相色谱法测定健康人体血浆中罗红霉素的浓度[J].国医院药学杂志, 2006, 26 (11) :1356-1357.
青霉素浓度 篇7
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 卵巢来源
屠宰场收集的废弃卵巢。
1.1.2 试剂来源及成熟液组成
TCM199购自Gibco, 胎牛血清 (FBS) 购自Hyclone, NaCl为国产试剂, 其余试剂均购自Sigma, 水均为D8611过滤的超纯水。
成熟液:TCM199加猪卵泡液、半胱氨酸、表皮生长因子 (EGF) 、孕马血清促性腺激素 (PMSG) 、人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 、青霉素、链霉素。
1.2 方法
1.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养
将屠宰场收集的猪卵巢保存在37～38.5℃的生理盐水中, 12 h内运回实验室, 测量生理盐水温度。卵巢经灭菌生理盐水冲洗3次后, 用16G针头的一次性注射器吸取直径在2～8 mm卵泡中的卵丘细胞-卵母细胞复合体 (COCs) , 2 h内抽完抽取液注入15 ml尖底离心管, 并置于37℃水浴槽中。待COCs沉降后, 用TL-Hepes和0.3%BSA洗涤2次。选择具有完整卵丘细胞层及均匀胞质的COCs用成熟液洗涤3次后进行成熟培养, 培养用60 mm塑料瓶皿 (Nunc) 。每滴80 ml培养液中放入30～40个COCs, 加盖矿物油。培养条件为38.5℃、5%的CO2、饱和湿度空气, 培养时间为44 h。
1.2.2 去除颗粒细胞
培养44 h后, 将COCs移入0.1%透明质酸酶中用移液枪轻轻吹打180～200次, 然后移入M199-Hepes和0.5%FBS液滴中, 选取胞质均匀形态正常且排出第一极体的卵母细胞, 存放于37℃恒温台上备用。
1.2.3 试验设计方案
将成熟卵母细胞随机分为4组, 分别用含有10、15、20、25μmol/L离子霉素的NCSU23和4 mg/ml BSA液滴处理40 min, 再移入2 mmol/L的6-DMAP清洗并培养8 h, 最后移入NCSU23和4 mg/ml BSA的发育液中培养, 48 h观察卵裂率, 第7天观察囊胚率。
1.3 数据分析
数据分析采用SPSS统计软件中One way ANOYA进行方差分析。
2 结果
猪体外成熟卵母细胞经过浓度为10～25 mol/L的离子霉素和6-DMAP联合激活后, 离子霉素浓度为25 mol/L组的卵裂率和囊胚率最高, 其卵裂率和囊胚率分别为 (26.72±19.75) %和 (11.76±10.76) %。虽然随离子霉素浓度的升高各组卵裂率和囊胚率有上升趋势, 但各组之间其差异均不显著 (P>0.05) 。可见在处理时间相同的情况下, 10～25 mol/L离子霉素和6-DMAP联合激活猪体外成熟卵母细胞, 对其孤雌发育能力有一定影响, 但效果不显著。
3 讨论
注:表中同列内字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。
Ca2+浓度升高是卵母细胞被活化的信号, 离子霉素对卵母细胞的激活作用主要是通过启动卵母细胞的内源Ca2+, 由内源Ca2+的活化引发胞外Ca2+的内流[5]。由本试验可知, 猪体外成熟卵母细胞采用离子霉素激活最佳的浓度是25 mol/L, 此结果与田见晖报道的20 mol/L和刘国世、吴中红[8]报道的15 mol/L为离子霉素激活猪体外成熟卵母细胞的最佳浓度的结果不一致, 其主要是由用离子霉素激活后再用6-DMAP激活时所处理的时间不同造成, 本试验采用的是6-DMAP处理8 h, 田见晖采用的是5.5 h, 而刘国世采用的是3.5 h。6-DNMAP的处理时间对猪卵母细胞的孤雌发育有显著影响, 田见晖报道20 mol/L离子霉素处理40 min, 后用2 mmol/L6-DMAP处理3.5 h、5.5 h和7.5 h, 5.5 h组的卵裂率、囊胚率最高[6], 而电脉冲激活后2 mmol/L6-DMAP处理2～14 h之间以处理8 h组的卵裂率、囊胚率最高[9]。离子霉素激活猪体外成熟卵母细胞的效果不仅受离子霉素本身的浓度影响, 还与其联合激活的其他化学物质的时间和浓度有关, 因此我们在选择离子霉素激活猪体外成熟卵母细胞时, 只有充分考虑这些因素, 才能取得良好的效果。本试验表明:猪卵母细胞采用离子霉素激活的最佳方案是用25 mol/L处理40min, 再用浓度为2 mmol/L的6-DMAP处理8 h。
参考文献
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[3]Kaufman M H.Early Mammalian Development:Patheno-genetic Studies[M].Cambridge Univesity Press, 1993, 229-259.
