抑制剂浓度

关键词：

抑制剂浓度（精选六篇）

抑制剂浓度 篇1

关键词：姜黄素,人肝癌细胞,四甲基偶氮唑盐

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 在肿瘤发病率中列第3位[1]。肝癌一旦确诊, 多数属于中晚期, 常用的放化疗方法虽有一定疗效, 但患者常因严重的不良反应而放弃治疗, 目前抗肿瘤的热点集中于寻找高效低毒的中药制剂进行治疗。姜黄素是从姜黄中提取的有效成分, 具有不良反应小、价格低廉等优点, 以往研究表明, 其对胃癌、皮肤癌、结肠癌等均有一定抑制作用[2]。本实验主要研究姜黄素在体外对人肝癌细胞Hep G2的抑制效果, 探讨姜黄素的抗肿瘤活性, 以期为姜黄素的体内活性及临床应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

二氧化碳培养箱:美国Forma公司;Olympus倒置显微镜:日本Olympus公司;BioRAD550全自动酶标仪:美国伯乐公司;台式高速低温离心机5810R型:美国Eppendorf公司;四甲基偶氮唑盐 (MTT) :美国Sigma公司;RPMI-1640培养基:美国Gibco公司;小牛血清 (FBS) :杭州四季青;无水二甲基亚砜 (DMSO) 、分析纯:美国Sigma公司;胰酶:美国Sigma公司;姜黄素 (含量>80%) :美国Sigma公司;人肝癌细胞株Hep G2:上海生物制品研究所, 液氮中冻存保种。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

采用加入小牛血清 (FBS) 并含双抗的RPMI-1640培养基培养人肝癌细胞株Hep G2, 置于37.5℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中, 72 h后细胞贴壁生长, 用0.25%胰酶直接吹打法将贴壁生长的细胞传代, 每1~2天更换1次培养基, 取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 分组

空白对照组:以RPMI-1640培养基和细胞 (含0.1%DMSO) 为对照;实验组:姜黄素粉剂用少量DMSO溶解, 配制浓度分别为10、20、30、40、50µg/ml, 每孔加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培养基、细胞和相应浓度的姜黄素。

1.2.3 细胞形态学观察

加药培养48 h后, 将各组的肝癌细胞Hep G2在倒置显微镜下放大200倍观察细胞变化并拍照。

1.2.4 MTT检测药物对细胞株增殖的影响

按预实验结果, 将Hep G2细胞株以浓度为1×104个/ml的密度接种于96孔培养板中, 于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中, 培养24 h后加入不同浓度的姜黄素溶液200μl/孔, 每组设6个平行孔。作用48 h后, 每孔加入5 mg/ml MTT溶液20μl, 作用4 h, 弃上清, 加入DMSO溶液150μl/孔振荡10 min。采用酶标仪于490 nm波长, 空白孔调零, 测定吸光度, 并计算细胞生长抑制率IR= (1-实验组吸光度/对照组吸光度) ×100%。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

空白组细胞轮廓清晰, 形态伸展, 成对数生长, 见图1 (1-1) 。实验组细胞体积缩小呈圆形, 与周围的细胞脱离, 生长受到抑制。不同浓度姜黄素 (10、20、30、40、50 ug/ml) 对细胞影响见图1 (1-2~1-6) 。

2.2 MTT法测定姜黄素对肝癌细胞株Hep G2的增殖抑制率

姜黄素作用48 h后, 用MTT法测定光密度后, 计算药物对细胞的抑制率, 结果见表1, 抑制曲线见图2。结果可见, 不同浓度姜黄素 (10、20、30、40、50µg/ml) 的抑制率分别为43.7%、53.0%、66.2%、78.1%、84.6%。与空白对照组比较, 各实验组对肝癌细胞Hep G2均有明显的抑制作用。

3 讨论

目前, 恶性肿瘤发病率极高, 肿瘤药物在抑制肿瘤细胞生长的同时, 机体也会受到药物的损害, 因此寻找高效低毒的中药治疗势在必行[3]。本实验主要采用细胞形态学观察与MTT法相结合, 研究了姜黄素在体外对人肝癌细胞Hep G2的抑制效果。结果表明, 姜黄素体外可明显抑制肝癌细胞Hep G2的增殖, 并且这种抑制作用有量效关系, 以上实验其结果为姜黄素这种低毒的中药成分用于体内的抗肿瘤活性研究提供了科学依据, 是临床药物开发的基础研究。

参考文献

[1]刘允怡.肝癌治疗新进展[J].临床外科杂志, 2007, 15 (1) :2-5.

[2]潘国凤.姜黄素抗肿瘤作用及其机制研究最新进展[J].中药药理与临床, 2007, 23 (5) :243-244.

抑制剂浓度 篇2

LYCD是酵母细胞在外界恶劣环境中正常生长受到胁迫而应激产生的保护性物质, 因此实验研究了啤酒废酵母在生长受到锰、铁抑制下应激产生LYCD活力情况。为拓宽发酵工业废酵母、废液回收与利用途径;为降低LYCD制取成本、丰富LYCD制品、拓展其应用研究 (不同应激条件下得到的LYCD应用范围与前景也不相同) 奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

啤酒废酵母 (LYCD制备菌种) 与啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae, LYCD活性测定菌种) :重庆啤酒集团宜宾分公司提供。

