神经干细胞因子

关键词： 神经 干细胞

神经干细胞因子（精选十篇）

神经干细胞因子 篇1

关键词：BDNF,NSCs,脑源性神经生长因子,神经干细胞,增殖,分化

1 神经干细胞与脑源性神经生长因子的历史发展

干细胞可细化为胚胎干细胞、胎儿组织干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体组织干细胞等,神经干细胞属于成体组织干细胞的一种。

神经干细胞可以再分为内源性和外源性两大类,内源性没有外源性带来的免疫排斥、伦理学道德问题,适用于临床研究,是今后的热点研究方向。内源性干细胞来源于动物自身,非外界导入的神经干细胞都可以称为内源性神经干细胞。

1982年,脑源性神经生长因子(BDNF)被从猪脑中分离出来。1992年,Reynolds等在其研究中,通过细胞诱导从成年小鼠脑纹状体中分离的表皮生长因子,并在体外增殖,发现增殖细胞最初表达nestin(神经上皮干细胞中间丝蛋白,nestin是神经干细胞的特异性表达产物),最终确定成年小鼠纹状体的细胞具有分化成神经元和星形胶质细胞的能力。随后正式提出了神经干细胞的概念,从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论[1]。近年研究表明,BDNF可以维持神经元的存活,提高其活性,减少损伤后感觉神经元的死亡,并促进神经干细胞向神经元的分化[2]。1998年埃里克森等[3]首先用免疫银光标记法,发现成人大脑海马及侧脑室区具有产生神经元的能力。2000年Gage将神经干细胞的特性总结为:可生成神经组织,具有自我更新能力,可通过细胞分裂产生新细胞[4]。近年来大量实验结果已经证明,成年哺乳动物(包括人类)的脑室下带、海马、嗅球、纹状体、大脑皮质等区域都存在神经干细胞,其中侧脑室下带(SVZ)和海马颗粒细胞下层(SGZ)是内源性神经干细胞存在的主要部位。2012年诺贝尔生理学奖授予在细胞核重新编程研究领域有杰出贡献的两位专家,他们的研究表明成年体细胞在诱导下也可形成其他各种细胞。

2 神经干细胞的调控机制

目前发现,神经干细胞的增殖分化主要受基因及各种生长因子、神经营养因子等的调控,并与其所处的微环境密切相关。2006年Givogfi等研究发现Notch基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因,并主要作用于侧脑室下带(SVZ)[5]。2008年有学者研究发现多种细胞因子都参与到了神经干细胞的增殖和分化的过程中,这些细胞因子包括各种生长因子、促红细胞生成素、神经营养因子等[6]。目前研究热门有表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)。Tarasenko等实验结果提示人类胎儿神经干细胞有很高的可塑性,其增殖和分化依赖不同的生长因子[7]。神经干细胞还受到特定磁环境的影响,如有学者研究发现,局灶性脑缺血大鼠海马增殖的内源性神经干细胞,可分化为神经元或神经胶质细胞,而重复经颅磁刺激可促进海马内源性神经干细胞向神经元的分化[8]。

3 脑损伤对于神经干细胞的影响

脑组织受到各种损伤后,神经干细胞发挥了重要作用。于春泳等所作的研究表明,成熟大鼠脑损伤后可诱导脑室室管膜下区的神经干细胞增殖,进而表达为伤口周围的神经干细胞梯度递减反应模式,提示神经干细胞对于脑组织损伤后的修复起着重要作用[9]。Kinlin等研究认为阿尔兹海默病本身可能激活内源性神经干细胞,这种增加的神经干细胞可能会取代因为疾病本身丧失的神经元[10]。赵某等实验研究发现,局灶性脑缺血再灌注损伤后亚低温能促进内源性神经干细胞增殖,并更多地向神经细胞分化[11]。

有关脑出血后内源性神经干细胞的研究开展较少。Masuda等用胶原酶法制作大鼠基底节出血模型,发现侧脑室下带明显的神经干细胞增生,血肿周围出现神经元前体细胞。实验说明脑出血激发了内源性的神经细胞再生[12]。还有研究表明,人类脑出血可导致血肿周围组织神经细胞再生[13]。

4 脑源性神经生长因子对于神经干细胞的作用

脑源性神经营养因子(BDNF),1982年首次从猪脑中提取,是神经营养因子家族中代表性的成员之一,在中枢神经系统中,BDNF主要在神经元内合成,两个主要受体为Trk B和P75,其中以Trk B的研究最多。

脑源性神经生长因子对中枢及周围神经元的作用,一直是研究的热点,国内外学者做了很多研究。概括来说BDNF对神经元细胞有促进其增殖、分化、代谢以及支持保护营养的作用。且研究显示,脑源性神经营养因子能够促进神经干细胞向神经元方向分化[14,15],可能与内源性b HLH基因MASH—1的表达升高有关[15]。另有一项研究表明,可以通过改变Va166等位基因,从而增强BDNF的表达,进而有利于蛛网膜下腔出血的恢复[16]。杨某等研究认为,BDNF可能是通过降低损伤后NO的形成从而有利于移植的神经干细胞向神经元分化,BDNF和神经干细胞联合移植较单独神经干细胞移植对神经系统损伤有更好的治疗效果[17]。王某的实验研究证实BDNF与NSCs联合移植较单独NSCs移植对缺血缺氧性脑损失有更好的疗效[18]。

BDNF通过什么样的通路起到神经保护的作用?有研究表明,c a s p a s e-3(一种半胱氨酸蛋白)的活性对于B D N F是否起到治疗作用起到决定作用,当caspase-3的活性被抑制时,BDNF将无法起到保护治疗作用[19]。BDNF还可以通过抑制铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn SOD),从而起到保护神经元的作用[20]。

5 现有问题及展望

综上所述,我们可以看到神经干细胞对于损伤后的脑组织的修复、再生起着关键作用,脑源性神经生长因子对于干细胞的增殖分化起着重要作用,脑损伤时BDNF与NSC可能具有协同修复受损组织的作用[17,18]。

神经干细胞因子 篇2

【主要成份】基因重组人粒细胞集落刺激因子

【性状】为白色粉末或块状，装于无色透明小瓶中(冻干粉针剂)。

【适应症】骨髓移植时促进中性粒细胞数的增加;预防抗肿瘤化疗药物引起的中性粒细胞减少症及缩短中性粒细胞减少症的持续期间;骨髓增生异常综合征的中性粒细胞减少症;再生障碍性贫血的中性粒细胞减少症;先天性及原发性中性粒细胞减少症;免疫抑制治疗(肾移植)继发的中性粒细胞减少症。

【用法用量】

骨髓移植时促进中性粒细胞数的增加通常在骨髓移植后次日至第5天后开始给药，5ug/kg，每日1次静脉点滴。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时，中止给药。

预防抗肿瘤化疗药物引起的中性粒细胞减少症及缩短中性粒细胞减少症的持续期间

实体瘤：通常在抗肿瘤化疗药物给药结束后次日开始给药，2ug/kg皮下注射，由于潜血等导致皮下注射因难时，可静脉注射(含静脉点滴)5ug/kg，每日1次。当中性粒细胞数(白细胞数)经过低值之后，中性粒细胞增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时，中止给药。

急性淋巴细胞白血病：通常在抗肿瘤化疗药物给药结束后次日开始给药，5ug/kg，每日1次静脉注射(含静脉点滴)。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时，中止给药。

骨髓增生异常综合征的中性粒细胞减少症成年患者通常从中性粒细胞数低于1000/mm3时开始给药，5ug/kg，每日1次静脉注射。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时减少给药量或中止给药。

再生障碍性贫血的中性粒细胞减少症通常从中性粒细胞数低于1000/mm3时开始给药，成人5ug/kg，每日1次静脉注射。儿童5ug/kg，每日1次皮下或静脉注射。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时减少给药量或中止给药。

先天性及原发性中性粒细胞减少症通常从中性粒细胞数低于1000/mm3时开始给药，2ug/kg，每日1次静脉或皮下注射。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时减少给药量或中止给药。

免疫抑制治疗(肾移植)继发的中性粒细胞减少症通常从中性粒细胞数低于1500/mm3(白细胞数3000/mm3)时开始给药，2ug/kg，每日1次皮下注射。当中性粒细胞数增加到5000/mm3以上时，在继续观察症状的同时，减少给药量或中止给药。

【药理作用】

本药为一种结构与来源于人的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基本无差异的糖蛋白造血因子，作用于骨髓中的粒细胞系祖细胞，促进其向中性粒细胞分化和增殖。在本制剂存在的条件下，用小鼠骨髓细胞培养，测定集落形成的结果表明，本制剂作用于粒细胞、巨嗜细胞系集落形成单位(CFU-GM)，但对红细胞(BFU-E，CFU-E)及巨核细胞系(CFU-Meg)的集落形成无促进作用。