[4]Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, et al.Production of cloned pigs from in vitro systems[J].NatureBiotechnolo-gy, 2000, 18:1055-1059.
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[6]田见晖, 蔡元, 刘国世, 等.化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响[J].中国农业科学, 2005, 38 (5) :1029-1033.
[7]刘国世, 曾申明, 吴中红, 等.不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响[J].畜牧兽医学报, 2004, 35 (6) , 615-620.
[8]吴中红, 邢凤英, 曾申明, 等.猪体外成熟卵母细胞激活方法的比较[J].自然科学进展, 2003, 13 (5) :485-489.
青霉素浓度 篇8
1材料
K562细胞(本室保存);LDM(由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠);RPM-1640(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Biological公司);MTT (噻唑蓝)法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒(南京凯基);苔盼蓝;兔抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)抗体(美国Affinity公司);Beta actin (β 肌动蛋白) 抗体 (美国Affinity公司)
2方法
2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后,用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,所有实验均采用对数生长期细胞。
2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100 μl/孔 (约1×104),置37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h后,加入不同浓度力达霉素(LDM),再于恒温培养箱孵育48 h,加入50 μl MTT,37 ℃孵育4 h,使MTT还原为甲臜,1 000 g离心,吸出上清,每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)使甲臜溶解,平板摇床摇匀,于490 nm波长处检测每孔的吸光度(A)值,计算细胞成活率。
2.3细胞的计数离心收集K562细胞,制备单细胞悬液并作适当稀释,细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀,在3 min内分别计数活细胞和死细胞,计算活细胞率。
2.4细胞凋亡形态的观察将K562细胞2×105个/ml浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI 1640培养基中,置24孔板中,每孔2 ml,加入不同浓度的LDM,设对照组,培养48 h,转入离心管,1 000 g离心,弃上清, 取0.2 ml涂片,冷风吹干,瑞氏染色10 min,姬姆萨染液染10 min,冲洗,晾干,在倒置显微镜下观察。
2.5细胞培养上清中TNF-α 表达的检测将K562细胞置37℃,5% CO2细胞培养箱培养48 h后1 000×g离心,收集细胞培养上清。采用ELISA试剂盒进行检测。
2.6凋亡相关蛋白的检测离心收集K562细胞,预冷的PBS洗涤2次,加入裂解缓冲液1 ml(PMSF 10%)震荡混匀,冰浴30 min。 细胞裂解物在4 ℃ 12 000 g离心5min,取上清。使用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。等量的蛋白样品进行SDS-PAGE,将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜 (聚偏二氟乙烯膜) 上。室温下用含5%脱脂奶粉[PBS (磷酸缓冲盐溶液)溶解]封闭1 h。随后加入一抗 (1:500)4 ℃过夜。PBST(PBS溶液加上吐温-20)洗膜3次,加入相应的二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗膜3次。 ECL曝光法显色,通过成像系统捕获图像,并通过图像分析系统对所得区带进行扫描,比较各组的积分A值。
2.7统计学分析实验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,实验结果采用±s表示。
3结果
3.1 LDM对人白血病K562细胞增殖的影响不同浓度LDM素作用K562细胞48 h后,置于全自动连续光谱酶标仪在490 nm处测定A值。按公式:细胞存活率%=(加药细胞A/对照A)×100,从而得出LDM对K562细胞作用的半数抑制浓度(IC50)为10-10mol/L。见图1。
3.2 LDM对人白血病K562细胞活性的影响苔盼蓝染色显示,正常细胞无色,死细胞呈蓝色。不同浓度LDM素作用于K562细胞48 h后对其生长均有一定的影响。见图2。
注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-9mol/L;D:10-10mol/L;E:10-11mol/L; F:10-12mol/L
分别用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM素作用K562细胞。按公式:抑制率(IR)%=死细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100,计算出IR值。测得IR值分别为 (21.2±2.5)%、(37.5±0.97)%、(5.21±1.2)%、 (64.5±1.6)%和(71.3±2.0)%。
3.3 LDM对人白血病K562细胞凋亡形态的影响未经药物处理的对照组K562细胞多呈圆形,经不同浓度LDM处理后,均出现明显凋亡形态,包膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以至形成凋亡小体。见图3。
注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L