1.1.2 试剂

MnSO4、FeCl3 (AR, 天津市光复精细化工研究所) 。

1.1.3 仪器与设备

离心机 (TGL-160C, 上海安亭科学仪器厂) ;摇床培养箱 (HZQ-QX, 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) ;紫外可见分光光度计 (T6新世纪, 北京普析通用仪器有限责任公司) ;灭菌锅 (LDZX-75KBS, 上海楚定分析仪器有限公司) ;电子分析天平 (AR2130, 奥豪斯国际贸易有限责任公司) 。

1.1.4 培养基

啤酒厂废液:从重庆啤酒集团宜宾分公司发酵车间排污渠提取。

1.2 方法

1.2.1 废液几个指标测定

废液经4 000r/min离心3min以后, 取上清液作为培养基进行测定。废液锰、铁含量采用紫外分光光度计法[2,3];测定总氮、总碳含量分别为凯氏定氮法与还原糖法[4]。各测定3次, 取平均值。

1.2.2 废酵母生长曲线的测定

1.2.2.1 空白对照生长曲线:

取啤酒废酵母以6% (w/w) 的接种量接种到装有50ml啤酒废液培养基500ml锥形瓶中, 在28℃下170r/min振荡培养, 在培养到5、7、9、15、19、22、24、28、30、32、34、36、38h时依次取样, 稀释10倍后, 测定培养物的OD600值。绘制生长曲线, 确定应激起始时间 (在对数期中) 。

1.2.2.2 加Mn2+生长曲线:

在啤酒废液中加入MnSO4, 使Mn2+离子浓度梯度分别为200、250、300mg/L, 并在废液中加入硫酸, 使SOundefined浓度一定, 其余步骤同1.2.2.1。由于培养基pH变动很小, 可略去酸度变化影响。

1.2.2.3 加Fe3+生长曲线:

在啤酒废液中加入FeCl3, 使Fe3+离子浓度梯度分别为50、70、90mg/L, 并在废液中加入盐酸, 使Cl-浓度一定, 其余步骤同1.2.2.1。同样由于培养基pH变动很小, 可略去酸度变化影响。

1.2.3 金属离子浓度确定

1.2.3.1 废酵母培养:

取经无菌水反复洗涤与离心的啤酒废酵母, 以6% (w/w) 的接种量接种到装有50ml啤酒废液培养基的500ml锥形瓶中, 在28℃、170r/min摇床振荡培养28h, 得酵母培养液。

1.2.3.2 应激培养基制备与应激:

在酵母培养液中添加不同量的金属离子, 使Mn2+浓度分别为180、200、220、240、260、280mg/L, 在37℃[5]下应激培养25min, 取出得Mn2+应激培养液;Fe3+浓度分别为 40、50、60、70、80、90mg/L, 在37℃下应激培养45min, 取出得Fe3+应激培养液。各酵母应激培养基按1.2.2方法补足阴离子浓度水平。

1.2.3.3 废酵母收集与自溶:

应激培养液在4 000r/min离心5min, 取沉淀再无菌水洗涤后再离心, 反复3次。收集到的菌体按文献[6]进行处理, 得酵母自溶液。

1.2.3.4 LYCD提取与活性测定:

自溶液放入离心机中4 000r/min离心5min, 取上清液测定各自溶液Mn2+或Fe3+含量;再取上清液按文献[7,8]方法测定啤酒酵母菌悬液培养前后吸光度变化值, 得△OD1。

1.2.3.5 对照组与评价指标:

鉴于废酵母对金属离子有一定吸附作用, 而且各个自溶液Mn2+或Fe3+含量不一致, 会对LYCD活性测定有一定影响, 采用以下方法进行抵消。

①Mn2+应激培养对照:取1.2.3.1中酵母培养液, 在37℃下再应激培养25min;按1.2.3.3、1.2.3.4得自溶液上清液;测定上清液Mn2+含量;对应1.2.3.4中测定的各Mn2+含量加入Mn2+, 使Mn2+水平在对应点上相同;再按1.2.3.4测定吸光度变化值, 得△OD2。

②Fe3+应激培养对照:取1.2.3.1中酵母培养液, 在37℃下再应激培养45min;按1.2.3.3、1.2.3.4得自溶液上清液;测定上清液Fe3+含量;对应1.2.3.3中测定的各Fe3+含量加入Fe3+, 使Fe3+水平在对应点上相同;再按1.2.3.4测定吸光度变化值, 得△OD2。以各点△OD=△OD1—△OD2作为评价指标, 对比各检测点应激废酵母产LYCD活性大小。

1.2.4 金属离子作用时间确定

分别以220mg/L Mn2+、60mg/L Fe3+浓度作用于培养到对数生长期的废酵母细胞, 变化作用时间为10min、15 min、20min、25 min、30min、35 min、40min、45 min、50min。其余废酵母培养、应激温度、菌体收集与自溶、LYCD提取与活性测定、对照组制作、评价指标同1.2.3。

2 结果与分析

2.1 废液

从啤酒厂发酵车间排出的啤酒废液中的Mn2+、Fe3+浓度分别为0.3588mg/L、1.4653mg/L, 废液碳源含量1.1%、氮源含量0.056%。从两种金属离子浓度来看, 基本处于较低的浓度水平。以本文的结果来衡量, 两者的浓度水平基本起不到影响啤酒废酵母产生高活力LYCD的效果。从废液的另两个指标来看, 碳源、氮源含量却比一般的土豆培养基 (1 000ml水中加入200g去皮捣碎土豆, 煮沸后过滤定容到1 000ml。) 还高。因此, 前景上可以从利用废液的营养成分来培养废酵母, 而兑入某种高浓度金属污水来达到作用浓度水平的角度去思考。