本制剂具有动员和增加正常或使用抗癌药物的小鼠外周血的造血干祖细胞的作用，具有促进中性粒细胞恢复的作用，不但能使小鼠的已被减弱的抗感染力恢复到正常水平，而且还增强了抗菌素的治疗效果。在急性髓性白血病小鼠中，能改善因肿瘤化疗引起的中性粒细胞减少症，同时缩短中性粒细胞减少症的周期。用人外周血单核细胞进行的混合淋巴细胞反应表明，本制剂不影响器官移植使用免疫抑制剂的效果。此外，移植物抗宿主反应亦表明，本制剂不影响所用免疫抑制剂的效果。

【不良反应】

休克 ：因有引起休克的可能，故须严密观察，一旦发现异常，应中止给药并采取适当的处理措施。

间质性肺炎 ：因有诱发或恶化间质性肺炎的可能，故须严密观察，当出现发热、咳嗽、呼吸困难及胸部X线检查异常等情况时，应中止给药并采取给予肾上腺皮质激素等适当的处理措施。

幼稚细胞增加 ：对骨髓增生异常综合征的患者，因会促使幼稚细胞增加，故须严密观察，一旦发现幼稚细胞增加，应中止给药。

成人呼吸窘迫综合征 ：因出现过成人呼吸窘迫综合征，故应严密观察。当出现急速的进展性呼吸困难、低氧血症、胸部X线透视出现双肺弥漫性浸润阴影等异常情况时，应中止给予本制剂，并采取妥当的呼吸管理等处理措施。

皮肤 ：皮疹、发疹，瘙痒感，荨麻疹。

肝脏：GOT，GPT上升等肝功能异常。

消化系统 ：恶心、呕吐，食欲不振，腹泻，腹痛。

肌肉、骨骼系统 ：骨痛，腰痛，腰背部痛，胸部痛。

呼吸系统 ：肺水肿、呼吸困难、低氧血症， 胸水。

血液 ：血小板减少。

其他：ALP、LDH、CRP、尿酸升高，发热，头痛，心悸，浮肿，倦怠感。

【注意事项】

有药物过敏史者，过敏体质者，重度肝、肾、心、肺功能障碍的患者慎用。

本制剂的使用对象限于中性粒细胞减少症患者。用药期间，应定期检查血象，注意避免使中性粒细胞数(白细胞数)增加到必要值以上。当发现中性粒细胞数(白细胞数)增加到必要值以上时，需采取减少用量或暂时停药等措施。

因有引起过敏反应的可能，故一旦发生过敏反应，应立即中止给药并采取适当的处理措施。此外，为预防过敏反应的发生，在使用本制剂前，应对患者进行充分的问诊，并望事先做皮试。

用于骨髓移植患者时，若其原发病为髓细胞性白血病，须在使用本制剂前采取细胞进行体外试验，以确认本制剂的刺激是否会导致白血病细胞的增殖。此外应定期进行血液及骨髓检查，当发现幼稚细胞增加时，中止给药。

对化疗引起的中性粒细胞减少症患者，应该避免在化疗前24和后24小时期间使用本产品。对于骨髓增生异常综合征患者，建议在用药前采取细胞进行体外试验，以确认本制剂无促进幼稚细胞集落增加的作用。

对采用免疫抑制治疗(肾移植)继发的中性粒细胞减少症患者给药时，应充分观察并调节给药量，使中性粒细胞数维持在2500/mm3(白细胞5000/mm3)以上。有报道，再生障碍性贫血及先天性中性粒细胞减少症患者使用粒细胞集落刺激因子制剂后，转化成骨髓增生异常综合征或急性髓性白血病。再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及先天性中性粒细胞减少症患者使用粒细胞集落刺激因子制剂后，出现染色体异常。长期使用格拉诺赛特的安全有效性尚未建立，有报道可见脾脏增大。格拉诺赛特仅供在医生指导下使用。

【禁忌】对本制剂或其他粒细胞集落刺激因子制剂有过敏反应者 ;严重肝、肾、心、肺功能障碍者禁用。对骨髓中幼稚细胞没有充分减少的髓性白血病患者及在外周血中确认到有幼稚细胞的髓性白血病患者，有可能增加幼雅细胞。

【药物相互作用】本制剂不得和其他药剂混合注射。

【贮藏】10°C以下，避冻保存。

【有效期】3年

【生产企业】日本中外制药株式会社

美容需要细胞因子 篇3

简单地讲，细胞因子是指细胞受内、外环境刺激而产生的一大类具有重要生物学活性的细胞调节蛋白。目前被发现的有数十种之多，主要存在于人和动物体内。由于细胞因子对机体细胞的分化和功能具有较强的调节作用，因此细胞因子一直被用于对肿瘤的治疗当中。直到有多种细胞因子在体外通过生物基因工程获得重组，以及BFGF(碱性成纤维细胞生长因子)在治疗烧伤、烫伤皮肤中所起的重要作用得到证实后，细胞因子才被国外的有识之士引入到美容界里，其中最先进入美容护肤品行列的细胞因子是“表皮细胞生长因子”(BGF)。而细胞因子在中国美容界盛行则是近几年的事。

细胞因子作为细胞中存在的一种特殊的调节物质，既存在于动物体内，也存在于人体的细胞当中。目前美容护肤品中使用的细胞因子大多是通过生物基因工程选择生产菌株、进行工程菌发酵、纯化、冻干而获得的重组细胞生长因子，已不再是直接萃取于人或动物体内的“原始”细胞因子。但应当了解的是机体内除皮肤和部分组织细胞可以分泌某些细胞因子外，大量的细胞因子主要来源于血清。因此，在以血清组织液为代表的生物血清类护肤品中，各类细胞因子的含量和比例将更科学，作用也更全面。由于细胞因子在美容中的具体作用到目前为止尚没有明确的定论和评价标准，故而我们还不能客观的、有针对性的介绍和评价细胞因子的具体应用。但从细胞因子自身所表现出来的诸多特性，以及国内、外利用细胞因子所进行的美容实践来看，我们有理由相信在抵抗皮肤衰老、拯救受损皮肤等方面，细胞因子有着不可估量的作用。

细胞因子的具体特点有以下几个方面：①这是人类或动物的各类细胞分泌的具有多样生物活性的物质；②来源于组织细胞；③作用于细胞间或细胞内；④体内含量极少；⑤局部发生作用，不影响正常生理机能；⑥无依赖性和致敏性；⑦具有生长和抑制双向作用；⑧在有界面存在的情况下，皮肤对其的吸收和利用大幅度加强；⑨常温下大部分细胞因子的稳定性较差(冻干粉除外)。

神经干细胞因子 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠、新生24h内Wistar乳鼠, 由佳木斯大学动物实验中心提供。随机法分为5组:分别为正常组、对照组 、NT-3组、NSCs组、NSCs+ NT-3组, 24只/组。

1.2 主要试剂

人重组EGF、bFGF及NT-3 购自北京晶美生物工程有限公司;兔抗-Nestin、兔抗-NSE、山羊抗兔FITC抗体、山羊抗兔TRITC抗体、5-BrdU 、兔抗大鼠BrdU 单克隆抗体 、DAB试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒 (山羊抗兔) 均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 神经干细胞的培养及鉴定

根据Vescovi等[1]报道方法进行细胞培养。传二代的NSCs克隆球转移至0.1%多聚赖氨酸 (P-L-L) 处理过的盖玻片上, 加入适量完全培养液, 置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24h后, 采用免疫组织化学方法进行Nestin染色鉴定。

1.4 脑出血模型制备

采用Hua等[2]方法进行定位和制作脑出血模型。

1.5 移植治疗方法

在脑出血模型制备后的第3天, 行NSCs移植及给予NT-3营养因子。具体操作如下: (1) 先处理标记有BrdU的NSCs, 使细胞悬液的密度为2×107个细胞/100μL。 (2) 对于移植组用微量注射器经原骨孔垂直进针, 分别在进入5mm, 6mm和7mm后缓慢注入5μL刚制成的细胞悬液。对于NSCs+NT-3组:给予5μL含0.4ng NT-3的NSCs悬液。NSCs移植组:给予5μL已标记Brdu的NSCs悬液。NT-3组:给予5μL含0.4ng NT-3的PBS液。对照组:不移植NSCs和NT-3, 只进行三点穿刺。正常组:不移植NSCs和NT-3, 不进行三点穿刺。 (3) 术后普通饲养, 不用抗生素和免疫抑制剂。

