3-氨基苯甲酰胺

关键词：酰胺

3-氨基苯甲酰胺（精选八篇）

3-氨基苯甲酰胺篇1

目前,国内外有关邻氨基苯甲二酰胺类农药检测的报道,主要集中在原药和食品中,土壤中邻氨基苯甲二酰胺杀虫剂的检测方法较少,检测项目较单一,且未见超高效液相色谱-串联质谱法同时测定氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟双酰胺3种邻氨基苯甲二酰胺类杀虫剂的公开文献。本研究建立了超高效液相色谱-四级杆串联质谱ESI+离子、MRM模式下,土壤中3种邻氨基苯甲二酰胺类目标物有效成分分析和定量方法。此方法适用于氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫酰胺的同时测定,并具有简便、快速、准确、灵敏度高、重复性好的特点。适用于土壤环境的分析检测。

1实验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器设备

AB SCIEX3500三重四级杆串联质谱仪(配ESI源),固相萃取装置,均质器,离心机,电子天平,旋转蒸发仪,超声波清洗器,超纯水机等。

1.1.2试剂、药品

乙腈、甲醇、乙酸、乙酸胺为色谱纯,磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾为分析纯。水:符合GB/T 6682中一级水的规定。固相萃取柱Oasis HLB:200mg,6m L。

1.1.3溶液

磷酸盐缓冲液a:称取41.70g磷酸氢二钾和2.30g磷酸二氢钾加水溶解至1000m L。磷酸盐缓冲液b:用磷酸将磷酸盐缓冲液a调节p H至2~3。提取液:将磷酸盐缓冲溶液a与甲醇体积分数为50%混合均匀。

1.1.4标准物质

氟虫酰胺(CAS号272451-65-7)、氰虫酰胺(CAS号736994-63-1)、氯虫苯甲酰胺(CAS号500008-45-7),标准品纯度均≥97%。将上述标准物质用甲醇配置成浓度为100ng/m L的标准储备溶液,存放于2℃~8℃冰箱中,可保存3个月。临用时用流动相配置成相应浓度的工作液。

注:*表示定量离子对

1.2实验方法

1.2.1试样制备

按照NY/T 1121.1中有关规定采集土壤,去杂物后充分混匀,保存在-18℃冷冻冰箱中。按照NY/T 52平行取三份新鲜土壤,(105±2)℃的烘箱中烘烤12h后在干燥箱中冷却后称重,测定土壤的水分含量(α),再计算土样换算至烘干的水分换算系数K(K=1-α)

1.2.2样品提取

称取10g试样(精确到0.01g)于200m L锥形瓶中,加入100m L提取液,用振荡器振荡30min,超声提取10min,将上清液装入50m L离心管中,4000r/min离心5min。准确移取20m L在40℃下旋转蒸发至10m L左右,用磷酸调节p H至2~3之间,待净化。

1.2.3样品净化

依次用5m L甲醇,5m L磷酸盐缓冲液b淋洗活化固相萃取柱,将待净化液转移上柱,抽干,弃去流出液。再用6m L乙腈洗脱,收集洗脱液于10m L氮吹管中,45℃下吹干,加入1m L流动相,漩涡混匀1min,过0.22μm有机系滤膜后,超高效液相色谱-串联质谱测定。

1.2.4色谱条件

色谱柱:Thermo syncronic C18 Dim.(mm)50×2.1,Particle Sz.(μ)1.7;进样量:10μL;柱温:35℃;流速:0.3m L/min;梯度洗脱设定程序见表1。

1.2.5质谱条件

离子源:ESI+;扫描方式:MRM;辅助加热气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气;定性定量离子对、去簇电压、碰撞气体能量、碰撞池出口电压见表2。

1.2.6定量测定

用混合标准工作溶液对样品溶液进行外标法定量,样品溶液中待测物的响应值应与相应浓度的对照标准物质响应值相当。

2结果与讨论

2.1净化条件的优化

由于土壤样品基质复杂,干扰因素较多,特别是一些可溶性物质严重影响分离效果和检测灵敏度。固相萃取技术由于溶剂用量少,操作方便,回收率高等特点,广泛用于食品、环境中微量成分的测定。本文对比了硅胶柱、活性炭柱和Oasis HLB柱的净化效果,只有Oasis HLB能将样品中的杂质有效分离,杂峰干扰较少,净化效果最佳。同时由于Oasis HLB柱在酸性条件下极性捕获基团保留效果最佳。因此,样液过柱前先调节p H至酸性条件,富集目标物于净化柱上,过柱后用乙腈将目标物洗脱收集,回收率较高。不同p H条件下回收率对比图见图1。

2.2仪器条件的优化

本研究采用正负离子质谱扫描模式,对氟虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氰虫酰胺的质谱条件进行对以寻优,在混合标准浓度均为1mg/L条件下。负离子模式下Q1信号强度均在1×103左右,强度较低,不适合采用;在正离子Q1模式下,分别扫描[+H]和[+NH4]的信号强度,3种物质母离子强度均超过了1×107,但Q3模式下,氰虫酰胺和氯虫苯甲酰胺只有[+H]产生的子离子强度较稳定。因此,经过多方比较,最后选择信号强且稳定的m/z:474.9/285.9,474.9/177.0,4 83.9/452.9,4 83.9/2 85.9,6 83.0/4 0 8.0,683.0/273.9为定性离子对,其中信号较高的m/z:474.9/285.9,483.9/452.9和683.0/408.0为定量离子对。3种邻氨基苯甲二酰胺类化合物的提取离子对色谱图见图2。

2.3方法的线性范围和相关性及测定低限

准确配置邻氨基苯甲二酰胺类标准品系列标准溶液,质量浓度分别为2、5、10、20、50μg/L。按照1.2.4-1.2.5中的仪器条件进样分析后,以峰面积y对质量浓度x绘制工作曲线。线性相关系数r均大于0.9985,在2~50μg/L范围内呈良好的线性关系。对空白样品进行加标回收试验,根据信噪比S/N≥10为定量限和S/N≥3为检出限的参考规定,结合样品处理过程中的稀释倍数,计算各组分的方法定量限和检出限,测定底限均小于1.0μg/kg,灵敏度较高。结果见表3。

2.4方法的准确度和精密度

以不含氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫酰胺的土壤样品为本底,分别添加系列浓度的待测药物标准溶液,按照1.2节所述实验方法进行回收率实验,重复测定6次,结果见表4。

2.5实际样品测定

采用本研究所建立的检测方法对三明地区20个农田、菜园采集的土壤样品进行实际样品检测,结果显示,其中一批样品检出氰虫酰胺0.72mg/kg,3批样品不同程度检出氯虫苯甲酰胺和氟虫酰胺,最高检出值达1.27 mg/kg,其余均未检出。

3结论

3-氨基苯甲酰胺篇2

关键词：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐；大白菜；残留动态；高效液相色谱

中图分类号：S634 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0088-3

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐化学名称为4'-表-甲胺基-4'-脱氧阿维菌素苯甲酸盐。它具有超高效，低毒，无残留等生物农药的特点，对棉铃虫、螨类、鳞翅目、鞘翅目及同翅目害虫有极高活性，在土壤和水中易降解无残留，不污染环境，在常规剂量范围内对有益昆虫及天敌、人、畜安全，可与大部分农药混用[1]。为明确甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在大白菜及土壤中的残留情况，作者对10%甲氨基阿維菌素苯甲酸盐WG在大白菜、土壤中的残留动态和最终残留量进行了研究，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2009-2010年在吉林农业大学实验站及山东济南进行。供试药剂为10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG (河北博嘉农业有限公司)；供试大白菜品种为“绿丽人”。

1.2 田间试验设计

1.2.1 残留消解动态试验消解动态试验为1次施药，多次采样，各处理重复3次，小区面积30m2，施药量50.60g/hm2，对水40㎏，在大白菜苗后5片叶期均匀喷雾在大白菜植株上。施药后按0、8h、1、3、5、7、14、20、30、40、60d、采集土壤样品。各处理小区以5点法取样，土壤采样深度为0-10cm，最终取样不少于1kg.用四分法取土样200g，阴干后过20目标准筛，保存备用。

大白菜采样时以5点法，每小区采样品采样量不少于1kg，四分法取样切碎混匀，再连续四分法取样100g，贮存于-20℃冰箱中待测[2]。

1.2.2 最终残留试验设2个施药剂量，在大白菜苗后5叶期，分别用10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG33.73g/hm2、50.60g/hm22次、3次，1个空白对照，3次重复，小区面积30m2，大白菜收获期采集大白菜，每小区采5点，剪碎混匀后四分法取样500g。同期采集空白样品，于-20℃条件下保存待测。

1.3 分析方法

1.3.1 仪器与试剂 Agilent 1100型液相色谱仪（美国安捷伦公司）；紫外检测器；水浴恒温振荡器(SHZ-88型)；超声波清洗器(KQ-250DE型)；旋转蒸发仪(RE-52A型)；组织捣碎机（DS-1型）。