实验将废水中金属离子浓度作为参考, 添加金属离子来达到实验需要的作用浓度。

2.2 生长曲线

加Mn2+与空白的对照生长曲线如图1所示。

从“空白”线可以看到, 啤酒废酵母也呈现一般酵母的生长趋势。废酵母0～24h为生长的延迟期, 在24h进入对数生长期, 在24～34h OD值迅速升高, 至38h OD值保持在一个相对稳定的数值, 而后OD值缓慢下降趋势, 进入衰亡期。废酵母经历较长的延迟期可能跟菌种老化和所用的培养基是废液有关。

从三条“加Mn2+”线可以看到, 当Mn2+浓度在250～300mg/L时, 都对啤酒废酵母有不同程度的生长抑制, 抑制程度为200mg/L﹤250 mg/L﹤300mg/L。但三条曲线基本上都反应出啤酒废酵母的对数生长期, 说明在该浓度范围不能完全抑制废酵母的生长。

图2是加Fe3+与空白的对照生长曲线。可看到, 当Fe3+在50～70 mg/L范围时, 对啤酒废酵母的生长有抑制;当Fe3+在70～90mg/L时, 对啤酒废酵母的生长有明显的抑制。但从整体来看, Fe3+对啤酒废酵母的生长抑制不如Mn2+。如果再增加FeCl3的浓度, 在培养基中会产生较明显的浑浊。

综上所述, 以空白对照生长曲线为参考, 选取酵母培养后28h作为应激起始时间, 这时废酵母在废液中处于对数中期, 有利于应激[5]。选取Mn2+在200mg/L～280mg/L、Fe3+在50～90mg/L高浓度范围, 这时该两种离子对废酵母产生生长抑制, 而增加Mn2+在180mg/L与Fe3+在40mg/L作为对比参考点。

2.3 金属离子浓度

Mn2+浓度对LYCD活力的影响见图3。可看到, △OD随Mn2+离子浓度的增加有先上升后又减少的趋势, 当Mn2+离子浓度为220 mg/L时, 可使△OD达到最高值。在实验中发现, 废酵母会对Mn2+产生约10% (w/w) 左右的吸附。虽然用无菌水多次洗涤与离心, 仍然有一定量的游离Mn2+存在于废酵母自溶提取液中。

从图3可以推断, 在生长抑制浓度下, 由于Mn2+浓度不同对废酵母产的LYCD活性影响也不同。浓度较低时, 对废酵母抑制不强, 导致废酵母产的LYCD活性也不强;浓度较高时, 对废酵母抑制强, 有可能使废酵母致死率提高, 而导致废酵母产的LYCD活性也不强。

图4是Fe3+浓度对LYCD活力的影响。可看到, △OD随Fe3+离子浓度的增加有先上升后又平稳的趋势, 当Fe3+浓度为60 mg/L时, △OD基本达到高水平。由于Fe3+在40～90mg/L高浓度范围对废酵母生长抑制没有Mn2+强, 表现出的废酵母产的LYCD活性也比Mn2+弱。同样地, 废酵母也会对Fe3+产生一定量吸附。

因此, 分别选取Mn2+、Fe3+分别为220mg/L、60mg/L作为应激浓度是适当的。

2.4 金属离子作用时间

两种离子不同作用时间对废酵母细胞产生LYCD的影响结果见图5。

由图5可知, 在10～35min内、Mn2+浓度一定的情况下, 随着应激时间的延长, △OD值先增大后减小。当Mn2+应激时间为25min时, △OD为最大值;在30～55min内、Fe3+浓度一定的情况下, 随着应激时间的延长, △OD值先增大后平稳。当Fe3+应激时间为45min时, △OD可达到最大水平。

当酵母细胞在一定的金属离子浓度下, 在高温下随着应激时间的延长, 金属离子作用酵母细胞产生的LYCD活力越来越大;而当应激时间超过一定的范围后, Mn2+作用产生的LYCD的活性却逐渐减小, 可能跟废酵母长时间在高浓度Mn2+下发生生长、代谢或死亡率变化有关。但Fe3+未见这种趋势, 可能在该Fe3+浓度下, 废酵母能较长时间耐受。从这个方面来看, Mn2+确实比Fe3+刺激效果更强。但要看到, 从应激浓度方面上, Mn2+比Fe3+也要求高得多。

因此, 可选取Mn2+对酵母细胞最佳作用时间是25min;Fe3+对酵母细胞最佳作用时间是45min。

3 讨论

LYCD是包含的有低分子多肽和各种应激蛋白的混合物, 还含有少量的氨基酸、维生素及矿物质, 对其活力因素的探讨目前主要集中在谷胱甘肽 (GSH) 含量、超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 活性大小等方面。大多数金属离子 (包括锰、铁离子) 对酵母细胞的抑制与毒副机制目前也还不清晰。

Qiu Liang和Bin Zhou[9]研究了锰离子对酵母细胞凋亡的作用, 其结果为当锰离子浓度为4mmol/L (约220mg/L) 时, 酵母细胞存活率为80%～90%。以其生长曲线来对比, 当锰离子浓度为4mmol/L时, 酵母细胞能在8～12h达到对数期, 与本实验结果有较大的差距。另外, S. Anastassiadis等[10]研究了酵母 (C. oleophila) 在不同铁离子浓度下的生长情况, 在铁离子浓度为1 000μmol/L (约56mg/L) 下, 酵母未发现受到生长抑制。这些都可能是由于实验采用酵母的状况与种类、培养基成分以及实验方法不同所造成。