1.6 神经行为功能学评分

在制作ICH模型前和移植后第3天, 7天, 14天, 28天, 采用Menzies量表对大鼠进行神经功能缺损评估[3]。

1.7 脑标本取材及制片

用10%水合氯醛 (按100mg/kg) 对SD大鼠行腹腔注射麻醉, 左心室快速输入生理盐水及4%多聚甲醛磷酸缓冲液 (含有DEPC) , 取脑。标本按常规给予固定、浸泡、脱水、浸蜡、包埋, 制作石蜡切片, 厚度5μm。

1.8 免疫组织化学检查

在移植后第3d、7d、14d、28d, 通过脑片的BrdU免疫组化染色和BrdU/NSE免疫荧光双标染色, 在400×显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为阳性细胞数, 每个时间点6只动物, 每只动物每个指标取切片6张, 每张切片选择5个视野, 数出每个视野的阳性细胞后计算平均阳性细胞数。

1.9 统计学分析

利用SPSS13.0软件统计学分析, 各组数据以均数±标准差undefined表示, 两组间比较用t检验, 多组比较用方差分析。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑出血移植后神经功能缺损评估

正常组和术前各组的大鼠神经功能缺损评分均为0分。对照组在移植28d时的评分比移植3fd时明显减低 (P<0.05) ;而NT-3组、NSCs组及NSCs+NT-3组在移植14d时的评分即比移植3d时明显减低 (P<0.05) 。NT-3组和NSCs组在移植28d时的评分明显低于对照组 (P<0.05) ;而NSCs+NT-3组在移植14d时的评分即比对照组明显减低 (P<0.05) 。NSCs+NT-3组在移植28d时的评分明显低于NT-3组或NSCs组 (P<0.05) 。NT-3组与NSCs组各时间段的评分比较差异不大无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

2.3 大鼠脑出血造模移植后免疫组化染色结果

见表2, 3。

(±s, n=6)

*与同组第3天比较P<0.05;#与对照组比较P<0.05;○与NSCS组比较P<0.05。

(±s, n=6)

*与对照组比较P<0.05;# NSCs组比较P<0. 05。

(±s, n=6)

*与对照组比较P<0.05;#与NSCS组比较P<0.05。

3 讨论

ICH是严重危害人类健康、致死致残率较高的疾病。寻找有效的治疗途径, 最大限度的改善神经功能恢复成为神经科领域关注的热点。

NSCs的发现为疾病治疗带来了光明的应用前景, 由于大脑的功能主要依赖神经元, 通过神经元分泌神经递质, 发出并传导神经信号来实现其功能, 因此研究神经干细胞定向分化调控机制, 使其向特定神经元分化, 是将NSCs应用于神经系统移植和替代治疗的关键[4]。本实验研究表明, NT-3可以促进NSCs向神经元分化, 目前对分化机制尚不清楚。

目前关于NSCs移植在大鼠体内存活、分化、迁移的机制, 可能有如下几个方面:① 在脑出血后, 有学者研究发现在脑出血早期BDNF和EGFmRNA的含量是增加的, 可能是对脑出血损伤的细胞起保护作用。② 脑出血后病灶区产生的某些细胞因子对神经干细胞的分化可能有促进作用。③ 脑出血后局部的血脑屏障发生破坏, 细胞之间的连接也受到破坏, 以及脑出血后产生的某些细胞因子对神经干细胞具有趋化作用。本试验研究中发现, 在NSCs和NT-3联合移植组、单纯NSCs移植组中可以观察到大量的NSCs及分化的神经元和胶质细胞主要存活在出血灶周围而远隔部位较少, 尤其是NSCs和NT-3联合移植组更加明显。在NSCs和NT-3联合移植组中存活的NSCs数量明显增多, 并且促进NSCs向神经元分化。这正是说明了以上的观点。

NSCs移植改善功能缺损的机制可能是移植的NSCs替代或强化了神经环路[5]。近年来试验研究发现, 向发育中或成年中枢神经系统内移植胚胎神经组织能够部分重建神经环路和改善功能[6]。学者将人神经营养素神经元立即或于2周后移植于完全性脊髓损伤后丧失运动诱发电位的大鼠后, 运动诱发电位恢复, 运动功能部分恢复, 从而说明了移植细胞可以整合神经环路[7]。移植NSCs促进大鼠运动功能恢复可能的原因有:①由于移植的NSCs分化为神经元后与宿主体内的神经元建立了新的突触联系而使得中断的纤维联系重新建立;② 移植的NSCs本身及其分化后分泌的多种神经营养因子的作用[8]。③ NSCs可能改善脑出血后脑水肿的作用。在本实验中发现, 在移植2周后的神经功能评价中NSCs和NT-3联合移植组的功能评分明显优于单纯NSCs移植组, 这可能是与神经环路重新整合和神经营养因子缺乏有关。在脑出血早期脑组织切片中还观察到移植NSCs组及NSCs和NT-3联合移植组的脑水肿明显比对照组减轻。

以上研究表明NT-3对NSCs具有促进其分化的神经元存活作用, 详细的机制尚不清楚, 有待于进一步研究。

关键词：NSCS,NT-3,移植,脑出血

参考文献

[1]Vescovi AL, Snyder EY.Establishment and properties of neuralstem cell clones:plasticity in vitro[J].Brain Pathol, 1999, 9 (3) :569-598

[2]Hua Y, Schallert T, Keep RF, et al.Behavioral tests after intrac-erebral hemorrhage in the rat[J].Stroke, 2002, 33 (10) :2478-2484

[3]包新元, 舒斯云.人鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社, 1991, 53

[4]余风珍.非血像脐血移植治疗儿童病毒性脑炎后遗症1例[J].新乡医学院学报, 2007, 24 (5) :540

[5]Jeong SW, Chu k, Jung KH, et al.Human neural stem cell trans-plantation promotes functional recovery in rat with experimental in-tracerebral hemorrhage[J].Stroke, 2003, 34 (9) :2258-2263

[6]Lindvall O.Parkinson disease Stem cell transplantation[J].Lancet, 2001, 358:48

[7]Saporta S, Makoui AS, Willing AE, et al.Functional recovery aftercomplete contusion injury to the spinal cord and transplantation ofhuman neuroteratocarcinoma neurons in rats[J].J Neurosurg, 2002, 97 (1) :63-68

神经干细胞因子 篇5

关键词 细胞因子 T细胞 牙龈卟啉菌 牙周疾病

材料和方法

选取7例成人牙周炎患者，指标：至少4个位点上牙周袋>5mm，骨吸收>6mm，年龄47±3.35岁；10例健康或牙周仅有轻度炎症者，炎症位点不超过4个，骨吸收<3.5mm，年龄44.14±2.46岁。

牙龈卟啉菌(Pg)［1］及Pg血清学检测；牙周探针深入牙周袋或龈沟内，取出后放入1mlPBS中，Elisa法进行Pg及Pg血清学检测。

Pg培养：Pg ATCC33277，常规培养，提取其外膜物质，显微镜下观察菌体。

T细胞系的制备：每例个体抽取5ml外周血，高密离心法获取单个核细胞，37℃孵化14天，加入Pg抗体1周后，PBS洗细胞，静置1周；加入IL-2，28天后Pg阳性T细胞系制备完成。

流式细胞仪检测：PBS加0.1%盐酸缓冲液冲洗T细胞以获取其外膜物质，加入鼠抗人CD4或CD8抗体，4℃孵化30分钟，分别加入IL-4，IFN-γ、IL-10抗体，选流式细胞仪检测。进行统计学分析。

结 果

成人牙周炎、健康组两组间CD4⁺、CD8⁺T细胞中IFN-γ与IL-4比值、IFN-γ与IL-10比值无显著差异。

两组间CD4⁺，CD8⁺T细胞IFN-7表达量高于IL-4、IL-10表达量。健康个体B的CD4⁺ T细胞中IL-4、IL-10表达高于IFN-γ；个体C的IL-10表达高于IFN-γ；CD8⁺T细胞中F、G个体IL-4或IL-10表达高于IFN-γ；成人牙周炎个体CD4⁺T细胞中，F、G个体IL-4表达高于IL-10，IL-10高于IFN-γ。其余个体均为IFN-γ表达量最高，成人牙周炎个体CD4⁺T细胞中，I、H、O、P、Q5例个体中IL-4和（或）IL-10表达高于或近似于IFN-γ；CD8⁺T细胞中，I、H、O、P、q、K6例个体中IL-4和（或）1L-10高于IFN-γ表达。