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐标准品，纯度97.7%(Sigma公司)；流动相乙腈为（HPLC），乙腈、二氯甲烷、磷酸、氯化氨、丙酮、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯；水为二次蒸馏水。

1.3.2 样品的提取与衍生化称取剁碎的大白菜样品20.0g，置于组织捣碎机中，加入80ml乙腈，高速匀浆提取3min，在铺有助滤剂的布氏漏斗中减压抽滤，滤液收集到装有7g氯化钠的100ml具塞量筒中，收集滤液90-100ml，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静止60min以上，使乙腈相和水相充分分层。从100ml具塞量筒中吸取40ml上层乙腈溶液，过无水硫酸钠柱后，置于旋转蒸发器40℃下减压浓缩至干。2ml丙酮溶解后，氮气吹干后，在棕色容量瓶中加入0.25ml 1-甲基咪唑后，加入0.25ml三氟乙酸酐，再加入0.5ml甲醇衍生，振荡30秒后，静止30min，过膜，液相色谱测定[3-6]。取土壤样品50.0g，置于具塞三角瓶中，加入10ml蒸馏水，其余操作与大白菜一样。

1.3.3 色谱分析条件（1）仪器条件：Agilent1100液相色谱仪配荧光检测器；色谱柱：DIAMONSIL C18 200mm×4.6mm×5µm；柱温30℃；流动相为甲醇:水=95:5（大白菜）、甲醇：水=90：10（土壤）流速为1.0ml/min；激发波长365nm；发射波长470nm；进样量：10ul，保留时间18.581-18.593 min（大白菜）、20.369-20.422 min（土壤）。

(2) 定量方法：采用外标(峰面积) — 标准曲线法进行定量分析。用甲醇配成1000mg/kg的标准溶液，采用系列稀释法稀释至所需的浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、2.5mg/kg后，在上述色谱条件下进行测定，以进样量为横坐标x和峰面积为纵坐标y建立标准曲线，得回归方程为y=120.88x+1.3008，r=0.9999。

2 结果与分析

2.1 回收率测定结果

分别称取空白大白菜和土壤样品，分别添加0.01、0.1、0.5mg/kg三个不同水平的标准样品，每个处理重复5次。按照上述前处理方法和仪器条件测定方法回收率，结果见表1。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在上述3个浓度添加时，按上述处理方法提取、净化，测定回收率结果均符合要求。

表1 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在大白菜和土壤中添加回收率测定结果

本方法对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐最小检出量2.0×10-11g ，最低检出浓度0.005㎎/㎏(植株)、0.002㎎/㎏(土壤)

2.2 大白菜中的消解动态

用10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG50.60g/hm2，对水40kg，在大白菜苗后5叶期均匀喷雾在大白菜上，于施药后不同时间采样进行测定，结果见图1。2009年甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在大白菜植株中的消解曲线方程为C=0.0332e-0.0857t，相关系数r=0.6536，半衰期t1/2=22.1d(吉林)；C=0.0497e-0.1015t，相关系数r=0.8161，半衰期t1/2=11.8d(山东)。2010年C=0.0655e-0.2189t，相关系数r=0.7819，半衰期t1/2=7.0d(吉林)；C=0.0107e-0.4917t，相关系数r=0.1833，半衰期t1/2=0.6d（山东）。

图1 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在大白菜中的消解动态曲线

2.3 在土壤中的消解动态

用10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG50.60g/hm2，对水40kg，在大白菜苗后5叶期均匀喷雾在大白菜田土壤上(可不种植大白菜)，于施药后不同时间采样进行测定，结果见图2。2009年甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在土壤中的消解曲线方程为C=0.0114e-0.0179t，相关系数r=0.8988，半衰期t1/2=24.9d(吉林)；C=0.0085e-0.0443t，相关系数r=0.9880，半衰期t1/2=12.9d(山东)。2010年C=0.0205e-0.0219t，相关系数r=0.9379，半衰期t1/2=24.6d(吉林)；C=0.0195e-0.046t，相关系数r=0.8897，半衰期t1/2=1.5d（山东）。

图2 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在土壤中的消解动态曲线

2.4 在大白菜和土壤中最终残留量

在大白菜苗后5叶期，分别用10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG33.73g/hm2，50.60g/hm2施药2次、3次，施药间隔7d，末次施药与大白菜收获期间隔在3d、7d、14d采样。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在植株中的最终残留量低于0.0223mg/kg，土壤中的残留量低于0.0257mg/kg，日本甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在大白菜中农药残留限量为 0.1mg/kg[7]，试验结果低于此标准。由此可见在本试验条件下使用10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG是安全的。

表2 在土壤、植株中的最终结果

3 小结

本文对10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG消解动态进行了研究，实验获得较好的回收率、重复性和较低的检出限，满足农药残留分析的要求。从消解速率测定结果来看，在大白菜上和土壤中的半衰期较短（t1/2<30d），属于易降解农药。收獲期植株中和土壤中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐残留量均低于其MRL值，在建议施药剂量和方法下使用是安全的。本方法为预测其使用后在环境中的降解动态，研究其环境行为奠定了基础。同时为正确评价其生态环境安全性及制定安全使用标准提供了方法依据。

参考文献

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[2] 中华人民共和国农业行业标准.NY／T 788-2004.农药残留试验准则[s].北京:中国农业出版社, 2004.

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[6] 周爱英,舒红英.甲氨基阿维菌素苯甲酸盐高效液相色谱分析[J].江西化工.2003,(4):122-124.

3-氨基苯甲酰胺篇3

多糖类CSPs在正相色谱( NPC) 模式下的手性分离的报导非常多,但其在反相色谱模式( RPC) 下的手性分离报导则非常少。但反相色谱有很多优点,比如极性化合物具有更高的溶解度,能简便地从血浆或血清中制取样品,使用的溶剂也更便宜; 而且特别适用于生物样品中药物对映体比例的检测。1989年,Ikeda等[10]以缓冲液为流动相首次实现了多糖类CSPs在RPC下的手性分离。为使在RPC下能更好的进行手性分离,研究者进行了大量筛选流动相的工作[11]。

制备了基于淀粉2-苯甲酸酯-3-( 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) -6-( ( S) -1-苯基乙基氨基甲酸酯) 的手性固定相,在反相色谱条件下考察了其手性识别能力。

1 实验部分

1. 1 仪器与试剂

Agilent 1200系列高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦科技公司) ; FT-IR 8400型傅里叶变换红外光谱仪( 日本Shimadzu公司) 。淀粉( 聚合度约300) ;苯甲酸乙烯酯、二甲基亚砜( DMSO) 、三苯基氯甲烷( Tr Cl) 、3,5-二甲基苯基异氰酸酯、( S) -1-苯基乙基异氰酸酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷( 上海阿拉丁公司) ; 吡啶 ( 分析纯,Ca H2回流干燥,重蒸使用) ; 苯、甲苯( 分析纯,金属Na回流干燥,重蒸使用) 。硅胶( 平均直径7μm,平均孔径100 nm,日本Daiso公司) 。乙腈、甲醇( 色谱纯,美国Tedia公司) 。

1. 2 手性固定相的制备

称取10 g干燥的硅胶置于三口瓶中,依次加入60 mL干燥甲苯、5 mL干燥吡啶、6 m L 3-氨丙基三乙氧基硅烷,在氮气氛围下,于85℃下回流15 h。反应完毕后,用干燥甲苯洗涤3 ~ 4次,无水甲醇洗至无甲苯味,砂芯漏斗抽滤,在80℃下干燥5 h,得到氨丙基硅胶。

区域选择性修饰淀粉衍生物的制备方法参照文献[12],过程如图1所示。将6. 0 g干燥的淀粉溶于120 mL无水DMSO,80℃搅拌溶解( 约15 min) 。冷却至40℃,加入苯甲酸乙烯酯和Na2HPO4( 2% ,w / w) ,40℃下连续反应216 h。反应结束后,溶液倾入1 000 m L异丙醇溶液中,过滤、洗涤。为选择性地保护6-位羟基,将得到的单酯与三苯基氯甲烷( 2倍量,摩尔比) ,于80℃下再反应24 h。反应结束,加入3,5-二甲基苯基异氰酸酯,80℃反应24 h,把3-位羟基转变为3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基团。反应结束后,用甲醇洗涤、抽滤。之后淀粉2苯甲酸酯-3-( 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) -6-羟基悬浮于含少量盐酸的甲醇溶液中,于50℃下反应24 h水解脱去6-位的保护基团。最后,加入( S) -1苯基乙基异氰酸酯,80℃下氮气保护,反应24 h,便得到淀粉2-苯甲酸酯-3-( 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) -6-( ( S) -1-苯基乙基氨基甲酸酯) ,即2-,3-,6-位取代基均不同的新型淀粉衍生物。将0. 15 g衍生物直接涂敷于0. 60 g氨丙基硅胶上,得到手性固定相CSP1。