锰对谷胱甘肽还原酶 (glutathione reductase) 有一定的抑制作用[11], 锰铁对SOD也有一定的抑制作用[1]。但Amit R. Reddi等[12]研究了锰对酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 抗氧化应激的保护作用, 表明即使在Cu/Zn超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase) 缺乏的情况下, 酵母胞内较高浓度的锰仍然使酵母具有高的抗氧化活性, 这种保护机制可能是通过锰作用于Nramp transporters产生的, 而铁也有类似的作用机制[13]。三价铁离子也与多种蛋白类有关系, 酵母存在Fe3+/ Fe2+氧化还原电子链[14], 因此三价铁离子作用也很可能主要通过亚铁离子作用表现出来。亚铁离子与亚铁血红素 (heme) 、SOD、CAT、过氧化物酶 (peroxidase) 、脂类氧化产物等有关[15], 其中heme对锰过氧化物酶 (manganese peroxidase) 又有影响[16], 使得从酵母培养物中提取manganese peroxidase成为可能。虽然其中的机理有的还很不清楚, 但由此可以看到锰铁对酵母的影响与作用的复杂性。

本实验采用外加离子并考虑了所加阴离子浓度不同可能对结果的影响, 采用在测定LYCD活性的过程中, 使各检测点金属离子浓度一致, 从而提高了对单一金属离子探讨、测定LYCD总活性的准确性。对于金属离子应激的LYCD具有怎样的应用价值, 该方法在废液处理应用的前景, 以及金属离子应激酵母产生高活性LYCD作用机理等问题, 还需进一步研究。

总之, 以废液作为培养基, 在37℃高温应激下, 培养基中金属离子Mn2+、Fe3+浓度以及作用时间长短对啤酒废酵母产生LYCD的活力大小有影响。通过研究可以得出, (1) 在28℃下, 废酵母在废液中培养28h可达到生长对数期; (2) 当废液中Mn2+、Fe3+浓度分别达到200mg/L、50 mg/L时可对废酵母产生生长抑制; (3) 当Mn2+、Fe3+的浓度分别为220mg/L、60 mg/L、作用时间分别是25、45min时, 啤酒废酵母产的LYCD活力强。

摘要：目的:探讨锰铁离子对啤酒废酵母产生活性酵母细胞衍生物 (LYCD) 的活力影响。方法:以啤酒废酵母为研究对象、以废液为培养基, 在生长抑制浓度下, 分别研究了锰、铁离子的作用浓度与时间对啤酒废酵母产生LYCD的活力影响。结果:废酵母在废液中培养28h可达到对数生长期;当废液中Mn2+、Fe3+浓度分别达到200mg/L、50mg/L时可对废酵母产生生长抑制;当Mn2+、Fe3+的作用浓度分别为220mg/L、60mg/L、应激时间分别是25、45min时, 啤酒废酵母产的LYCD活性强。结论:应激培养基中金属离子Mn2+、Fe3+达到一定浓度, 在一定时间下可使废酵母产生强活力的LYCD。

抑制剂浓度 篇3

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2010年1月至2011年3月在我院行门诊产前检查健康妊娠妇女1000例。年龄为19～36岁,月经周期规则,胎次1～5次,均为单胎,孕周6～11周。B超检查见孕囊位于宫腔内,形态结构正常,可见胎心。既往无原发性高血压、心脏病、肾病、糖尿病等内、外科合并症,孕期无特殊用药史,无子宫畸形、感染、放射线及化学物质接触史。妇科检查均排除阴道炎症、宫颈糜烂和宫颈息肉及子宫、卵巢肿瘤等。

1.2 方法

1.2.1 观察方法

对1000例孕妇分别于孕6～8周或孕8～10周进行血清抑制素A和激活素A的测定,并随访孕妇至孕13周。根据妊娠情况分为正常妊娠、出现先兆流产但可继续妊娠、难免流产、稽留流产以及无症状自愿放弃妊娠等情况。本研究只选取妊娠情况为正常妊娠和稽留流产者做为正常妊娠组和稽留流产组。因为研究[3,4]发现,孕早期母体血清激活素A、抑制素A水平持续在较低稳定水平,孕8周开始逐渐上升,故根据采血时间将两组数据以8周为界进行统计分析,分别对两组妊娠6～8周和妊娠8～10周的血清抑制素A、激活素A的浓度水平进行比较,并比较两者的临界值、敏感性和特异性。流产的诊断标准参照乐杰主编的高等医学院校教材《妇产科学》第6版。

1.2.2 标本的采集与处理

抽取孕妇的前臂肘正中静脉血2～5 ml,置于未加抗凝剂的干燥玻璃试管中,室温下静置1小时,1000 r/min离心5分钟,取上清,编号保存于-2O℃冰箱待测。

1.2.3 血清抑制素A、激活素A测定方法

采用酶联免疫法(ELISA)测定,试剂盒均购自R&D公司。抑制素A、激活素A批内与批间变异系数均应分别小于9%和11%。具体试验步骤见试剂盒说明书。以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以均数±标准差undefined表示。计量资料之间比较用t检验。样本率的比较采用χ2检验。以α=0.05为显著性检验水准,P<0.05为差异有统计学意义 。

2 结 果

2.1 随访结果

1000例孕早期孕妇追踪至孕13周,其中正常妊娠者681例,出现先兆流产但经过干预后继续妊娠者75例,先兆流产发展为难免流产者40例,稽留流产102例,自愿放弃妊娠者32例,随访丢失70例。选取正常妊娠者和稽留流产者共783例做为研究对象,其中正常妊娠组中抽血时间于妊娠6～8周者392 例,8～10周者289例;稽留流产组抽血时间位于6～8周者36例,8～10周者66例。