讨 论

健康牙龈组织中T细胞记忆细胞不表达IL-4，成人牙周炎牙龈位点用Pg抗体刺激后表达高IL-4。这些研究结果表明，牙周疾病中IL-4的高表达可能打破了其他细胞因子间的平衡。

实验证明，在牙周疾病中牙龈组织中IFN-γ表达显著，本实验中CD4⁺、CD8⁺T细胞系中IFN-γ表达量均高于IL-4、IL-10。根据以上数据推测，在牙周疾病过程中，牙龈牙周组织的破坏可能经由IFN-γ产生以及巨噬细胞等的潜在刺激引起［2］。Stein等已证实，成人牙周炎患者牙龈组织中IL-10表达量远高于非炎性牙齦组织。同时IL-l0抗原可诱导胶原纤维减少［3］。

本研究结果表明，研究健康者和成人牙周炎患者间，牙周组织中牙龈卟啉菌阳性个体T细胞系中白细胞介素-4、白细胞介素-10及γ-干扰素表达无显著差异，但部分个体γ-干扰素表达高于其他两种细胞因子的表达，证实牙龈卟啉菌阳性个体易患牙周疾病者，γ-干扰素表达增高。

参考文献

1 路宝风.牙龈卟啉茵的研究进展.临析医学专科学校学报，2002，24(1)：66-68.

2 杨琼，王雷，房金波.牙龈卟啉菌表面蛋白的生物活性和免疫原性研究.分子科学学报，2003，19（3）：151-155.

神经干细胞因子 篇6

为了进一步验证NGF的促生殖作用并探索其机制, 同时建立一种更有效的卵巢GC体外培养的标记方法, 本研究采用分离和培养原代小鼠卵巢腔前颗粒细胞 (preantral granulosa cells, Pre GC) , 应用CCK-8分析和Brd U体外标记检测细胞增殖, 以探讨NGF是如何影响GC的增殖。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

NGF, RD systems公司;DMEM-F12培养液, Tryple, 胎牛血清, 双抗, GIBCO公司;BSA, Biotech BASIC INC公司;抗体, Promega公司;CCK-8, Dojindo laboratories公司;Brd U, Brd U in situ defection kitⅡ, BD Biosciences公司。

1.2 实验动物

10 d龄的健康雌性ICR小白鼠, 中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心[许可证号:SCXK (皖) 2005-0008]。

1.3 Pre GC的原代培养

小鼠断颈处死后无菌取出双侧卵巢, 去除周围脂肪组织及卵巢被膜, 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS) 洗净卵巢上血污, 体视显微镜下用尖头镊子分离腔前卵泡, 消化膜细胞5~10 min后吸取单个腔前卵泡, 2 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 加入胰酶消化15 min, 期间吹打数次, 终止消化后离心5 min, 1 500 r/min, 去上清, 加入完全培养基制成颗粒细胞悬液, 调整细胞密度为2×105个/ml, 预接种到培养板中。

1.4 CCK-8检测细胞的增殖

将细胞悬液接种到96孔培养板, 每孔100μl, 设定NGF分别作用时间为12、24、48、72和96 h的实验组, 每个时间段都设定各自的对照组, 对照组加入普通培养基, 每组设定6个复孔。5%二氧化碳CO2, 37℃孵箱培养24 h, 细胞贴壁率达到90%, 更换含0.1%BSA的DMEM/F12培养基饥饿24 h, 加入NGF使终浓度为50 ng/ml, 继续培养各个时间段后终止培养, PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h, 酶标仪检测450 nm波长的吸光值, 计算平均值。

1.5 Brd U体外标记GC增殖

将盖玻片 (1.5 cm×1.5 cm) 在酒精灯上迅速过火后小心放入24孔培养板中, 然后将单细胞悬液滴到玻片上, 40μl/滴, 然后加培养基到500μl, 设定对照组和NGF组 (50 ng/ml) , 每组3个复孔。培养24 h, 饥饿后加入NGF使终浓度为50 ng/ml继续培养。

根据细胞生长状况, 培养36 h左右适时取出爬片, 按照Brd U免疫荧光技术的步骤操作, Hoechst染核, 封片后荧光显微镜拍照, 随即计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算标记指数 (labeling index, LI, 百分数表示) 。

1.6 统计方法

所有的检测数据以均数±标准差 (±s) 表示, 使用SPSS 16.0统计分析软件进行单因素方差分析后进行组间LSD分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGF对小鼠卵巢Pre GC促增殖作用

50 ng/ml的NGF作用Pre GC不同时间段后, 采用CCK-8法检测NGF对细胞增殖的作用。结果显示, 在波长450 nm时, OD值随作用时间的延长 (12~96 h) 而增加, 当NGF作用48 h时, 促增殖作用明显表现出来, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 随着NGF作用时间进一步延长, 促增殖作用持续存在, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图1。

2.2 Brd U的免疫荧光技术检测及LI (%)

Brd U免疫荧光技术检测显示, 经50 ng/ml NGF处理36 h后, NGF对小鼠卵巢Pre GC已经有促增殖作用, 见图2。随机计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算LI (%) , NGF组的Brd U的LI为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) , 见图3。

1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05

A:对照组, 只有少数细胞表达Brd U;B:NGF (50 ng/ml) 组, 表达Brd U的细胞数增多

覮与对照组比较, P<0.01;1:对照组;2:NGF 50 ng/ml组

3 讨论

颗粒细胞是卵巢的主要组成细胞, 为卵母细胞的发育提供其所需要的营养物质以及生存的微环境[4]。卵母细胞通过缝隙连接从周围的颗粒细胞中摄取各种营养因子, 使卵母细胞的代谢需要得以满足。因此, 颗粒细胞在卵母细胞生长中起着重要的营养作用[5]。而且, 颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接是卵母细胞生长、分裂和成熟能够正常进行的必需因素;同时, 卵母细胞对卵泡细胞功能起着中心调节作用[6]。卵母细胞分泌的生长因子对颗粒细胞和卵丘细胞的分化、增生、凋亡和泛素化起着广泛的调节作用, 说明颗粒细胞和卵母细胞之间的关系是相互依赖的[7]。颗粒细胞的增殖和分化在原始卵泡形成启动以及以后的卵泡正常发育起着至关重要的作用。因此, 颗粒细胞是否能够正常的增殖分化可作为卵泡发育成熟的标志[8]。

最开始的研究显示:NGF的生物学功能仅仅限于神经系统, 但越来越多的证据表明NGF也可以作用于其他非神经系统的组织细胞。研究表明, NGF及其受体Trk A和p75在动物的生殖系统中有表达[9]。在猪卵巢中, NGF及其受体在膜细胞和颗粒细胞中都有表达, 从而证明NGF及其受体在卵泡发育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金仓鼠的子宫组织中, NGF及其受体Trk A在子宫内膜上皮细胞、腺细胞及基质细胞中都有表达, 而p75只在子宫内膜上皮细胞、腺细胞中有表达[11]。对山羊的研究显示NGF及其受体Trk A与p75在输卵管壶腹部与峡部的上皮细胞与肌细胞中有表达[12]。对小鼠和人的卵巢研究也表明, NGF的过表达会导致卵巢中初级卵泡与次级卵泡数量的大幅增加, 而裸露的卵母细胞数量相对减少, 表明不正常的NGF及其受体水平的增加会造成卵巢囊状疾病[13]。

CCK-8试剂中含有WST-8, 它是一种类似于MTT的化合物, 在电子载体的作用下被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 (Formazan) 。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比, 细胞增殖越多越快, 则颜色越深;细胞毒性越大, 则颜色越浅。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值, 可间接反映活细胞数量。与传统的MTT检测法比较, CCK-8具有使用方便, 不需要放射性同位素和有机溶剂, 检测快速, 灵敏度高, 甚至可以测定较低的细胞密度, 重复性优于MTT, 对细胞毒性小等各种优点[14]。

本实验采用CCK-8试剂盒比较了不同作用时间的NGF对体外培养的小鼠Pre GC增殖的影响, 选取10 d龄的小鼠, 获取Pre GC, 避免分化的颗粒细胞自身因素对NGF促增殖作用的影响, 并且在加入NGF前用无血清培养基饥饿培养, 减少其他因素干扰细胞增殖。实验结果证实50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞48 h的时候, 促增殖作用非常明显地表现出来, 随着作用时间延长, 呈现一定的时效关系。虽然NGF对细胞的促增殖作用持续存在, 但过长的作用时间可能会使细胞的密度太大。因此, 判定50 ng/ml的NGF对颗粒细胞的促增殖作用最理想反应时间不能超过48 h。