1. 3 色谱条件

色谱柱尺寸为250 mm×2. 0 mm i. d. ,以正己烷-异丙醇( 9: 1,V/V) 为匀浆液,匀浆装柱。所有色谱分离均在室温条件下进行,流动相分别为甲醇水、乙腈-水,使用前经0. 2μm滤膜过滤并超声脱气,流速为0. 1 m L/min,检测波长为254 nm。死时间( t0) 由硫脲测定。保留因子k1'= ( t1- t0) /t0,k'2=( t2- t0) /t0; 分离因子α = k'2/ k'1。

2 结果与讨论

2. 1 手性固定相的表征

对所制备的淀粉衍生物、固定相进行了表征,其中淀粉衍生物的核磁表征见文献[12]。淀粉衍生物:FT-IR: 3 337 cm- 1( —N—H) ,1 736 cm- 1( —CO) ,1 615 cm- 1( —C6H5) 。CSP1的红外谱图如图2所示,在约1 723 cm- 1处出现—CO的伸缩振动峰,而氨丙基硅胶没有—CO的吸收峰( 见图3) ,说明淀粉衍生物已成功涂敷在氨丙基硅胶上。同时由CSP1的热重分析图( 图4) 可知固定相的有机物含量约为17% ,明显高于氨丙基硅胶有机物含量1. 8% ,这同样说明手性固定相的制备是成功的。

2. 2 手性固定相的手性识别能力

在反相色谱条件下,考察了CSP1的手性识别能力。手性化合物的结构如图5所示,其中1 ~ 7、8 ~ 10和11 ~ 12分别为中性、酸性及碱性手性化合物。

2. 2. 1 中性对映体的分离

在中性流动相条件下 ( 流动相为甲醇/水、乙腈/水) 考察了CSP1对中性手性化合物的手性识别能力,结果见表1。同时,比较了反相色谱与正相色谱条件下CSP1手性识别能力的差异。

由表1可知,在以甲醇/水为流动相时: 对映体的保留因子( k1) 随流动相中甲醇含量的减小而变大; 共有2对对映体( 1、2) 得到了分离,并且手性固定相的手性识别能力随流动相中甲醇含量的降低而升高。以对映体2为例,当甲醇含量为80% 时,其α值为1,未能得到分离; 而当甲醇含量分别降低为70% 和60% 时,对映体2得到了分离,其α值分别为1. 13和1. 11。在以乙腈为流动相添加剂时: k1值也随流动相中乙腈含量的降低而变大; 只有对映体1得到了分离,其α值也随乙腈含量的降低而有所增大。当乙腈含量由70% 降低到60% 再降低到到50% 时,其k1值由0. 41增大到0. 80和1. 72,而其α值分别为2. 03、2. 03、2. 13。结合图6可知,对映体1在乙腈含量为50% 和60% 时达到完全分离,随着乙腈含量增大到70% ,其手性分离能力有所下降但仍基本达到基线分离。

管柱规格: 25 cm × 0. 2 cm i. d. ; 流速: 0. 1 m L/min; 检测波长: 254 nm。

此外,综合表1中的数据可知,相比于以乙腈为流动相添加剂( 对映体1得到了分离) ,添加剂为甲醇时( 对映体1、2得到了分离) CSP1显示出更高的手性识别能力。同时,当流动相中有机溶剂( 甲醇、乙腈) 含量相同时,添加剂为甲醇时对映体的保留更强、分离更好。这说明流动相添加剂的性质会在一定程度上影响CSP1的分离性能。以对映体1为例,流动相为甲醇-水( 70∶30,v /v) 时其k1、α值分别为2. 48、3. 16,明显高于流动相为乙腈-水( 70∶30,v /v) 时的k1( 0. 41) 及α值( 2. 03) 。

管柱规格: 25 cm × 0. 2 cm i. d. ; 流速: 0. 1 m L/min; 检测波长: 254 nm。

表2为CSP1在正相色谱条件下的分离数据[12]。比较表1与表2中的数据可知,在正相色谱条件下,CSP1显示出更高的手性识别能力,可以分离除对映体4、5之外的5对对映体,且α值普遍大于1. 2。这可能是因为在正相色谱下,手性化合物和CSP1之间的氢键、π - π作用等更为有效[13]。而反相色谱色条件下最多能分离2对对映体。但对映体1在反相色谱条件下得到了更好的分离,其α值普遍高于正相色谱条件下的α值。

2. 2. 2 酸性对映体的分离

研究[11]指出在多糖类手性固定相上分离酸性手性化合物,使用酸性流动相是必需的,其目的是抑制羧基的解离,从而使酸性化合物得到适当的保留并得以分离。使用p H 2的水溶液与有机添加剂可充分抑制羧基的解离[13]。考察了酸性对映体8 ~10在CSP1上的分离,结果见表3。由表3可知: 在中性流动相( A,乙腈/水( 40 /60,v /v) ) 条件下及酸性流动相条件( B、C、D,p H 2水溶液/乙腈 = 60 /40,v / v) 下,酸性对映体均未得到分离。但相比于中性流动相,酸性流动相条件下酸性对映体的色谱峰更窄、更对称,如图7对映体10的分离。

2. 2. 3 碱性对映体的分离

在中性和酸性流动相条件下,碱性对映体带正电,因为带正电的对映体与手性固定相之间的相互作用不够充分,从而导致对映体很快洗脱而难以达到分离的效果。为达到分离的目的,可以在流动相中添加反离子既负离子,负离子和碱性对映体形中性复合物[13]。本文以0. 1 mol/L盐( Na BF4、KPF6)溶液/乙腈( 40 /60,v /v) 为流动相考察了碱性手性化合物11,12在CSP1上的分离,结果列于表3。由表3数据可知: 流动相为乙腈-水时,碱性对映体均未得到分离; 在流动相中加入反离子后,碱性手性化合物也没有得到分离。这可能是由于所制备的固定相的手性识别能力较差导致的。

3 结论

合成了基于淀粉2-苯甲酸酯-3-( 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) -6-[( S) -1-苯基乙基氨基甲酸酯]的手性固定相,对其进行了表征,考察了其在反相色谱条件下的手性识别能力。对中性手性化合物的分离表明: 流动相中有机添加剂的含量及性质均对对映体的保留和分离产生影响; 对映体的保留因子( k1)均随流动相中有机添加剂( 甲醇或乙腈) 含量的减少而变大; 与以乙腈为流动相添加剂( 有1对对映体得到了分离) 相比,流动相添加剂为甲醇( 有2对对映体得到了分离) 时,手性固定相显示出更高的手性识别能力,同时对映体在手性固定相上的保留更强; 相比于正相色谱,所制备的固定相在反相色谱下通常显示出更低的手性识别能力,但是对映体1在反相色谱条件下得到了更好的分离,其α值普遍高于其在正相色谱条件下的α 值。此外,还研究了酸性、碱性手性化合物的分离,但在实验条件下他们均没有得到拆分。总体来说,反相色谱条件下所制备的固定相的手性识别能力较差。

流动相: A,乙腈/水( 40 /60,v/v) ; B,p H 2 无水高氯酸/乙腈( 60 /40,v/v) ; C,p H 2 无水磷酸 /乙腈( 60 /40,v/v) ; D,p H 2 0. 5 mol/L 无水高氯酸钠 - 高氯酸 /乙腈( 60 /40,v/v) ; E,0. 1 mol/L 无水四氟硼酸钠 /乙腈( 60 /40,v/v) ; F,0. 1 mol/L 无水六氟磷酸钾 /乙腈( 60 /40,v/v) . 管柱规格: 25 cm × 0. 2 cm i. d. ; 流速: 0. 1 ml / min; 检测波长: 254 nm。

CSP1. 流动相,( a) 乙腈 / 水( 40 /60,v / v) ;( b) p H 2 无水高氯酸/乙腈( 60 /40,v/v) ; ( c) p H 2无水磷酸/乙腈( 60 /40,v/v) ; ( d) p H 2 0. 5 mol/L 无水高氯酸钠-高氯酸/乙腈 ( 60 /40,v/v) .