2.2 一般情况的比较

稽留流产组和正常妊娠组的平均年龄、入选孕周、平均孕次、平均产次的比较,差异均无统计学意义(P>O.05)。见表1。

2.3 血清抑制素A和血清激活素A水平比较

正常妊娠组孕8～10周(289例)的血清抑制素A和血清激活素A水平均高于孕6～8周(392例),差异有高度统计学意义(t1=9.97,P1<0.01;t2=11.03,P2<0.01)。正常妊娠组孕妇血清抑制素A和血清激活素A水平在孕6～8周和孕8～10周均明显高于稽留流产组,差异有高度统计学意义 (P<0.01)。见表2。

2.4 血清抑制素A、激活素A预测孕早期稽留流产的敏感性及特异性

正常妊娠组中抑制素A的95%可信区间的下限为230 ng/L,以<230 ng/L为血清抑制素A的临界值,其预测孕早期稽留流产的敏感性为84.8%,特异性为77.4%。正常妊娠组中激活素A的95%可信区间的下限为162 ng/L,以<162 ng/L为血清激活素A的临界值,其预测孕早期稽留流产的敏感性为85.0%,特异性为88.7%。对血清抑制素A和血清激活素A预测孕早期稽留流产的敏感性和特异性做比较,差异均无统计学意义undefinedundefined

3 讨 论

抑制素与激活素是TGF-β超家族的成员,主要由垂体细胞和性腺细胞分泌,孕期则主要由胎盘分泌,属于糖蛋白类激素。研究发现,孕早期母体血清激活素A水平持续在较低稳定水平,孕8～24周开始逐渐上升,妊娠足月达到最高峰;而抑制素A水平在孕8～10周达到第一个高峰,孕14～30周相对稳定,孕晚期至足月又逐渐上升,分娩时达最高水平[3,4]。我们的研究发现,正常妊娠组孕8～10周的血清抑制素A和血清激活素A水平均高于孕6～8周,说明孕早期两者均随孕周增加而升高,这与文献报道一致。有关抑制素A和激活素A在妊娠中的作用,国内外研究[4,5]认为,胎盘组织分泌的抑制素A和激活素A既可以分泌入母体血液循环,也可以分泌入胎儿血液循环,起到调节妊娠期母体促性腺激素释放、雌孕激素的分泌和胎儿的生长发育的作用;同时又能够以旁分泌或自分泌方式参与胎盘局部调节轴中促性腺激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘生乳素、雌孕激素、前列腺素等各种激素之间的生殖内分泌调节;调节影响滋养层细胞的分化,参与对胚泡植入的调节;从而影响着妊娠的发生、发展及胎儿的生长发育。因此,激活素A和抑制素A在母体正常表达对妊娠的维持和发展起重要作用。

目前国内外有关抑制素A和激活素A与妊娠流产发生的关系研究多为与先兆流产的相关研究。如Felice[6]对120例孕早期孕妇的研究发现,先兆流产组中,妊娠失败者的血清抑制素A、激活素A水平明显低于妊娠至足月者。有文献对不明原因复发性流产患者进行前瞻性研究,发现抑制素A的浓度从妊娠第6周开始流产组就比正常妊娠组明显偏低。这些研究推测由于抑制素A和激活素A水平降低引起胎盘局部激素、细胞因子等内环境发生变化,使胎盘局部调节轴中各种激素合成释放紊乱,导致滋养细胞的侵蚀能力降低,胎盘浅着床,同时还影响胎儿的生长发育,从而导致不良妊娠结局的发生。认为抑制素A、激活素A可作为标志物提前预测先兆流产的发生。由此可见,激活素A、抑制素A的水平下降也可因为子宫内局部微环境各因子之间的平衡紊乱,从而影响滋养层细胞的分化、胚泡植入、影响胚胎的生长发育,最终导致胚胎停止发育,发生稽留流产。那么抑制素A、激活素A是否可以作为标志物提前预测稽留流产的发生?目前国内外没有相关研究,尤其是大样本研究。在本研究中血清抑制素A、激活素A在稽留流产组及正常妊娠组中均有一定水平的表达,但稽留流产组无论是在孕6～8周还是孕8～10周均明显较正常妊娠组表达水平低,差异有高度统计学意义(P<0.01)。说明稽留流产组抑制素A、激活素A的表达低于正常妊娠组。证实抑制素A和激活素A水平下降与稽留流产的发生密切相关,可见血清抑制素A、激活素A作为预测早期妊娠稽留流产的标记物是也是可行的。

综上所述,若能对抑制素A和激活素A进行深入的研究,确定其在生理条件下的正常参考值及稽留流产发生的临界值,则可使其应用于临床,及时发现稽留流产的倾向并尽早做出干预治疗,可减少稽留流产的发生。但与之相关的研究仍然集中在先兆流产患者中:如在激活素A与晚期先兆流产的相关性研究中发现,激活素A正常组均值为363.20 pg/ml,以激活素A小于240.76 pg/ml为临界值预测晚期先兆流产的敏感性为80.0%, 特异性为78.7%。因为与稽留流产相关临界值研究鲜见,发生稽留流产的临界值无类似文献报道可以参考。在本研究中以抑制素A<230 ng/L临界值,其预测孕早期稽留流产的敏感性为84.8%,特异性为77.4%;以血清激活素A<162 ng/L为临界值,其预测孕早期稽留流产的敏感性为85.0%,特异性为88.7%。且两者作为预测孕早期稽留流产的检测方法,敏感性及特异性差异无统计学意义,说明两者作为预测方法的诊断效能无优越性差别,因此可以采用两种手段联合的方法提高诊断孕早期稽留流产的阳性检出率,从而提高筛查效率。