Brd U作为胸腺嘧啶的类似物, 能取代胸腺嘧啶被增殖细胞利用。当细胞处于DNA合成期, 即细胞处于增殖期, Brd U被细胞特异性地摄入细胞核掺入到细胞新合成的DNA中, 只要细胞存活, 这种存留是永久的, 用抗Brd U单克隆抗体经免疫荧光技术染色后, 可特异性显示Brd U阳性标记细胞, 即可直接观察其在细胞内的掺入情况[15]。

本研究采用Brd U体外标记方法, 50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞36 h后, 进行免疫荧光技术检测, 结果显示荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, NGF组的阳性细胞数量明显多于对照组, 提示细胞处于增殖期。同时计算Brd U阳性标记指数LI (%) , 数据显示NGF组的Brd U标记指数明显高于对照组, 差异具有统计学意义, 这更加直观的表明NGF能够促进颗粒细胞的增殖。

可见, 在研究NGF促颗粒细胞增殖及影响因素实验中, 采用CCK-8检测和Brd U体外标记的方法是可取的, 它们是高效、便捷地标记Pre GC增殖的方法, 而且本实验结果也证实了NGF促进颗粒细胞增殖是与时间呈时效关系的。

摘要：目的 为了解神经生长因子 (NGF) 对小鼠卵巢腔前颗粒细胞促增殖情况并探索其机制, 同时建立方便灵敏、无污染和毒性小的细胞增殖检测方法。方法 用NGF刺激培养的小鼠卵巢腔前颗粒细胞, 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 实验分析, 溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brd U) 掺入标记, 免疫荧光技术检测颗粒细胞在体外培养中的增殖情况和Brd U标记指数。结果 NGF明显促进颗粒细胞增殖, 并且具有一定的时效关系。荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, 提示细胞处于增殖期。NGF组的Brd U标记指数为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) 。NGF使增殖期的细胞显著增多及增殖指数明显升高。结论 该研究证实NGF能够促进颗粒细胞增殖, CCK-8分析和Brd U标记是高效、灵敏的标记腔前颗粒细胞增殖的方法, NGF促进颗粒细胞增殖与促进颗粒细胞DNA的合成有关系。

神经干细胞因子 篇7

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

10～13 个月龄健康山羊6 只, 体重15～20 kg, 雌雄不限 (安徽医科大学动物实验室) 。

1.1.2 主要器材及试剂

CO2 培养箱 (Heraeus150) ;酶标仪 (美国ELX800) ;流式细胞仪 (BD公司) ;倒置显微镜 (Olympus) ;L- DMEM培养基 (Hyclone公司) , 胎牛血清 (杭州四季青公司) ;胰蛋白酶、维生素C、地塞米松和β- 甘油磷酸钠 (Sigma公司) ;人β- NGF (R&D公司) ; PE 标记的鼠抗人CD45和CD34、 FITC 标记的CD90和CD105单克隆抗体及小鼠IgG1 (Caltag公司) ;碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒、骨钙素 (OC) 放免试剂盒 (南京建成公司) ;von Kossa染色试剂盒 (上海杰美生物公司) 。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs的分离及培养

山羊麻醉后无菌操作下用16 号骨穿针行髂骨穿刺, 多点穿刺抽取骨髓5 ml, 置于肝素化的无菌离心管中, 轻轻震荡混匀, 离心后收集细胞, 用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬, 吹打均匀后接种到100 cm2培养皿中, 采用全骨髓贴壁培养法, 置37 ℃、 5% CO2、100%饱和湿度培养箱培养。72 h后首次换液, 去除悬浮细胞, 以后每3 d换液1 次, 细胞80%～90%融合后用0.25%胰蛋白酶消化, 传代。

1.2.2 BMSCs的鉴定

取第3 代处于对数生长期的BMSCs, 消化后收集细胞用PBS悬浮, 调整细胞密度至1×106 个/ml, 分别与FITC标记的鼠抗人CD90、CD105和PE标记的CD45、CD34单克隆抗体结合, 细胞与FITC和PE标记的IgG1反应作为阴性对照, 室温下避光反应30 min, 用PBS洗涤后进行流式细胞术分析, 以确定所分离培养的BMSCs的纯度 (具体操作按以上抗体试剂说明书进行) 。

1.2.3 实验分组

将第3 代BMSCs分为空白对照组:用含10%胎牛血清的DMEM常规培养液培养。成骨诱导对照组:成骨诱导液为常规培养液中加入含10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠。NGF组:常规培养液中加入终浓度为100 ng/ml的NGF。实验组:成骨诱导液中加入终浓度为100 ng/ml的NGF。

1.3 检测指标

1.3.1 细胞碱性磷酸酶 (ALP) 活性测定

按上述分组, 调整细胞密度至1×104 个/ml接种于24 孔板, 每3 d换液1 次, 培养至第14 天, 终止培养收集细胞后, 超声裂解细胞, 离心取上清液用ALP定量检测试剂盒进行检测, 比较各组的吸光度 (A值) , 以反映各组细胞的ALP活性。

1.3.2 骨钙素 (OC) 含量测定

按上述分组, 调整细胞密度至1×104 个/ml接种于24 孔板, 每3 d换液1 次, 培养至第14 天, 终止培养, 收集细胞后进行超声裂解, 离心取上清液按OC放免试剂盒说明书测定OC含量。

1.3.3 钙结节染色 (von Kossa法)

细胞接种分组同上, 培养至第21 天, 按染色试剂盒说明进行染色, 显微镜下观察、拍照。

1.4 统计学方法

对实验计量资料以undefined表示。用SPSS 13.0统计分析软件进行两样本均数比较的t检验或多样本均数比较的方差分析, P<0.05, 结果有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察

骨髓间充质干细胞于24 h后开始贴壁, 3 d后细胞呈形态较为一致的纺锤形, 5～6 d后细胞伸出突起呈长梭型, 体积增大, 形似成纤维细胞样细胞、不定型细胞及纤维细胞型细胞并开始增殖, 细胞集落开始增多并融合成片, 呈漩涡状生长, 10 d左右细胞铺满瓶底即可传代, 传代细胞5～7 d即可长满瓶底 (图 1) 。成骨诱导对照组细胞增殖速度减慢, 但细胞体积明显变大, 形态呈多边形或不规则改变, 多角形细胞的比例随时间延长而逐渐增高。NGF组细胞增殖速度及形态与空白对照组无明显变化。实验组细胞更饱满, 多角形变更加明显, 部分区域细胞呈漩涡状分布。

2.2 流式细胞仪检测结果

流式细胞术检测BMSCs表面标记结果显示, FITC标记和PE标记的IgG1阴性对照阳性率分别为1.26%和1.34%;细胞表达CD90和CD105, 阳性率分别为99.2%和99.6%;而基本不表达CD45和CD34, 阳性率为1.39%和1.58%。结果符合BMSCs的一般特性, 表明此法培养BMSCs至第3代已经自然纯化达99%以上, 细胞纯度较高 (图 2a～f) 。

2.3 细胞ALP活性检测结果

空白对照组、成骨诱导对照组、NGF组和实验组吸光度值分别为0.269 7±0.053 9、 0.488 9±0.031 9、 0.288 6±0.066 3、 0.638 0±0.069 9。实验组明显高于其它3 组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , NGF组与空白对照组差异无显著性 (P>0.05) 。

2.4 细胞OC含量测定结果

空白对照组、成骨诱导对照组、NGF组和实验组OC含量分别为 (0.478±0.039 3) 、 (0.911 8±0.087 8) 、 (0.491±0.047 5) 、 (1.243 8±0.106 7) ng/ml。实验组OC含量明显高于其它3 组, 差异有统计学意义 (P0.05) 。

2.5 矿化结节染色

空白对照组和NGF组染色未见明显矿化结节形成, 成骨诱导对照组可见形成散在的黑色矿化结节;实验组矿化结节的数量和面积均较成骨诱导对照组明显增大 (图 3、4) 。

3 讨论

骨髓间充质干细胞是组织工程重要的种子细胞, 其在体外向成骨细胞诱导分化的条件已经非常成熟, 在培养基中加入一定量的地塞米松、β- 甘油磷酸钠、维生素C就可以使之向成骨细胞分化[2]。对于骨髓间充质干细胞的鉴定, 目前还没有检测其表面抗原的特异性单克隆抗体, 一般认为黏附分子CD13、CD29、CD44、CD90、CD105等是其重要表面标记[3], 但此细胞不表达造血细胞表面抗原, 如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45、单核/巨噬细胞表面抗原CD14等[4]。本实验分离培养的骨髓间充质干细胞高度表达CD90和CD105, 而基本不表达CD34与CD45, 与目前国内外报道的间充质干细胞的表面抗原表达情况相符。说明用全骨髓贴壁培养法培养至第3 代的BMSCs能够达到较高的纯度, 基本排除了杂细胞的干扰, 验证了用其进行实验的可行性和准确度。