摘要：合成了基于淀粉2-苯甲酸酯-3-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-6-((S)-1-苯基乙基氨基甲酸酯)的手性固定相,对其进行了表征,考察了其在反相色谱条件下的手性识别能力。对中性手性化合物的分离表明:流动相中有机添加剂的含量及性质均对对映体的保留和分离产生影响。与以乙腈为流动相添加剂相比,流动相添加剂为甲醇时,手性固定相显示出更高的手性识别能力;同时对映体在手性固定相上的保留更强。相比于正相色谱,所制备的固定相在反相色谱下通常显示出更低的手性识别能力;但对映体1在反相色谱条件下得到了更好的分离,其α值普遍高于其在正相色谱条件下的α值。同时,还研究了酸性、碱性手性化合物的分离;但在实验条件下他们均没有得到拆分。

氨基酸酰胺类化合物的合成篇4

关键词：氨基酸,氨基保护,氨基酸酰胺类化合物,合成方法

氨基酸是生物分子最基本的单元,具有良好的生物相容性和特殊功能,可用于很多需要生物相容性物质修饰的材料,比如医药高分子材料,仿生材料,酶生物传感器等[1]。对于这些材料的改性修饰,往往通过氨基酸的氨基或羧基同材料的功能基团进行反应来完成。比较多的反应涉及到酰胺键的形成,然而氨基和羧基基团的相互影响[2]以及羧基与氨基容易发生酸、碱反应生成羧酸铵盐等,使得形成酰胺的反应较难进行。但只要仔细研究形成酰胺键的机理,不难发现,氨基酸类酰胺类化合物是应该可以高产率合成出来的。

为使氨基酸形成酰胺键,需要使氨基酸的氨基或者羧基活化。因活化氨基的反应激烈,而且常常发生消旋,所以总是采用保护氨基、活化羧基的办法。本文综述了氨基酸常用的氨基保护方法,并首次总结了其形成酰胺键的机理及其合成方法。

1 氨基的保护

氨基酸中的氨基对氧化和取代等反应都很敏感,如可能形成线性肽和环肽等副产物,为了使分子中羧基形成酰胺键时氨基保持不变,通常需要用易于脱去的基团对氨基进行保护,如图1所示,其中X和Y分别为α-氨基和侧链功能基团的保护基。保护氨基的一些主要方法和基团已有文献论述[3,4,5]。

在脱保护选择性上,氨基酸合成酰胺键过程中氨基保护基必须符合下列要求[6]:1)引入保护基后的氨基酸衍生物不再保持两性离子结构状态;2)脱保护时,不能破坏酰胺键的稳定性;3)在所有必要的操作过程中,不能发生脱除;4)必须有利于保护中间体的稳定性和表征;5)必须有利于保护氨基酸的溶解性。归纳起来可以分为烷氧羰基(氨基甲酸酯类)、酰基和烷基三大类,见表1。这里着重介绍比较常用的烷氧羰基类保护基,其中使用最普遍的是Cbz、Boz和Fmoc[7]。

1.1 苄氧羰基

这是目前最常使用的氨基保护基之一,缩写为Cbz(或Z),优点在于:1) 保护基的引入比较容易;2) N-苄氧羰基氨基酸易于结晶而且比较稳定;3) 苄氧羰基氨基酸在活化时不易消旋。引入Z基的方法[8]是在肖登-鲍曼(Schotten-Baumann)条件下,氨基酸与氯甲酸苄酯反应,在氢氧化钠、碳酸氢钠或氧化镁存在下,在含水的有机溶剂中激烈搅拌。如图2。Cbz-保护氨基酸的产率一般都很高(90%以上),产品为晶体。

苄氧羰基保护的氨基酸已广泛应用于各种有机合成中,但优化合成苄氧羰基氨基酸的研究仍在继续[9,10,11]。此外,已报道20多种不同取代的苄氧羰基保护基,这些在苄氧羰基的苯环上进行了取代的保护基具有不同选择性脱去或其它优点[6,12],比如3,5-二甲氧基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基和6-硝基-3,4-二甲氧基苄氧羰基可用光解的方法脱除。苄氧羰基保护基的苯环在3或4位被卤素或硝基取代后,能提高对酸的稳定性,这可以更好地区分Boc和Z,而且其保护的氨基酸衍生物更易于结晶。

1.2 叔丁氧羰基

叔丁氧羰基(Boc)[13]与Z基和芴甲氧羰基(Fmoc)一样,亦是氨基非常有效的保护基之一,许多氨基酸的Boc-衍生物都有工业应用的价值。它具有如下优点:1) Boc-氨基酸易得到结晶;2) Boc-氨基酸易酸解,又具有稳定性,易于长期保存;3) 酸解时不易产生副反应;4) 对碱解和肼解稳定;5) Boc-氨基酸对催化氢解稳定,氮比Cbz对酸要敏感的多。

常采用活化的叔丁氧羰基衍生物同氨基酸反应的方法,叔丁氧羰基(Boc)的引入[7,14]如图3所示。如以叠氮甲酸叔丁酯为原料,通过叠氮法进行。其缺点是必须严格控制pH值,且高温蒸馏纯化时,极易引起爆炸。二叔丁氧基碳酸酐也常作为引入Boc的试剂。

关于改良的叔丁氧羰基类衍生物[15]已有许多报道,有联苯异丙氧羰基、金刚烷基异丙氧羰基和苯偶氮苯异丙氧羰基等。其中金刚烷基异丙氧羰基其酸解速度比叔丁氧羰基快1000倍,苯偶氮苯异丙氧羰基具有颜色,有利于层析检查和含量测定。

1.3 9-芴甲氧羰基

Fmoc是一个具有广泛实用性的氨基保护基,芴甲氧羰基的优点[7,16]为:1) 对酸稳定,可被碱脱除。因此,尤其适合于合成含有Trp(色氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(半胱氨酸)等对酸不稳定的多肽;2)Fmoc-氨基酸用普通的胺就可以脱去Fmoc 基团;3) Fmoc基团有特征性紫外吸收,可以用UV或者荧光监控解保护过程;4)可以控制合成中副产物的性质。

Fmoc基团是在NaHCO3或Na2CO3存在环境下,通过以下反应引入到氨基酸中的,引入Fmoc基团如图4。最常用的Fmoc-保护试剂是Fmoc-Cl(9-芴甲氧酰氯)和Fmoc-Osu(9-芴甲基-N-丁二酰亚胺基甲酸酯)。

总之,氨基的保护方法和保护基都很多,上面介绍的是合成氨基酸酰胺类化合物中比较重要而又实用的方法和基团。事实上[17],由于氨基亲核试剂的活性取决于其中心氮原子的富电子程度,在氨基上引入吸电子基即保护基团,吸电子基的吸电作用致使氨基上中心氮原子的电子云密度减小,达到保护氨基的目的。根据这个机理,化学家们能够找到有关更好的方法及更有效的保护基[18]。

2 酰胺键的形成

氨基酸,有氨基和羧基基团的相互影响,难溶于有机溶剂,反应活性,选择性,产物的分离提纯等都对反应条件有着更严格的要求,使得普通酰化反应受到了限制[2]。因此人们不断地寻找使氨基酸快速和方便地酰化的方法和条件。下面我们从机理和基本方法上探讨氨基酸酰胺键的形成。

2.1 形成机理

在室温下,羧酸与氨或胺的反应产物是铵盐而不是酰胺,羧基组分必须在酰胺键形成前活化[6],即酰胺键的生成包括羧基活化和氨基的亲核反应。羧基活化的基本原理[6]是通过引入受电子基团X,将N-保护氨基酸的羧基转化为活性中间体R-COX(即酰氯、酸酐、混合酸酐、叠氮或活性酯),增强 -COOH 中C 原子上的正电性,而有利于-NH2的亲核反应。氨基组分以其氮原子上的孤对电子进攻羰基碳原子,得到四面体形的两性离子中间体。然后,通过从两性离子中间体解离活化羧基的基团X完成酰胺键的形成。这一耦合反应既可作为一步反应进行,也可作为两个连续的反应进行。

2.2 基本方法

活性中间体的多样性为氨基酸类酰胺键形成提供了多种方法,对此进行总结。其中包括缩合剂法、酰卤法、混合酸酐法等。

2.2.1缩合剂法

碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合[19]。在酰胺键形成期间,羧酸加成到碳二亚胺,形成高活性中间体O-酰基脲,继而与胺反应,几乎以定量产率生成酰胺。碳二亚胺转变为相应的脲衍生物N,N'-二环己基脲,从反应液中沉淀出来。以碳二亚胺为缩合剂的酰胺键缩合反应机理,如图5所示。

其优点为能使反应直接键合,可一步完成,操作较简单[20];产率高,条件温和;常用试剂DCC相对便宜,而且可溶于酰胺键合成常用的溶剂。但后处理较困难,因DCU在各种溶剂中溶解度较小,后处理过程中经常会析出且很难除尽。为此引入了用不同的叔氨基或季铵基取代的几种碳二亚胺衍生物如[1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺盐酸盐EDC,N,N-二异丙基碳二亚胺DIC和碳酰二咪唑CDI,使用这些改良的缩合剂,形成的脲类和咪唑易于除去。另外过量的碱和碱性的氨基组分、碳二亚胺或极性溶剂可催化活性中间体O※N的酰基转移,形成N-酰基脲,使其不再发生进一步的胺解。采用低温反应(0℃)或非极性的溶剂(例如THF)可将其抑制。还可以使用适当辅助试剂如1-羟基苯并三氮唑HOBt等,截取如O-酰基异脲等高活性中间体,形成活性较低的活泼酯,但仍足以进行快速的酰胺键形成。加入辅助试剂还可以抑制底物消旋,缩短反应时间。