本研究为激活素A或抑制素A作为早期预测、监控稽留流产倾向的指标提供临床实验依据,但对于早期发现稽留流产后,两种激素与其预后结局的关系等还需要今后做进一步的探讨。同时,本研究中血清激活素A、抑制素A在正常妊娠组中的均值,尤其是作为预测值的临界值与国内外其他研究结果有差异,除与本研究实验中研究对象不同外,还可能与实验本身的偏差有关,如入选对象不是完全随机、样本量仍然不足、标本收集保存环节中是否出现溶血导致实验测值有误差等有关,故目前本研究的结果仍然不足以作为临床实际工作中的参考值,还需反复大样本验证,为开展稽留流产早期筛查、防治提供更有力的实验室数据支持。

摘要：目的:了解抑制素A、激活素A在孕妇孕早期血清中的表达水平,探讨抑制素A、激活素A预测早期妊娠稽留流产的价值。方法:选择于我院行门诊产前检查的孕6～10周孕妇1000例为研究对象,采用ELISA法于孕6～8周或孕8～10周测定其血清抑制素A和激活素A的浓度水平,并追踪至孕13周,了解妊娠情况。对其中继续正常妊娠和发生稽留流产的孕妇的血清抑制素A、激活素A的浓度水平进行比较,并比较两者的临界值、敏感性和特异性。结果:无论在孕6～8周还是在孕8～10周,正常妊娠组血清抑制素A、激活素A水平均明显高于稽留流产组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。检测血清抑制素A的临界值为<230ng/L,其预测孕早期稽留流产的敏感性为84.8%,特异性为77.4%;检测血清激活素A的临界值为<162ng/L,其预测孕早期稽留流产的敏感性为85.0%,特异性为88.7%。两者敏感性和特异性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血清抑制素A、激活素A作为预测孕早期稽留流产的手段是可行的,且具有较高的敏感性和特异性,两者的诊断效能无优越性差别。

关键词：抑制素A,激活素A,稽留流产,妊娠结局

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抑制剂浓度 篇4

1材料

K562细胞(本室保存);LDM(由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠);RPM-1640(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Biological公司);MTT (噻唑蓝)法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒(南京凯基);苔盼蓝;兔抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)抗体(美国Affinity公司);Beta actin (β 肌动蛋白) 抗体 (美国Affinity公司)

2方法

2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后,用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,所有实验均采用对数生长期细胞。

2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100 μl/孔 (约1×104),置37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h后,加入不同浓度力达霉素(LDM),再于恒温培养箱孵育48 h,加入50 μl MTT,37 ℃孵育4 h,使MTT还原为甲臜,1 000 g离心,吸出上清,每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)使甲臜溶解,平板摇床摇匀,于490 nm波长处检测每孔的吸光度(A)值,计算细胞成活率。

2.3细胞的计数离心收集K562细胞,制备单细胞悬液并作适当稀释,细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀,在3 min内分别计数活细胞和死细胞,计算活细胞率。

2.4细胞凋亡形态的观察将K562细胞2×105个/ml浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI 1640培养基中,置24孔板中,每孔2 ml,加入不同浓度的LDM,设对照组,培养48 h,转入离心管,1 000 g离心,弃上清, 取0.2 ml涂片,冷风吹干,瑞氏染色10 min,姬姆萨染液染10 min,冲洗,晾干,在倒置显微镜下观察。

2.5细胞培养上清中TNF-α 表达的检测将K562细胞置37℃,5% CO2细胞培养箱培养48 h后1 000×g离心,收集细胞培养上清。采用ELISA试剂盒进行检测。

2.6凋亡相关蛋白的检测离心收集K562细胞,预冷的PBS洗涤2次,加入裂解缓冲液1 ml(PMSF 10%)震荡混匀,冰浴30 min。 细胞裂解物在4 ℃ 12 000 g离心5min,取上清。使用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。等量的蛋白样品进行SDS-PAGE,将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜 (聚偏二氟乙烯膜) 上。室温下用含5%脱脂奶粉[PBS (磷酸缓冲盐溶液)溶解]封闭1 h。随后加入一抗 (1:500)4 ℃过夜。PBST(PBS溶液加上吐温-20)洗膜3次,加入相应的二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗膜3次。 ECL曝光法显色,通过成像系统捕获图像,并通过图像分析系统对所得区带进行扫描,比较各组的积分A值。

2.7统计学分析实验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,实验结果采用±s表示。

3结果

3.1 LDM对人白血病K562细胞增殖的影响不同浓度LDM素作用K562细胞48 h后,置于全自动连续光谱酶标仪在490 nm处测定A值。按公式:细胞存活率%=(加药细胞A/对照A)×100,从而得出LDM对K562细胞作用的半数抑制浓度(IC50)为10-10mol/L。见图1。

3.2 LDM对人白血病K562细胞活性的影响苔盼蓝染色显示,正常细胞无色,死细胞呈蓝色。不同浓度LDM素作用于K562细胞48 h后对其生长均有一定的影响。见图2。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-9mol/L;D:10-10mol/L;E:10-11mol/L; F:10-12mol/L