神经生长因子是最早发现的神经营养素家族成员, 在骨再生中的应用日益突出。Garcia等[5]研究已证实, 在体外培养的多种成骨细胞系中, 不仅有 NGF mRNA的产生, 而且有NGF蛋白的表达, 这促使了研究者进行NGF对骨相关细胞作用的探索。

碱性磷酸酶活性是成骨细胞分化的早期指标, 在体外钙化中起关键性作用, 反映了细胞的成骨活性。目前认为其作用是水解有机磷酸酶释放出无机磷, 用于羟基磷灰石的形成, 并破坏钙化抑制剂, 从而启动钙化。骨组织是通过骨基质钙化而形成, 而骨基质由成骨细胞所合成、分泌;在基质开始钙化时, 成骨细胞的ALP活性最高, 在钙化接近结束时, 活性则最低, ALP活性在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态, 是骨形成的特异酶[6]。骨钙素是成骨细胞产生的一种非胶原蛋白, 它的合成主要发生在骨质矿化阶段, 其含量反映了骨形成。本实验用培养至第14天的细胞进行检测, 测得实验组100 ng/ml NGF能促进经成骨诱导的BMSCs胞质内碱性磷酸酶的表达和骨钙素的合成, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。矿化结节是成骨的另一重要指征, 成骨细胞在体外培养时能形成矿化的细胞外基质, 矿化区经von Kossa染色呈阳性反应[7]。实验组矿化结节的数量和面积均较成骨诱导对照组增大, 从定量和定性两方面均证实了100 ng/ml NGF能促进经成骨诱导的BMSCs向成骨细胞分化, 能提高细胞骨形成的功能。但NGF组各项指标却与空白对照组无明显差异, 这表明单纯的使用NGF并无明显地诱导山羊BMSCs向成骨细胞转化的作用。这与Kurihara等[8]用NGF刺激牙周膜细胞成骨的研究结果相似, 也呼应了Garcia等[5]证实的成骨细胞系内可产生NGF的结果。

总之, 本实验证实了单纯使用NGF并不能诱导山羊BMSCs向成骨细胞转化, 但NGF对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程具有明显的促进成骨的作用。不足的是, 本实验所采用的NGF的浓度是根据预实验所确定的, 其促进成骨的具体机制还有待进行深入的研究。但在牵张成骨术中NGF与牵张力共同作用可望在短期内获得充足及强成骨活性的成骨细胞, 为解决临床问题, 进一步进行相关的临床研究提供了实验基础。

参考文献

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[7]王洪复.骨细胞图谱与骨细胞体外培养技术[M].上海:上海科学技术出版社, 2001:61.

神经干细胞因子 篇8

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

选取90只健康Wistar大鼠为研究对象,所有大鼠均购自军事医学科学院实验动物中心。将90只大鼠随机分为A组(空白对照组)、B组(神经干细胞移植组)和C组(神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组)。A组30只大鼠中,雌雄各半,体重190～212 g,平均(204.1±6.3)g。B组30只大鼠中,雌雄各半,体重188～214 g,平均(204.6±6.2)g。C组30只大鼠中,雌雄各半,体重191～210 g,平均(204.4±6.5)g。三组大鼠性别及体重差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

三组大鼠均采用Allen打击法制作脊髓损伤模型。大鼠采用腹腔注射方式麻醉,于其胸12部位进行皮肤与肌肉的切开处理,置于俯卧位,采用打击架进行打击处理,打击物重量为10.0 g,打击的高度为50.0 mm左右,每只大鼠均连续打击6次,至大鼠出现甩尾后模型制作完成。清洗切开的皮肤与肌肉,缝合处理,常规喂养,备用。

1.2.2 处理方法

A组为空白对照组,仅以10μL培养液注入损伤部位,入针后分别从其损伤部位的头、尾部以斜45°角注入。B组进行神经干细胞移植,显露硬膜后,以单细胞注射器刺入损伤部位,将神经干细胞大约10μL分别从损伤部位的头部与尾部注入,然后观察情况无异常后进行缝合。C组的处理方法与B组一致,但移植物为10μL神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞。三组大鼠均注射治疗1次,并注意对损伤部位的保护。分别于移植前、移植后1、3个月每组取10只大鼠进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标的检测、评估及比较。

1.2.3 检测方法

皮质诱发电位的检测指标为皮质诱发体感和运动电位,均采用丹麦产2000M型双信道神经肌电描记仪进行检测,其中,检测过程中的刺激频率为10次/s,而时限与分析时间分别为100μs与10 ms,注意避免可能引起测量误差的相关因素。神经功能相关指标检测项目为脊髓组织微管相关蛋白2(MAP-2)、神经生长因子(NGF)及脑源性神经营养因子(BDNF),取处死大鼠的脊髓组织,并以甲醛固定,进行相应的脱水及石蜡包埋处理,再将其以5μm的规格切片,以免疫组化法进行处理及检测,并将标本置于高倍镜下阅片,进行阳性细胞数统计。由资深工作人员进行标本制作及阅片,每只大鼠制作4份切片,对其读数,取平均值。

1.3 评价标准

采用BBB评分对移植干预前后大鼠进行后肢功能评估。BBB评分是评估大鼠脊髓损伤的重要量表,其分值范围为0～21分,其中,0分表示可见到后肢运动,1～7分表示大鼠存在不同程度的后肢关节活动,活动的关节从少到多,由轻微活动到大幅度活动;8～16分表示大鼠后肢存在无、部分负重活动至持续负重行走,即表示爪面从轻微着地到可承重,承重重量从轻到重且可协调运动;17分及以上表示大鼠接近正常活动至运动功能正常[2],即从不稳的协调运动到持续的协调运动,从而实现躯干的协调运动。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠移植前后BBB评分比较

移植前三组大鼠BBB评分中0～7分大鼠比例差异无统计学意义(均P>0.05);而移植后1、3个月B组及C组0～7分大鼠比例均低于A组,C组0～7分大鼠比例低于B组,且C组移植后3个月0～7分大鼠比例明显低于移植后1个月,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

注:与A组同时间比较,*P<0.05;与B组同时间比较,&P<0.05;与同组移植后1个月比较,#P<0.05

2.2 三组大鼠移植前后皮质诱发电位比较

移植前三组大鼠皮质诱发体感和运动电位峰值比较,差异无统计学意义(均P>0.05);而移植后1、3个月B组及C组峰值均高于A组,C组峰值高于B组,且C组移植后3个月峰值明显高于移植后1个月,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.3 三组大鼠移植前、移植后1、3个月神经功能相关指标比较

移植前三组大鼠的脊髓组织MAP-2、NGF及BDNF阳性细胞数比较,差异无统计学意义(均P>0.05);而移植后1、3个月B组及C组阳性细胞数均高于A组,C组阳性细胞数高于B组,且C组移植后3个月阳性细胞数明显高于移植后1个月,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

注:与A组同时间比较,*P<0.05;与B组同时间比较,&P<0.05;与同组移植后1个月比较,#P<0.05

注:与A组同时间比较,*P<0.05;与B组同时间比较,&P<0.05;与同组移植后1个月比较,#P<0.05;MAP-2:脊髓组织微管相关蛋白2;NGF:神经生长因子;BDNF:脑源性神经营养因子

3 讨论

脊髓损伤为神经外科的危急症之一,致残率较高,且不易改善恢复,患者常常有截瘫及四肢瘫痪等表现,严重影响患者的后期生存状态。因此,改善患者的脊髓损伤状态一直是临床研究的热点[3]。临床中以往较多的实验研究结果显示[4,5],神经干细胞及施万细胞移植均是较佳的改善脊髓损伤的治疗方法,效果较为突出,但是疗效仍需改进、提升。施万细胞移植治疗的不足之处在于仍需进一步改进其脊髓神经的损伤修复作用,而NGF是近些年来应用于施万细胞修饰的研究热点,其中,神经营养因子3是研究较多的一类,其临床作用尚可[6,7],但对于其综合优势的研究相对较少,也缺乏足够的相关论证。对于神经损伤的修复及治疗是一个缓慢的过程,需要治疗干预方法具有长久且稳定的效果。另外,对于脊髓损伤的治疗效果要保证运动与感觉等综合功能的改善,从而实现长久且全面发挥疗效的作用。这些方面是近些年来临床中对于干预效果有效程度评估的重要指标。