2.2.2酰卤法

用酰氯活化羧基,然后在室温或低温条件下形成酰胺是一种常用的方法。机理如图6。

尽管因为它们“过度活泼”且易于发生消旋等多种副反应,氨基酸的酰氯一直极少应用。但由于Fmoc在酸性条件下非常稳定,并且9-芴甲基不易进行SN1或SN2取代反应,Fmoc-保护的氨基酸成为一种理想的底物,用来转化为相应的酰氯。且所有不含有极性侧链的普通氨基酸以及许多具有苄基或烯丙基侧链保护氨基酸,都可以转化为稳定的、晶体状的酰氯。Fmoc保护的氨基酸酰氯作为稳定、易于制得的一类衍生物,在酰胺键合成中又活跃起来,用于快速缩合反应[21]。

2.2.3混合酸酐法

先由N保护的氨基酸羧酸盐和活化组分氯甲酸烷基酯形成混合酸,亲核试剂胺再主要进攻氨基酸组分的羧基,形成预期的酰胺类衍生物,并且释放出游离酸形式的活性成分。当应用氯甲酸烷基酯(异丁基、乙基等)时,游离的单烷基碳酸不稳定,立即分解为二氧化碳和相应的醇。从氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的稳定性依赖于使用的烷基。由Boz、Z和Fmoc-保护的氨基酸和氯甲酸异丙酯制得的混合酸酐能够被分离纯化,比从氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得混合酸酐更稳定。

产率较高,但操作步骤多,最终收率不高,限制了其广泛的实际应用。Francis M.F.Chen等[22]对混合酸酐的稳定性,减少副产物氨基甲酸酯和消旋等方面进行深入研究,发现以二氯甲烷为溶剂和N-甲基哌啶作为三级碱能防止这一主要副反应,提高了该方法的缩合效率。另外,混合酸酐对水解有较高稳定性,因此可以用水洗涤有机相来纯化混合酸酐。

2.3 酰胺键合成中的其它问题

2.3.1溶剂的选择

溶剂的选择十分重要,如果需要连接的氨基组分或氨基酸的保护衍生物在反应溶剂中不能溶解,则缩合成酰胺键很难实现。常用的溶剂有四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等,前两者沸点较低,易于蒸除,但溶解能力较低。DMF有较大的溶解性, Alan J.Parker[23]指出偶极非质子溶剂如DMF等分子的C=O、S=O等基团可与分子的N-H形成氢键,从而降低分子间聚集的倾向,大大提高分子的溶剂化程度。但其易于促进消旋,并且沸点较高,需要减压蒸馏才能除去。

2.3.2产率低下的原因

在理想状态下,羧基组分的活化和随后的酰胺键形成(耦合反应)应为快速反应,没有消旋或副产物形成,并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是,还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法,往往产率很低或没有产物。

产率高低关键在于酰胺键形成反应中羧基活化体的反应活性和相继的酰化反应的选择性。然而提高反应活性常使选择性下降,反应选择性提高也可能导致反应活性降低。王哲清[24]指出酰胺化收率低下的主要原因在于底物中反应中心的立体位阻和电性效应。当底物的反应中心附近有庞大或数目较多的取代基时,反应减缓;当氮原子上的电荷降低时,反应减缓或不能完成。

3 展望

3-氨基苯甲酰胺篇5

关键词：γ-氨基丁酸,4-丁内酰胺水解酶,2-吡咯烷酮

γ-氨基丁酸是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,简称GABA[1],是一种天然活性成分,广泛分布于动植物体内。GABA是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质。它参与多种代谢活动,具有很高的生理活性,如降血压、促进脑新陈代谢、预防动脉硬化、健肝利肾等。因此,GABA作为一种新型的功能因子在食品、药物或保健品领域都具有广泛的发展和应用前景。

目前,γ-氨基丁酸的生产主要采用化学合成法和发酵法,但均存在反应产物很多不利于分离,得率低的问题,从而不益用于食品和药物[2]。目前尚未查到国内有关4-丁内酰胺水解酶水解2-吡咯烷酮得到γ-氨基丁酸的研究报告,也未见能运用于生产的菌株。在生长过程中能利用2-吡咯烷酮为碳源的菌株,一般含有内酰胺水解酶,能水解生成γ-氨基丁酸的几率很大,这正是本文选择以2-吡咯烷酮作为唯一碳源筛选目标菌株的基础。

本文以2-吡咯烷酮为唯一碳源,筛选得到了一株具有较高4-丁内酰胺水解酶的菌株,水解2-吡咯烷酮得到γ-氨基丁酸(见反应式)。

然后分别对菌株的产酶培养条件和转化反应的条件进行研究优化,得到了最佳的培养和转化条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种:

从合肥若干地方采集的土样中分离,共96株。

1.1.2 仪器和试剂

722型紫外可见分光光度计;Waters 600E型高效液相色谱,所用试剂均为市售分析纯。

1.1.3 培养基

(1)筛选培养基[3](每升含量):

Na2HPO 4·12H2O 1.5 g;KH2PO4 1.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCl2·2H2O 10 mg;FeSO4·7H2O 8 mg;ZnSO4 ·7H2O 0.1 mg;NH4Cl 2 g;2-吡咯烷酮3g;琼脂粉15 g,pH值为7.0,105kPa灭菌30 min。

(2)菌株保存培养基(斜面):

每升中除筛选培养基中成分不变外添加如下成分:酵母提取物0.1 g,可溶性淀粉0.1 g,胰蛋白胨0.1 g。

(3) 液体产酶培养基(每升含量):

Na2HPO4·12H2O 5 g;KH2PO4 1.5 g;MgSO4·7H2O 1.0 g;CaCl2·2H2O 10 mg;FeSO4·7H2O 8 mg;NH4Cl 2 g;2-吡咯烷酮5 g;葡萄糖5 g;pH值为7.0;105kPa灭菌30 min。

1.2 土壤中菌种的筛选

环境土样用无菌水梯度稀释后涂布于筛选培养基,37℃培养;平板在2～4 d后可观察到菌株生长,挑单菌落保存在培养基斜面上,菌株在2～4 d后陆续生长,取出并保存于4℃冰箱。

1.3 菌株的液体培养及预处理[4]

将斜面上的菌接种一环于产酶液体培养基中,37℃,180 r·min-1,培养24 h;取0.1 mL用水稀释10倍,以空白培养基为对照测量其在660 nm处的吸光度(OD值);剩余菌液离心收集菌体。

1.4 完整细胞转化2-吡咯烷酮

用0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制2-吡咯烷酮溶液为10 g·L-1,调pH为7.0。加5 mL至湿菌体中,振荡,倒入大试管,37℃,200 r·min-1,转化24 h,6000 r·min-1离心10 min,取上清液用茚三酮法鉴定转化反应结果。

1.5 HPLC法测定转化率[5]

用0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制2-吡咯烷酮溶液为10 g·L-1,调pH为7.0。加5 mL至湿菌体中,振荡,倒入大试管,37℃,200 r·min-1,转化24 h,6000 r·min-1离心10 min,取上清液用HPLC法测定转化率:色谱柱型号为XDB-C8(150 mm);衍生化试剂:取0.3430 g邻苯二甲醛,加入5 mL无水乙醇,再加入0.1472 g N-乙酰-L-半胱氨酸, 用0.1 mol·L-1硼砂缓冲液(pH=9.5)定容到25 mL, 避光保存;衍生反应:在试管中依次加入硼砂缓冲液(pH=9.5)300 μL, 样品250 μL,衍生试剂200 μL,混匀后进样。流动相为醋酸钠:甲醇3:1(V:V),流速1.0mL·min-1;检测波长334 nm。水解生成的γ-氨基丁酸保留时间为6.28 min。

转化率定义如下:

转化率undefined

1.6 酶活力的测定

用0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制2-吡咯烷酮溶液为10 g·L-1,调pH为7.0。取10 mL 2-吡咯烷酮溶液至大试管中,加入1 mL发酵液,37℃水浴,200 r·min-1振荡,转化20 min。6000 r·min-1离心10 min,取上清液用HPLC测定γ-氨基丁酸的含量(方法同标题1.5),按下式计算酶活力(单位:μmol·h-1·OD-1)。

酶活力undefined

2 结果

2.1 产4-丁内酰胺水解酶菌株的筛选

富集与分离:从合肥若干地区采集的土样共10个,经选择性平板筛选、划斜面共得到菌种约100株。

初筛:按标题1.3和1.4的方法,测定筛选得到的菌株转化2-吡咯烷酮溶液的转化结果,挑取转化率较高的菌株,筛选得到15株。

复筛:初筛得到的15株菌转化2-吡咯烷酮溶液,用标题1.5的方法测定转化率,用标题1.6的方法测定酶活力,其中转化率和酶活力较高菌株如表1所示。

注:酶活力单位μmol·h-1·OD-1

由表1可以看出,菌株HHSW-16转化率(93.33%)和酶活力(46.56μmol·h-1·OD-1)都是最高。因此,选择菌株HHSW-16为对象进行下一步发酵条件和转化条件的优化。