分别用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM素作用K562细胞。按公式:抑制率(IR)%=死细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100,计算出IR值。测得IR值分别为 (21.2±2.5)%、(37.5±0.97)%、(5.21±1.2)%、 (64.5±1.6)%和(71.3±2.0)%。

3.3 LDM对人白血病K562细胞凋亡形态的影响未经药物处理的对照组K562细胞多呈圆形,经不同浓度LDM处理后,均出现明显凋亡形态,包膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以至形成凋亡小体。见图3。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L

3.4 LDM诱导人白血病K562细胞TNF-α 在细胞培养上清中的表达结果显示,10-8、10-10、10-12mol/L的LDM处理后,细胞培养血清中TNF-α 的含量分别为16.2 ± 4.0、35.0 ±2.9、51.0 ±3.6、60.5 ±0.5,对照组为 (16.2±4.0)pg/ml,3个浓度组与对照组的差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L。TNF-α—肿瘤坏-α;β-actin—β 肌动蛋白(内参蛋白)

3 . 5LDM对人白血病K562细胞TNF - α 表达的影响用10-8、10-10、10-12mol/L浓度LDM处理组48 h后,TNF-α 蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13 (P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,A值升高。见图5。

注:与对照组相比较,aP<0.01

4讨论

目前认为,肿瘤的发生和细胞增殖与细胞凋亡平衡失调有关。细胞凋亡是细胞内源性基因调控下的生理性细胞死亡方式,凋亡过程受阻是肿瘤发生的主要机制之一,同时也是临床上肿瘤治疗研究的热点之一。 诱导凋亡是化疗药物抗白血病的重要机制。

LDM(原名C-1027[5,6],lilamycin)是具有我国自主知识产权的烯二炔类(enediyne)抗生素,以其抗肿瘤的强烈活性及独特的DNA切割方式而颇受重视。LDM由1个辅基蛋白和1个发色团组成,发色团是其活性部分。LDM能引起核苷酸碱基和序列特异性的DNA单链和双链断裂[7]。大量研究表明,力达霉素具有较强的抗肿瘤活性[8,9,10],LDM能够强烈抑制肿瘤生长和肿瘤转移。最近有研究证明,LDM可以诱导肿瘤细胞染色体异常和端粒错排[11]。以往研究显示,不同剂量LDM能诱导多种类型的肿瘤细胞死亡,如典型细胞凋亡,但其究竟确切作用于哪种凋亡通路目前尚不清楚。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程,以核酸内切酶活化后将DNA分解为180 bp整倍数的片断DNA为特征。形态学上表现为细胞起泡,核固缩。LDM作用非常迅速,活性比一般抗肿瘤药强。要抑制肿瘤细胞的生长,一方面可以通过影响细胞周期,使其不能进行正常的有丝分裂;另一方面可以促进细胞凋亡,以达到治疗目的。本研究采用MTT法观察了LDM对人白血病K562细胞增殖有抑制作用,其IC50值为10-10mol/L,作用均强于丝裂霉素和阿霉素,显示出LDM对K562细胞有极强的杀伤作用。人白血病K562细胞经LDM处理后,细胞均出现明显凋亡形态,胞膜皱缩,胞核固缩, 浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以致形成凋亡小体。细胞凋亡是内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号,目前普遍认为是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡不同阶段发挥作用,分为调控性caspase和效应性caspase形成凋亡信号转导的酶级联反应。TNF-α 是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,因其可致肿瘤出血,并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞而得名。TNF-α 的生物学活性占TNF总活性的70%~95%,其前体由223个氨基酸组成,相对分子质量为26,成熟的TNF-α 含157个氨基酸,无蛋氨酸残基,即无糖基化位点,TNF-α 通过细胞膜上的受体 (TNFR)发挥生物学活性[11]。TNF的生物效应都是通过细胞表面的2种TNF受体(TNFR)引发,其信号转导通路主要包括caspase家族介导的细胞凋亡、衔接蛋白TRAF介导的转录因子NF-B和JNK蛋白激酶的活化[12]。细胞凋亡的死亡受体途径是指细胞凋亡由死亡受体[主要有Fas(factor associated suicide)、TNFR(tumor necrosis factor receptor) 家族和TGF-βR(transforming growth factor β receptor)等]介导,与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导。其中Fas和配体Fas L(Fas ligand) 结合,通过死亡功能区活化接头蛋白FADD (Fas-associated protein with death domain),而FADD又可以通 过N端的死亡 效应域DED (Death effector domain)和Caspase-8相互作用引发细胞凋亡。本实验研究证实,低浓度LDM可能通过上调TNF-α 表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖,其作用机制有待进一步深入研究。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 探讨低浓度力达霉素(LDM)对人白血病细胞K562增殖的抑制作用及其可能的作用机制。方法 以不同浓度LDM处理K562细胞48 h,通过MTT法检测LDM对细胞增殖的抑制作用;利用苔盼蓝染色对细胞活性进行测定;利用瑞氏-姬姆萨染色法观察LDM对细胞形态的影响;Elisa法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在细胞培养上清中的表达;采用Western Blot检测凋亡相关蛋白TNF-α的表达。结果 LDM对K562细胞增殖有一定的抑制作用,用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM分别作用K562细胞48 h,抑制率分别为(21.2±2.48)%、(37.5±0.88)%、(52.1±1.24)%、(64.5±1.61)%和(71.3±2.00)%。通过瑞氏姬姆萨染色,荧光显微镜下可见胞膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成团块分散在胞膜周边。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清,LDM处理组与对照组相比,TNF-α表达水平升高。Western Blot分析显示,分别用10-8、10-10、10-12 mol/L浓度的LDM处理细胞48 h后,TNF-α蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13(P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,吸光度值比升高。结论 低浓度LDM可能通过上调TNF-α表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖。