本文就神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用进行观察,并将干预的效果与空白对照大鼠及采用神经干细胞移植的大鼠进行比较。结果显示,神经营养因子3基因转染的施万细胞更有助于改善脊髓损伤大鼠的BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标,说明模型大鼠运动功能及神经功能均得到有效改善,从而肯定了神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤治疗中的效果,且其改善作用呈现持续稳定的状态,即移植前至移植后1、3个月这种改善持续进行,从而肯定了神经营养因子3基因转染的施万细胞在作用持久方面的效果。分析原因认为可能与神经营养因子3更有效地促进了施万细胞对于神经细胞的修复有关[8]。并且,神经营养因子3基因转染的施万细胞还具有有效控制神经元萎缩的功效,轴突再生得到有效促进[9,10,11,12],故效果突出。另外,在神经受损后施万细胞开始分化,并有选择性地实现基因表达,从而为神经元的再生提供了必要前提,但这种效果不够突出稳定,需要进一步强化及稳定,而神经营养因子3则可对这些不足进行有效的弥补,从而实现其稳定且持久地发挥作用的目的。神经营养因子3还可以起到进一步增强神经元之间联系的作用,可以改善神经损伤部位的微环境。

综上所述,可以认为神经营养因子3基因转染的施万细胞既为神经损伤提供了必要的修复基础,又为其提供了较佳的修复改善环境,综合优势极为突出。本研究认为,神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳,有利于脊髓损伤的改善,价值较高。

摘要：目的 探讨神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用,以进一步了解其在脊髓损伤治疗中的应用价值。方法 将90只健康Wistar大鼠采用Allen打击法建立脊髓损伤模型,将其随机分为A组(空白对照组)30只、B组(神经干细胞移植组)30只和C组(神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组)30只。三组大鼠分别于移植前、移植后1、3个月进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标评估及比较。结果 移植后1、3个月B组和C组的BBB评分中07分比例(B组:70%、60%,C组:50%、30%)、皮质诱发体感和运动电位[B组皮质诱发体感电位:(201.37±23.06)、(227.63±26.48)μV,C组皮质诱发体感电位:(241.36±27.34)、(278.53±31.46)μV;B组皮质诱发运动电位:(150.23±22.67)、(193.57±27.18)μV,C组皮质诱发运动电位:(186.72±26.83)、(242.57±30.56)μV],均优于A组[90%、90%,皮质诱发体感电位:(53.86±6.75)、(56.96±7.35)μV,皮质诱发运动电位:(32.64±4.07)、(34.15±4.12)μV]。另外,B、C组神经功能相关指标也均明显优于A组,而C组则优于B组,且C组移植后3个月神经功能指标水平明显优于移植后1个月,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳,有利于脊髓损伤的改善,对改善患者的感觉、运动等指标均发挥着积极作用。

神经干细胞因子 篇9

近年来研究表明[1]细胞凋亡为脑梗死的病理生理机制之一，尤其在缺血半暗带区凋亡是神经细胞主要的死亡方式。脑梗死后神经细胞凋亡是由一系列复杂的级联反应所引起，有很多因子参与，已有研究[2]表明Fas在其中起重要的作用，然而目前关于其下游促凋亡因子（fas-associated death domain,FADD）、半晓天冬酶-8(Caspase-8）及抗凋亡因子FLIP与脑梗死关系的研究报道极少。本研究利用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，检测它们在不同时间点m RNA及蛋白的表达及神经细胞凋亡情况，并分析其意义。试图初步探讨脑梗死后神经细胞凋亡分子病理机制，并为脑梗死的诊治提供一定的理论基础，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂

高速低温离心机（美国Beckman公司），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），凝胶图像分析仪（上海天能科技有限公司）。TUNEL凋亡检测试剂盒（德国Roche公司），兔抗鼠FADD、Caspase-8及FLIP多克隆抗体（美国NEOMarkers公司），SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司），Trizol（美国Molecular research center）,PCR引物由Primer5.0软件设计，由上海英骏生物公司合成：FADD引物：5'-TCCCTTACCCGATCACTCA-3'（上游），5'-CTGGGCAGACACGACCTAC-3'（下游），扩增产物长221 bp;Caspase-8引物：5'-TGATGAAGAGGC TCTGAGTAA-3'（上游），5'-TGGCAAAGTGACTG-GATATA-3'（下游），扩增产物长489 bp;FLIP引物:5'-GGCCCTGAGCACTGTGTCTG-3'（上游），5'-TCG GCCTGTGTAATCCTTTGTAA-3'（下游），扩增产物长379 bp；β-actin:5'-CGCACCACTGGCATTGTCA T-3'（上游），5'-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3'（下游），扩增产物长200 bp。

1.2 实验动物分组及模型制备

10～12周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只（由中南大学湘雅医学院实验动物部提供），体重（250±20)g。随机分为正常组（n=10），假手术组（n=10），脑缺血再灌注模型组（n=40）（以下简称模型组），模型组再按再灌注6、12、24及72 h分成4个亚组，每组10只动物。参考LONGA[3]的线栓法制备局灶性右侧大脑中动脉脑缺血模型，缺血2 h后拔出线栓形成再灌注。假手术组大鼠线栓插入深度为8～10 mm，其余操作同手术组。

1.3 原位细胞凋亡检测（TUNEL)

于相应时间点麻醉动物，开胸暴露心脏，左心室穿刺并经升主动脉用0.01 mo L/L PBS快速灌注后，以250 m L 4%多聚甲醛缓冲液由快到慢灌注固定3、4 h，取脑，30%蔗糖液固定24 h，在缺血灶范围做脑连续冠状冷冻切片，按TUNEL试剂盒说明进行操作。凋亡细胞观察与计数：光镜下凋亡细胞核呈黑褐色，可破裂成小碎片或出现凋亡体，正常细胞核则被核固红染成红色。于显微镜下（×200）计数凋亡细胞数，每个区域计数10个视野（来自不同切片），细胞计数采用图像分析软件进行定量分析。

1.4 FADD、Caspase-8及FLIP免疫组化染色

按上述方法将大鼠进行取材并制作成冷冻切片，然后按SABC免疫组化试剂盒说明书对FADD、Caspase-8及FLIP进行免疫组化染色，Ⅰ抗稀释浓度为1∶100，免疫染色阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗。在缺血大脑皮层用HMIAS22000高清晰度彩色图文分析系统测定FADD、FLIP免疫反应阳性细胞的平均灰度值代表蛋白表达的高低。免疫组化染色的强弱与灰度值成反比，即染色越深，阳性反应产物表达高或活性强，灰度值越小，反之则大，免疫反应产物呈棕黄色。

1.5 RT-PCR法检测FADD、Caspase-8及FLIP的mRNA表达

于相应时间点将成功动物模型深度麻醉，取缺血侧脑组织装于冻存管，置液氮中速冻后，移至-80℃冰箱中保存。取出冻存的脑组织，剪取缺血区脑组织100 mg，按总RNA提取试剂盒说明提取其中的总RNA，以紫外分光光度计测定A260∶A280比值，计算总RNA浓度。取1μg总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。然后取1μL逆转录产物配成25μL的PCR反应体系放入PCR仪按反应条件设定的程序自动完成PCR扩增。FADD、Caspase-8、FLIP与β-actin的PCR反应的变性温度、退火温度和延伸温度均分别为：94℃、55℃（FLIP的退火温度为56.1℃除外）和72℃，反应时间均分别为45 s、40 s和40 s，循环次数均为30次。扩增完成后取PCR扩增产物5μL，于2%琼脂糖凝胶中电泳，经凝胶扫描分析系统行吸光度扫描，分别计算FADD、Caspase-8及FLIP基因表达量与β-actin表达量的比值。

1.6 统计学处理

所有数据经SPSS15.0软件进行统计学处理。统计指标均进行正态检验和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以双尾P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 脑缺血再灌注后神经元凋亡的变化

正常组及假手术组可以观察到散在分布的凋亡细胞，凋亡细胞核染色阳性，细胞体积较小，且收缩变形。与正常组及假手术组比较，模型组再灌注6小时缺血侧坏死灶周围可以观察到凋亡细胞明显增多，并于以后时间点逐渐增多，至72 h达高峰，差异均有显著性（P<0.001）。见表1，图1、2。