2.2 产酶菌株HHSW-16发酵条件的研究

2.2.1碳源对转化率和酶活力的影响

选择可溶性淀粉、甘油、柠檬酸、苹果酸、谷氨酸、反丁烯二酸、乳糖、蔗糖代替液体产酶培养基中的葡萄糖,其它成分不变,培养24 h,结果见表2。通过对比发现以葡萄糖为碳源时,转化率和酶活力最高,因此选择葡萄糖为碳源。

2.2.2氮源对转化率和酶活力的影响

选择大豆蛋白胨、牛肉膏、鱼蛋白胨、玉米浆、酵母粉、尿素、乙酸铵、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵用5 g·L-1的浓度代替液体产酶培养基中的2-吡咯烷酮和NH4Cl,其它成分不变,培养24 h,发现以尿素、乙酸铵、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵为氮源的培养基中菌体未生长,结果显示(表3),HHSW-16在有机氮源的情况下能很好生长,无机氮源情况下,基本不生长。氮源对转化率和酶活力的影响较大,综合考虑,以牛肉膏和酵母粉作为复合氮源比较适宜。

2.2.3 发酵培养基关键组分及其浓度的确定

2.2.3.1发酵培养基关键组分的确定

采用单因素法考察了葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、Na2HPO4·12H2O 、MgSO4、KH2PO4的浓度对菌株酶活力的影响。

由表4所示,葡萄糖、牛肉膏和酵母粉的质量浓度对菌株生长有显著的影响。因此,选取葡萄糖、牛肉膏和酵母粉这三种成分作为培养基组分的关键因素,无机盐对发酵酶活力和转化率的影响很小,所以培养基中无机盐的组成和含量保持不变。

2.2.3.2 响应面法确定菌株培养基关键组分的最优浓度

采用Box-Behnken设计原理,运用Design Expert软件对单因素筛选出的三个因素进行寻优。以酶活力为相应值Y,考察因子为葡萄糖、牛肉膏、酵母粉。实验设计及结果见表5,优化结果见图1。

由图1 可以得到,葡萄糖、牛肉膏和酵母粉的最优浓度为:葡萄糖11.50 g·L-1,牛肉膏6.35 g·L-1,酵母粉5.58 g·L-1。

2.2.4初始pH值对酶活力的影响

用氨水或盐酸改变优化后培养基的初始pH值,37℃培养24 h,测定酶活力。当初始pH值为5.0和10.0时HHSW-16未生长,培养获得的菌体测定其酶活力,结果显示(表6),pH值为7.0时,菌株HHSW-16具有最高的酶活力。

2.3 酶促转化反应条件的研究[8]

2.3.1 温度对转化反应的影响

以同一批在优化后的培养基中培养的菌体为研究对象。菌体37℃培养24 h后,6000 r·min-1离心10 min,收集菌体备用。用0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制2-吡咯烷酮溶液为10 g·L-1,调pH为7.0。取湿菌体1 g,加入到100 mL吡咯烷酮溶液中,200 r·min-1水浴振荡,转化2 h。调整不同的水浴温度,分别测定其转化率,结果见图2。由图2 可知,最佳反应温度为40℃。

2.3.2 pH值对转化反应的影响

以同一批在优化后的培养基中培养的菌体为研究对象。菌体37℃培养24 h后,6000 r·min-1离心10 min,收集菌体备用。分别用不同的缓冲液配制2-

吡咯烷酮溶液为10 g·L-1,使pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。取湿菌体1 g,分别加入到100 mL不同pH的吡咯烷酮溶液中,40℃水浴,200 r·min-1振荡,转化2 h。分别测定其转化率,结果见图3。由图3 可知,最佳反应pH值为7.0。

2.4 模型验证实验

将菌体接入优化后的培养基中,培养24 h后测定酶活力,离心,采用完整细胞法转化2-吡咯烷酮。取5 g湿菌体,加入用0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制的10 g·L-1 2-吡咯烷酮溶液500 mL,温度40℃反应6 h,测定其转化率。共进行5批次发酵转化实验,结果如表7所示。

3 结论

本研究中以2-吡咯烷酮为唯一碳源,通过初筛和复筛得到具有高效产4-丁内酰胺水解酶的菌株,编号为HHSW-16。利用Design export统计软件优化试验条件。结果表明优化后培养基组成为:葡萄糖11.50 g·L-1,牛肉膏6.35 g·L-1,酵母粉5.58 g·L-1,Na2HPO4·12H2O 5.0 g·L-1 ,KH2PO4 1.5 g·L-1,MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1,CaCl2·2H2O 10 mg·L-1,FeSO4·7H2O 8 mg·L-1,pH 7.0。转化反应的最佳条件为:温度40℃,pH值7.0。采用优化后的条件培养菌种和进行转化反应,底物2-吡咯烷酮转化率达到99%以上。

4 讨论

采用2-吡咯烷酮为唯一碳源筛选的方法,在筛选过程中发现很多菌株可以在选择性平板上生长,但是用茚三酮方法却测定不出酶活,很可能由于2-吡咯烷酮水解后产生的γ-氨基丁酸迅速进入后续代谢过程,而使菌株表现不出活力。

化学合成法生产γ-氨基丁酸,使用强酸碱反应条件剧烈,安全性较差;发酵法主要有:大肠杆菌谷氨酸-α-脱羧酶法和短乳杆菌补料发酵法,两者都需要价格较高的L-谷氨酸为原料,提取工艺比较复杂,一般都用到超滤膜除菌体和树脂吸附,生产成本高。本研究中以2-吡咯烷酮为原料,而2-吡咯烷酮为主要工业原料,廉价易得,反应简单,提取工艺简便,生产成本低,应用前景广阔。

HHSW-16菌株产生作用的酶的具体类型及作用机理尚不清楚,都将是下一步研究的重点。

参考文献

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3-氨基苯甲酰胺篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试生物

大白鼠:体重205~220 g, 雌雄动物分别分为4组, 每组5只。标准饲料喂食, 自由饮水。饲养环境温度23℃~27℃, 相对湿度55%~70%.

大白兔:体重2.2~2.6 kg, 4只, 雌雄皆有。标准饲料喂食, 自由饮水。饲养环境温度23℃~27℃, 相对湿度55%~70%.

英国短毛豚鼠:体重315~338 g, 24只, 随机分为试验组和阴性对照组, 每组12只。标准饲料喂食, 自由饮水。饲养环境温度23℃~27℃, 相对湿度55%~70%.

斑马鱼苗:体长2~3 cm, 购自沈阳市得胜鱼苗养殖场。在试验开始前, 设置10 d适应期, 使试验用鱼适应试验用水和实验室环境。同时观察鱼的日常状态, 分离表现异常的鱼。在鱼群背景死亡率低于5%后再进行试验。在正式试验前24 h停止喂饵。

鹌鹑:孵化后在沈阳顺发鹌鹑养殖场饲养18 d, 待能完全鉴别性别后引入实验室。鹌鹑饲以幼禽商品膨化饲料, 营养成分符合幼禽生理要求。鹌鹑于不锈钢笼具中饲养, 笼具规格60cm×32 cm×32 cm, 每笼10只, 雌雄分别饲养。在试验开始前设置7~10 d适应期, 使试验用鸟适应实验室环境。同时观察鸟的日常状态, 分离表现异常的鸟。

意大利成年工蜂:体重约0.10 g, 试验用蜂在试验前从蜂箱取出, 在试验环境中保持到第二天。饲养于40 cm×40 cm×40 cm的网纱蜂笼内, 用脱脂棉浸泡适量蜜水饲喂。设置1 d适应期, 使试验用蜂适应实验室环境。同时观察蜜蜂的日常状态, 分离表现异常的蜜蜂。

家蚕:2龄, 由中国农科院桑蚕研究所提供。家蚕以新鲜桑叶饲养, 营养成分符合稚蚕生理要求。试验用蚕于消毒培养皿中饲养, 饲养皿直径16 cm, 高2 cm, 每皿20条。在试验开始前设置1 d适应期, 使试验用蚕适应实验室环境。同时观察家蚕的日常状态, 分离表现异常的家蚕。

1.1.2 供试药剂

质量分数为0.5%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂, 山西科锋农业科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 急性经口毒性试验

将甲维盐用蒸馏水配成464, 1 000, 2 150, 4 640, 5 000 mg/kg不同浓度的水溶液, 一次经口灌胃, 灌胃体积为1 m L/100 g体重。灌胃前隔夜禁食, 自由饮水。灌胃后立即观察中毒表现, 2 h后喂食。记录中毒症状及死亡时间, 持续2周, 用Horn氏法计算LD50, 按“急性经口毒性分级标准”评价结果。