抑制剂浓度 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究选择的对象共80例, 均为妇科择期开腹手术的患者, 年龄20~60岁, 平均 (44.8±7.5) 岁, 无嗜酒史及药物滥用史, 无肾脏、肝脏、肺、心脏病史, 手术切口≥10 cm, 术前无影响心血管系统药物应用史, 体重指数在30 kg/m2以下。随机分为A、B组各40例。

1.2 方法

均在上午开展手术, 常规术前准备。均取复方氯化钠注射液20 m L/kg在切皮前补充。对BP、ECG、HR等采用多功能监护仪监测, 并对呼气末二氧化碳分压 (PETCO2) 及吸气和呼气末异氟醚进行监测。应用听觉诱发电位指数对麻醉深度加以监测。面罩给氧在诱导前去氮5 min, 取维库溴铵0.1 mg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg诱导时静注, 并取雷米芬太尼靶控输注, 依据Dixon序贯法对浓度进行设定。机械通气, 并取异氟醚吸入维持麻醉。参照年龄校正后的实际MAC值确定输注值, 以40岁为标准。呼气末异氟醚浓度于切皮前维持稳定至少15 min。对麻醉诱导前、手术切皮前3 min及手术切皮前1 min、术中切皮后1 min及5 min MAP和HR进行记录, 基础值为其平均值。采用序贯法行MPCBAR测定, 两组第一个患者依据预试验结果将雷米芬太尼血浆靶浓度初始设置为3 ng/m L, 后每一患者具体血浆目标靶浓度, 依据前一患者心血管在切皮刺激时的反应结果加以调整。若HR增快或MAP升高≥20%基础值, 即为阳性反应, 则上调血浆靶浓度0.5 ng/m L。若MAP升高和HR增快<20%基础值, 即为阴应反应, 则下调血浆靶浓度0.5 ng/m L。对阳性至阴性反应转变的交叉点进行观察, 至6个为止, 雷米芬太尼的MPCBAR即为交叉点平均值。患者手术均在常规静吸复合麻醉下完成。

1.3 统计方法

采用SPSS13.0版统计学软件对数据进行处理, 组间计量数据采用均数±标准差 (±s) 表示, 行t检验。

2 结果

两组麻醉诱导前及切皮前HR变化差异无统计学意义 (P>0.05) 。MAP在诱导前无差异, 诱导后B组低于A组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。两组雷米芬太尼应用时HR、MAP无差异, MPCBAR B组低于A组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。两组血流动力学在切皮前后AEPindex阴性和阳性反应差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1, 2, 3。

注:与A组比较, *P<0.05。

注:与A组比较, *P<0.05。

3 讨论

研究显示, 雷米芬太尼通过在组织和血浆中广泛存在的非特异性酯酶完成代谢过程, 为超短效阿片类药物, 其输注半衰期在术中长时间保持不变, 为理想的静脉输注药, 对手术创伤所致的应激反应可有效抑制[2]。该研究中, 在取异氟醚吸入麻醉应用的基础上, 观察雷米芬太尼抑制交感-肾上腺素能反应的MPCBAR受呼气末异氟醚浓度稳定性改变的影响。

研究显示, 吸入麻醉药的MAC采用阿片类药物可明显降低。在对吸入麻醉药的MAC采用序贯法测定时, 有学者研究实验在达4个交叉点时即可终止, 而相关研究显示需达6个交叉点才可使MAC的真实性增加[3]。该次所选病例应用6个交叉点以使MPCBAR值的可信度增加。通过预试验对两组起始浓度进行测定, 均以3 ng/m L为起始浓度, 降低或增加幅度均为0.5 ng/m L。年龄阶段不同, 麻醉药吸入的MAC也存有差异。与Iso0.5的A组比较, Iso1.0的B组MAP在切皮前呈较低水平, 为呼气末异氟醚浓度较高所致的外周血管阻力和心排血量下降导致[4]。高异氟醚呼气末浓度, 可使雷米芬太尼的用药量显著降低, 即在呼气末吸入麻醉药浓度增加的情况下, 所需雷米芬太尼对交感-肾上腺素能反应抑制的血浆靶浓度呈减少表现。结合该次研究结果显示, 两组雷米芬太尼应用时HR、MAP无差异, MPCBAR B组低于A组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。两组血流动力学在切皮前后AEPindex阴性和阳性反应差异无统计学意义 (P>0.05) 。

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抑制剂浓度 篇6

摘要：目的研究肾移植术后应用两种不同的免疫抑制方案,环孢素A血药浓度与患者体内因素相关性的差异。方法采用回顾性调查方法,查阅该院肾移植术后1周～1个月内服用CsA的患者病历,记录CsA血药浓度及相应的生化检验值,并应用SPSS13.0统计软件对数据进行全回归分析。结果全回归分析表明,方案一:在丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、AST/ALT、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、胆碱酯酶(CHE)、总胆汁酸(TBA)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素(Urea)、尿酸(UA)、肌酐(Crea)等生化因素协同存在的情况下,上述各值与CsA单位剂量血药浓度存在线性关系(P<0.05)。方案二:结果显示体内各生化因素与CsA单位剂量血药浓度不存在线性关系(P>0.05)。结论两种不同免疫抑制方案的肾移植患者,其CsA血药浓度与体内因素相关性存在明显差异。

关键词：肾移植,环孢素,体内因素,相关性

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