3.4 LDM诱导人白血病K562细胞TNF-α 在细胞培养上清中的表达结果显示,10-8、10-10、10-12mol/L的LDM处理后,细胞培养血清中TNF-α 的含量分别为16.2 ± 4.0、35.0 ±2.9、51.0 ±3.6、60.5 ±0.5,对照组为 (16.2±4.0)pg/ml,3个浓度组与对照组的差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。
注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L。TNF-α—肿瘤坏-α;β-actin—β 肌动蛋白(内参蛋白)
3 . 5LDM对人白血病K562细胞TNF - α 表达的影响用10-8、10-10、10-12mol/L浓度LDM处理组48 h后,TNF-α 蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13 (P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,A值升高。见图5。
注:与对照组相比较,aP<0.01
4讨论
目前认为,肿瘤的发生和细胞增殖与细胞凋亡平衡失调有关。细胞凋亡是细胞内源性基因调控下的生理性细胞死亡方式,凋亡过程受阻是肿瘤发生的主要机制之一,同时也是临床上肿瘤治疗研究的热点之一。 诱导凋亡是化疗药物抗白血病的重要机制。
LDM(原名C-1027[5,6],lilamycin)是具有我国自主知识产权的烯二炔类(enediyne)抗生素,以其抗肿瘤的强烈活性及独特的DNA切割方式而颇受重视。LDM由1个辅基蛋白和1个发色团组成,发色团是其活性部分。LDM能引起核苷酸碱基和序列特异性的DNA单链和双链断裂[7]。大量研究表明,力达霉素具有较强的抗肿瘤活性[8,9,10],LDM能够强烈抑制肿瘤生长和肿瘤转移。最近有研究证明,LDM可以诱导肿瘤细胞染色体异常和端粒错排[11]。以往研究显示,不同剂量LDM能诱导多种类型的肿瘤细胞死亡,如典型细胞凋亡,但其究竟确切作用于哪种凋亡通路目前尚不清楚。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程,以核酸内切酶活化后将DNA分解为180 bp整倍数的片断DNA为特征。形态学上表现为细胞起泡,核固缩。LDM作用非常迅速,活性比一般抗肿瘤药强。要抑制肿瘤细胞的生长,一方面可以通过影响细胞周期,使其不能进行正常的有丝分裂;另一方面可以促进细胞凋亡,以达到治疗目的。本研究采用MTT法观察了LDM对人白血病K562细胞增殖有抑制作用,其IC50值为10-10mol/L,作用均强于丝裂霉素和阿霉素,显示出LDM对K562细胞有极强的杀伤作用。人白血病K562细胞经LDM处理后,细胞均出现明显凋亡形态,胞膜皱缩,胞核固缩, 浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以致形成凋亡小体。细胞凋亡是内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号,目前普遍认为是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡不同阶段发挥作用,分为调控性caspase和效应性caspase形成凋亡信号转导的酶级联反应。TNF-α 是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,因其可致肿瘤出血,并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞而得名。TNF-α 的生物学活性占TNF总活性的70%~95%,其前体由223个氨基酸组成,相对分子质量为26,成熟的TNF-α 含157个氨基酸,无蛋氨酸残基,即无糖基化位点,TNF-α 通过细胞膜上的受体 (TNFR)发挥生物学活性[11]。TNF的生物效应都是通过细胞表面的2种TNF受体(TNFR)引发,其信号转导通路主要包括caspase家族介导的细胞凋亡、衔接蛋白TRAF介导的转录因子NF-B和JNK蛋白激酶的活化[12]。细胞凋亡的死亡受体途径是指细胞凋亡由死亡受体[主要有Fas(factor associated suicide)、TNFR(tumor necrosis factor receptor) 家族和TGF-βR(transforming growth factor β receptor)等]介导,与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导。其中Fas和配体Fas L(Fas ligand) 结合,通过死亡功能区活化接头蛋白FADD (Fas-associated protein with death domain),而FADD又可以通 过N端的死亡 效应域DED (Death effector domain)和Caspase-8相互作用引发细胞凋亡。本实验研究证实,低浓度LDM可能通过上调TNF-α 表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖,其作用机制有待进一步深入研究。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
摘要：目的 探讨低浓度力达霉素(LDM)对人白血病细胞K562增殖的抑制作用及其可能的作用机制。方法 以不同浓度LDM处理K562细胞48 h,通过MTT法检测LDM对细胞增殖的抑制作用;利用苔盼蓝染色对细胞活性进行测定;利用瑞氏-姬姆萨染色法观察LDM对细胞形态的影响;Elisa法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在细胞培养上清中的表达;采用Western Blot检测凋亡相关蛋白TNF-α的表达。结果 LDM对K562细胞增殖有一定的抑制作用,用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM分别作用K562细胞48 h,抑制率分别为(21.2±2.48)%、(37.5±0.88)%、(52.1±1.24)%、(64.5±1.61)%和(71.3±2.00)%。通过瑞氏姬姆萨染色,荧光显微镜下可见胞膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成团块分散在胞膜周边。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清,LDM处理组与对照组相比,TNF-α表达水平升高。Western Blot分析显示,分别用10-8、10-10、10-12 mol/L浓度的LDM处理细胞48 h后,TNF-α蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13(P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,吸光度值比升高。结论 低浓度LDM可能通过上调TNF-α表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖。