1.2.2 急性经皮毒性试验

甲维盐用蒸馏水配成215, 464, 1 000, 2 150 mg/kg不同浓度的水溶液。试验前一天, 用质量分数8%的硫化钠溶液在大鼠背部4 cm×5 cm区脱毛, 24 h后局部无损伤进行试验。试验时将甲维盐涂于脱毛区, 然后覆盖纱布及塑料薄膜, 橡皮膏固定。4 h后用温水清洗皮肤。给药后立即观察并记录中毒表现及死亡时间, 持续2周, 用Horn氏法计算LD50, 按“急性经皮毒性分级标准”评价结果。

1.2.3 急性皮肤刺激试验

甲维盐0.5 m L/只。染毒前一天, 用脱毛剂质量分数8%的硫化钠溶液在大白兔背部两侧2 cm×3 cm区脱毛, 然后用温水洗净脱毛剂, 观察24h, 局部无损伤用于试验。给药时将甲维盐0.5 m L涂于左侧脱毛区, 右侧为对照。然后覆盖纱布及塑料薄膜, 橡皮膏固定, 绷带包扎。染毒4 h后, 用温水清洗残留物, 观察记录1, 24, 48, 72 h局部皮肤反应。按“皮肤刺激反应评分”“皮肤刺激强度分级标准”评价结果。

1.2.4 眼刺激试验

甲维盐0.1 m L/只。将甲维盐0.1 m L直接加入4只大白兔左眼结膜囊内, 立即轻轻闭眼1 s, 以右眼为对照。24 h不冲洗。观察记录1, 24, 48, 72 h的眼睛反应。按“眼睛损伤程度评分”、“眼睛刺激分级标准”评价结果。

1.2.5 急性皮肤致敏试验

试验组:致敏及激发剂量均为甲维盐0.1 mL.

阴性对照组:仅给予激发接触。

阳性对照组:2, 4-二硝基氯苯, 致敏剂量15%, 激发剂量5%, 用橄榄油配制。试验时取0.1 mL.

a.致敏接触:试验前24 h, 用质量分数8%的硫化钠溶液在豚鼠背部左侧去毛2 cm×2 cm, 24 h后局部无损伤进行试验。试验时将甲维盐0.1 mL涂于脱毛区皮肤上, 然后覆盖纱布及塑料薄膜, 再以无刺激橡皮膏固定, 持续6h。第7 d及14 d以同样方法各重复1次。

b.激发接触:末次致敏后14 d进行激发接触。试验前24 h, 用质量分数8%的硫化钠溶液在豚鼠背部右侧去毛2 cm×2 cm, 24 h后局部无损伤进行试验。将甲维盐0.1 mL涂于脱毛区皮肤上, 然后覆盖纱布及塑料薄膜, 再以橡皮膏固定, 持续6 h.每日观察至12 d, 将出现红斑或水肿 (不论程度轻重) 的动物数除以动物总数, 求出动物致敏率。按“致敏率强度分级标准”评价结果。

1.2.6 斑马鱼毒性试验

根据《化学农药环境安全评价试验准则》[8] (以下简称《试验准则》) , 设置10.0, 14.68, 21.54, 31.62, 46.42 mg/L五个试验浓度, 并设1个空白对照组, 每组10尾鱼。试验组和空白对照组同时进行。准确称取样品配制成母液, 然后按设计浓度吸取母液, 加到试验用水中充分混匀, 每个浓度组设3个平行, 以不加试药为空白对照。将试验鱼放入试验缸和对照缸内, 每缸10尾。于试验开始后的4, 24, 48, 72, 96 h记录中毒症状和死亡数。

1.2.7 鸟试验

根据《试验准则》, 雌雄鸟类给药剂量20 000.0 mg/kg.bw, 每组鹌鹑雌雄各10只。试验组和空白对照组同时进行, 在试验前16 h停止给饵。将供试药剂按设计剂量以蒸馏水稀释后给药, 最高剂量组直接给药, 采用经口给药方法, 一次给足设计剂量, 给药体积0.1 m L/10g体重。给药后将试验鸟放回试验笼内, 2 h后恢复给食。每天上下午各观察1次, 记录鹌鹑中毒症状和死亡情况, 直至第14 d.鹌鹑死亡数据以改进Karber法进行统计处理, 求出LD50和95%置信区间。

1.2.8 蜂试验

根据《试验准则》, 设置0.30, 0.44, 0.65, 0.95, 1.39, 2.04, 3.00μg/μL七个试验浓度, 每组20只蜜蜂。同时设立空白对照组、溶剂对照组, 各组均设3个平行。以丙酮配制供试药剂溶液。将蜜蜂夹于两层塑料网纱中固定, 用微量注射器穿过网眼在蜜蜂前胸背板处点滴2.0μL药液, 滴毕将蜜蜂转移到20 cm×20 cm×20 cm的试验蜂笼中, 自由摄取蜂蜜水。试验组和溶剂对照组同时进行。染毒后在1, 2, 6和24 h进行观察并记录蜜蜂的中毒症状和死亡情况。蜜蜂死亡结果以Karber法进行统计处理, 计算出LD50.

1.2.9 蚕试验

根据《试验准则》, 设置1.0, 1.8, 3.24, 5.83, 10.50 mg/L等5个药液浓度, 每个处理20条家蚕, 同时设计空白对照组。试验组和空白对照组均设3个平行。将供试药剂按设计浓度配制成药液, 以设定浓度药液定量浸渍桑叶, 以6 m L药液浸渍6 g桑叶, 晾干后用染毒桑叶饲喂家蚕, 整个试验期间饲喂处理桑叶。给药后观察并记录家蚕的中毒症状和死亡情况。每天上下午各观察2次, 记录家蚕4 h, 12 h, 24 h, 48 h中毒症状和死亡情况。以概率单位法进行统计处理, 求出LC50和95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性试验

大鼠经口给药后, 4640, 5000 mg/kg剂量组雌雄动物洗脸、活动减少, 3 h后恢复。余剂量组动物, 未见明显异常反应, 所有受试组无1例死亡。LD50为雌雄均大于5000mg/kg.

2.2 急性经皮毒性试验

大鼠经皮给药后, 各剂量组动物均未见明显异常反应。因此认为在该测试中LD50均大于2 000 mg/kg.

2.3 急性皮肤刺激试验

大白兔皮肤经涂甲维盐0.5 mL后, 局部皮肤在观察期内无红斑及水肿形成, 其皮肤刺激反应平均积分为0.

2.4 眼刺激试验

大白免眼结膜囊内加入甲维盐及冲洗后, 表现出不适感, 闭眼, 1 h后结膜轻度充血, 水肿;24 h后消退, 恢复。虹膜, 角膜无明显反应。

2.5 急性皮肤致敏试验

阳性组致敏率为100%.甲维盐经激发接触, 观察于12 d后, 再次激发接触, 仍未见红斑及水肿, 其致敏率为0.

2.6 斑马鱼毒性试验

在96 h的试验期间, 试验鱼接触药液后, 游动减缓、侧翻失衡。根据数据进行统计处理, 甲维盐对斑马鱼毒性结果为:LC50 (96 h) 为27.01 mg/L, 95%置信区间为21.32mg/L~34.21 mg/L.

2.7 鸟试验

染毒后雌雄鸟类未出现明显急性中毒症状。

LD50>2000.0mg/kg.bw.

2.8 蜂试验

染毒后各剂量组蜜蜂出现不同程度的中毒症状。表现为乏力、迟钝、失去飞翔能力。甲维盐对蜜蜂的LD50 (48 h为1.96μg/蜂, 95%置信区间为1.66~2.32μg/蜂。

2.9 蚕试验

在饲喂染毒桑叶4 h后, 中毒家蚕出现口吐清水、体态成S型等中毒症状。甲维盐对家蚕48 h LC50为1.8mg/L, 95%置信区间1.09~2.95 mg/L.

3 结果及讨论

3.1 结论

质量分数0.5%的甲维盐微乳剂对大鼠经口LD50雌雄均大于5000 mg/kg, 经皮LD50雌雄皆大于2000 mg/kg, 大白兔皮肤刺激积分为0, 大白兔眼睛加药不冲洗刺激积分指数为0, 豚鼠皮肤致敏百分率为0, 按“农药毒性分级标准”评价, 甲维盐经口、经皮属低毒农药, 对皮肤无刺激性, 加药不冲洗对眼睛无刺激性, 属弱致敏物。试验结果表明, 甲维盐对人畜低毒, 风险性较低。

在环境安全性测试上, 根据《化学农药环境安全评价试验准则》的规定, 对鱼表现为“低毒级”, 对鸟低毒, 对蜜蜂为“中毒级”, 对桑蚕为“高毒级”。试验结果表明, 质量分数0.5%的甲维盐微乳剂对蚕毒性较高, 风险性较高, 但对鱼和鸟较安全。

3.2 讨论

浙江大学魏方林、朱国念等以及浙江农科院苍涛、赵学平等分别测试了甲维盐乳油对环境生物的急性毒性, 发现该药剂对鹌鹑中毒或高毒, 对蜜蜂剧毒或高毒, 对家蚕剧毒, 对斑马鱼高毒, 而本试验中测得甲维盐微乳剂对环境生物的毒性分别为:对鹌鹑低毒, 对蜜蜂中毒, 对家蚕高毒, 对斑马鱼低毒。可以看出, 相比于乳油, 甲维盐微乳剂的毒性有所下降, 这说明通过改变加工剂型, 可以使农药毒性降低。此外, 微乳剂也是一种环境相容性较好的水基化剂型, 相比于乳油, 微乳剂以水为基质, 避免了乳油产品中大量使用有机溶剂造成环境污染和产生药斑、锈斑的问题, 同时在运输、贮藏、使用上具有高度安全性。因此, 微乳剂是高毒、高污染农药剂型理想的替代剂型。

研究结果表明, 质量分数0.5%的甲维盐微乳剂对鸟类、鱼类毒性较低, 而对家蚕和蜜蜂毒性较高, 尤其是对家蚕表现为高毒级。因此田间使用该农药时应避免在蜜源作物开花期、有授粉蜂群的大棚及其他有蜂群采粉区施用, 远离桑园, 勿在桑园的上风向使用, 防止该药飘移、沉降至桑叶上对家蚕造成危害。

参考文献

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3-氨基苯甲酰胺篇7

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐是阿维菌素的高活性衍生物, 通过阻碍害虫运动神经信息传递而使身体麻痹死亡, 在土壤中易降解、无残留, 不污染环境, 具有超高效、低毒、低残留、无公害等优点, 符合无公害农业生产需求[5,6,7,8,9]。而且它对鳞翅目害虫 (如甜菜夜蛾、棉铃虫、黏虫等) 及蚜虫、斑潜蝇、棉红蜘蛛等农田常见害虫均具有一定毒力和防效。

笔者于2008年7月, 结合生产实际, 选用河北威远生物化工股份有限公司研制生产的1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油进行了小区药效试验, 明确了该药剂的最佳使用剂量、防治效果及其使用技术, 现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂:1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油 (河北威远生物化工股份有限公司产) ;1.8%阿维菌素乳油 (华北制药集团爱诺有限公司制造) 。供试烟草品种为中烟90。

1.2 试验地概况

试验地选择在河北省沧县姚官屯乡豆店村, 试验田土壤为壤土, p H值7.3, 有机质含量1.6%, 土壤肥力中上等, 0~20 cm土壤含水量为21%。试验地烟草长势旺盛。

1.3 试验设计

试验共设5个处理, 分别为:1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油200 m L/hm2 (A) 、300 m L/hm2 (B) 、450 m L/hm2 (C) ;1.8%阿维菌素乳油337.8 m L/hm2 (D) ;以喷清水作对照 (CK) 。重复4次, 随机区组排列, 小区面积20 m2, 并设有保护行。

1.4 试验实施

于7月22日下午, 在烟草烟青虫发生盛期用药1次, 试验当天气温22.7~32.1℃, 风力1~2级, 多云见晴。使用山东卫士喷雾器对水675 kg/hm2均匀喷雾, 喷雾器压力0.2~0.4 MPa, 喷孔直径1.5 mm。试验期间未防治其他病虫害, 其他管理同常规田。试验及调查期间有3次降雨, 降雨量分别为51.8、1.6、2.1 mm, 气温21~34℃。

1.5 调查内容与方法

1.5.1 虫口减退率与防效。

药前调查烟青虫虫口基数, 药后3、10 d分别调查防效。采用5点取样法, 每个小区记录20株烟草上不同龄期的活虫数。计算虫口退减率和防效, 并采用Duncan′s新复极差法进行差异显著性测验。

虫口减退率 (%) = (施药前虫数-施药后虫数) /施药前虫数×100

防效 (%) = (处理区虫口减退率-空白对照区虫口减退率) / (100-空白对照区虫口减退率) ×100

1.5.2 安全性。

药后3、10 d观察药剂处理区烟草有无药害, 记录药害的类型和程度。每个小区选5点取样, 考查药剂处理区与常规对照区及各处理之间烟草长势有无差异。每个小区选5点取样, 调查1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油对其他病虫害的影响。

2 结果与分析

2.1 防效

从表1可以看出, 烟田使用1%甲氨基阿维菌素乳油后对烟田烟青虫具有较好的防治作用。施药后3 d, 处理A、处理B、处理C和处理D对烟草烟青虫的防效分别为67.2%、80.9%、93.9%和81.8%。经方差分析表明, 处理C对烟草烟青虫的防效最高, 极显著高于其他各处理;处理B和处理D防效相当, 无显著性差异, 同时极显著高于处理A。药后10d, 各处理对烟草烟青虫的防效均显著上升。处理A、处理B、处理C和处理D对烟草烟青虫的防效分别为97.7%、100.0%、100.0%和100.0%。经方差分析得出, 处理B、处理C和处理D防效相当, 差异不显著;处理A防效低于处理B、处理C、处理D, 差异极显著。

2.2 安全性

经目测观察, 各施药区烟草生长正常, 无明显的药害症状, 表明在所试药量范围内, 1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油对烟草生长安全。

3 结论与讨论

甲氨基阿维菌素作为一种新型高效、低毒、广谱无公害的农药, 具有胃毒作用并兼有一定的触杀作用。本试验证明试验药剂1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油对烟草烟青虫有良好的防治效果, 与常规对照药剂1.8%阿维菌素乳油的防治效果相当。该药剂稳定性强, 药效可持续10 d以上, 而且对施用作物烟草安全, 无药害。因此, 建议生产中可推广使用1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油防治烟草烟青虫, 施用剂量为200~450 m L/hm2。

摘要：对1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油防治烟草烟青虫进行了田间药效试验。结果表明, 1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油对烟青虫有良好的防治效果, 药效可持续10 d以上, 与对照1.8%阿维菌素乳油的防治效果相当。在剂量为200～450 mL/hm2时, 药后10 d的防效均达到97.7%以上, 虫口减退率也均达到97.4%以上, 且对烟草安全, 建议生产中施用剂量为200～450 mL/hm2。

关键词：1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油,烟青虫,防效

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3-氨基苯甲酰胺篇8

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在含山县环峰镇城北村棉地进行。试验地属马肝土, 土壤中有效氮、磷、钾含量分别为309.8、27.0、742.0 mg/kg, pH值6.2, 有机质含量21.435 g/kg。前茬为空闲田。2012年4月8日育苗, 5月25日移栽。移栽时, 施45%复合肥600kg/hm2、氯化钾150 kg/hm2作基肥, 7月8日追施尿素150kg/hm2、氯化钾150 kg/hm2作花铃肥。2012年8月12日施药1次, 施药时正值4代棉铃虫低龄幼虫盛期。

1.2 试验材料

供试药剂:5.7%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水分散粒剂 (江西天人生态股份有限公司提供) 、4.5%高效氯氰菊酯乳油 (连云港市东金化工有限公司提供) 。供试棉花品种:金杂棉6号。

1.3 试验设计

试验共设5个处理, 分别为5.7%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水分散粒剂53 g/hm2 (A) 、79 g/hm2 (B) 、105 g/hm2 (C) , 4.5%高效氯氰菊酯乳油667 g/hm2 (D) , 以清水作对照 (CK) 。4次重复, 小区面积30 m2, 各小区设隔离行。按小区用药量对水均匀喷雾, 实际用药液量900 kg/hm2, 保证全株喷透。同一药剂由低剂量处理向高剂量处理逐小区进行, 不同药剂处理间施药前均用清水洗涤喷雾器。空白对照区喷等量清水。施药器械为山东卫士WS-16型背负式手动喷雾器, 工作压力0.2～0.3 MPa, 喷孔口径为0.7 mm。

1.4 试验期间气象条件

施药当日晴, 无风, 气温为26.2～32.2℃, 平均28.9℃, 相对湿度82%。试验期间雨日3 d, 雨量26.9 mm。试验期间的气候条件对试验药剂无明显影响。

1.5 调查方法

2012年8月12日调查药前基数;8月13日 (药后1 d) 、8月15日 (药后3 d) 、8月19日 (药后7 d) 共进行3次药效调查。在每个小区中间数行挂牌固定5点, 每点定查5株棉花, 每小区共计调查25株棉花。调查各小区定点棉株上的残存棉铃虫活虫数, 计算防效。药效计算公式如下[3]:

2 结果与分析

2.1 安全性

药后观察, 各处理区棉花生长正常, 说明试验药剂在其设计范围内对棉花安全。

2.2 防治效果

2.2.1 药后1 d防治效果。

由表1可以看出, 施药后1 d, 处理A、B、C防效分别为69.69%、80.01%、82.68%, 处理D防效低于处理A、B、C, 但各处理间差异不显著。

2.2.2 药后3 d防治效果。

由表2可以看出, 施药后3 d, 处理A、B、C防效分别为74.61%、84.96%、90.11%, 其中处理A与处理B、C在5%水平上差异显著, 处理B与处理C在1%水平上差异显著。处理D防效低于处理A、B、C, 且与处理C在5%水平上差异显著。