2.2 FADD、Caspase-8及FLIP的蛋白及mRNA表达

免疫组化检测发现：正常组及假手术组大鼠顶叶皮层均有少量FADD、Caspase-8及FLIP蛋白阳性细胞表达，二组之间比较其表达差异均无显著性（P>0.05）。与正常组及假手术组比较，模型组脑缺血再灌后各时间点缺血侧顶叶皮层FADD及Caspase-8表达差异均有显著性（P<0.001），其均于6h即明显上升，于再灌注12 h达到高峰，至24 h及72 h则明显下降。FADD及Caspase-8的m RNA表达变化与其蛋白表达变化基本一致。与正常组及假手术组比较，模型组大鼠脑缺血再灌后各时间点缺血侧顶叶皮层FLIP蛋白表达均明显增强（P<0.05～0.001），其于缺血再灌注后6h其蛋白表达明显增强（P<0.001），并达高峰，以后时间点逐渐下降，FLIPmRNA表达变化与其蛋白表达变化基本一致。见表1、2，图3～12。

注：1）与正常组、假手术组比较，P<0.05,注:1)与正常组、假手术组比较,P<0.05,2)与正常组、假手术组比较,P<0.001

注:覮与正常组、假手术组比较，P<0.001

图9中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图10中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图11中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图12中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

3 讨论

近年来研究表明[4]细胞凋亡为脑梗死的重要病理生理机制之一，其神经细胞凋亡涉及多条凋亡通路。随着诊疗技术的进步，逐渐开展起来的溶栓技术已使闭塞的血管再通机会大大增加，脑缺血再灌注损伤日益为人们所重视。已有大量研究[5,6]表明脑缺血再灌注损伤与兴奋性氨基酸毒性、神经细胞Ca2+超载、炎症反应及自由基产生有密切的关系。特别是缺血再灌注后不配对电子的持续反应而产生的自由基，被认为是导致其神经功能障碍的主要原因[7]。已有研究[8]发现脑缺血再灌注后的氧化应激能使死亡受体Fas及其配体Fas L表达明显增强，从而诱导神经细胞凋亡。FADD及caspase-8是死亡受体Fas介导的凋亡通路中重要的促凋亡因子[9]。Fas与Fas L结合或与激动抗体交联后形成三聚体，募集胞浆内FADD,FADD与Fas二者的死亡域相互作用，显露其死亡效应区，再将caspase-8募集于Fas号复合体，激活半胱氨酸蛋白酶级联，导致细胞凋亡，此途径即是Fas-FADD-Caspase-8通路，为死亡受体Fas介导的最主要的凋亡通路[9]。FLIP是FADD-Caspase-8途径的内源性抑制剂，它可以结合Fas-FADD复合体，阻断DISC中Caspase-8的激活，从而抑制FADD转导的凋亡信号[10]。目前，国内外关于FADD、caspase-8及FLIP与脑梗死关系的研究报道极少。

本研究发现免疫组化检测到模型组FADD、Caspase-8的m RNA及蛋白表达均增强，同时检测到大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡明显增多，基于Fas/Fas L在脑缺血再灌注损伤中的作用已经得到确认，因此提示Fas-FADD-Caspase-8凋亡通路可能为其重要凋亡通路之一。此外，本研究还发现抗凋亡因子FLIP的m RNA及蛋白表达亦增强，究其原因可能是神经细胞的自我保护机制之一，以防止或减少缺血再灌注所导致的细胞凋亡，但其具体机制尚待进一步研究。此研究亦启发笔者在今后研究或临床应用中可以用上述因子作为新的治疗靶点，应用药物或更先进的方法作干预，从而达到减少脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的目的。

参考文献

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神经干细胞移植：现实还是梦想？ 篇10

它的确神奇

与国外病人相比,小董接受“神经干细胞移植”花费的2万多元钱,不算太多,但这笔钱对于小董和他的家庭,已经是巨大的开销｡现在,病情没有好转,小董很想知道自己到底是上當受骗,还是“药不对症”,他努力地在网络上搜索信息,最后发现,没有人能给他一个满意的答案｡

“神经干细胞移植”究竟是一种怎样的治疗技术?记者以咨询者的身份来到“浙江某医院细胞治疗康复中心”,一位姓马的医生介绍说:“随着科学的发展,干细胞可以修复大脑中受到损害的细胞,我们移植的是神经干细胞,修复受损的脑组织,帮助功能的恢复｡”

让非生物或者非医学专业的人理解“神经干细胞”已经足够困难,更别说再加上“移植”“修复”一类的专业术语,事实上,即便是专业学者,对“神经干细胞”的了解也不多,它的发现,仅仅只有10多年的历史｡

1989年以前,没有人相信有“神经干细胞”这个东西的存在｡在此之前,造血干细胞早就被发现,1950年代,科学家已经发现通过移植骨髓,病人获得造血干细胞后可以治疗造血功能障碍等疾病,过去,白血病､地中海贫血等被认为是不治之症,通过骨髓干细胞移植,这些疾病的患者得到生的希望｡

而大脑中的“神经干细胞”一直没有被掀开面纱,所有人都认为神经元是不可再生的,如果神经细胞受到损伤后死亡,就不会像血液细胞一样得到新生力量的补充,只有“神经胶质细胞”来补充空缺｡“神经胶质细胞”是不能替代原来神经细胞的功能的,所以一旦神经细胞受到损伤,就像脑瘫病人的大脑中出现的情况那样,损伤的神经细胞是不能自我修复的｡受损的神经细胞就像一根竹竿,一旦断裂,就无法恢复到原来的样子,就算我们用胶水把竹竿接起来,它也无法重生｡

这种看法在1989年被打破,一位科学家提出“神经干细胞”的设想,后来经过各国科学家的实验,到1990年代初期,科学家们认定神经干细胞的确存在于成年动物脑和脊髓内的大量区域｡

这个发现让人振奋,它意味着,就算是神经细胞受损,人体也能自己把它修复成原来的样子,过去我们看到神经系统疾病无法恢复,可能是因为这些天生的修复材料不够多｡完成这个修复工作的,就是“神经干细胞”,它像“母亲”,能够按照需要“生育”出神经细胞,并且在受损部位让神经细胞死而复生｡只要我们对“神经干细胞”足够了解,就能够在人工的干预下,“制造”足够多的“神经干细胞”,然后根据需要,把它送到该去的地方,这样,很多神经系统的顽症,就可以迎刃而解了｡

世界各地的科学家开始投入到这个充满诱惑的研究领域,在中国,2001年立项的国家重点科研项目973计划里,也把神经干细胞研究作为课题,北京大学和中国科学院上海生命科学研究院的两位科学家主持开展科研｡

实验室中,研究者已经发现神经干细胞的巨大“潜能”｡从胚胎或者成体细胞中能够分化出神经干细胞,如果在实验室中创造出特殊的环境,那么这些分化出来的神经干细胞能够诱导发育成为神经细胞,接着,有科学家继续实验,在动物实验中发现,如果把那些通过特殊方式分化出来的神经干细胞移植进动物的身体,它们能够“长”出神经细胞,“修复”受损的神经细胞｡

这就是“神经干细胞移植”的理论基础,也就是说,把神经干细胞“种”进大脑,让它去需要的地方“修修补补”,是有可能的,这也是主张“神经干细胞移植”可以用于临床的的理由｡不过,上面出现的情况,还是在实验室中发生的“故事”,由于关键技术存在的不确定性,没有严谨的科学家敢把这个看上去“成熟”的过程用在人的身体上,即便存在个别的人体临床试验,也没有科学家声称已经得到了可靠的结果｡

诺贝尔奖提前到来?

“明天的治疗,今日享用”——在青岛某医院干细胞治疗康复中心的宣传资料上,有这样一个响亮的口号,但严谨的科学家表示,幻想“明天的治疗今日享用”实在是太早了,神经干细胞移植关键的难题还没有解决,只要这些关键难题没有解决,临床治疗的安全和效果就无从谈起｡

最重要的难题有两个:神经干细胞能否分化为一定纯度的神经细胞?神经干细胞“移植”进大脑后,能不能在正确的位置“长”出神经细胞来,而且这些“长”出来的神经细胞能不能长期“存活”｡

又是艰涩的专业概念｡

让我们来想象一下｡人的胚胎就像一颗种子,将来是会变成一个人的,这颗种子里包含了无数更小的种子,有的种子将来长成皮肤,有的长成肝脏,有的长成血液,还有的长成神经细胞｡神经干细胞,就是将来神经元和神经胶质细胞的“母亲”｡最早科学家对神经干细胞的研究,是从胚胎里寻找它的,这比较好理解,因为只要把种子放在合适的环境中,可以看到,有一些细胞将来就是变成了神经细胞｡

从胚胎中得到神经干细胞看起来更加可靠,一般有两个途径:一个是从流产胎儿的中枢神经系统中分离出来,一个是从人的胚胎干细胞中诱导分化出来｡不过,由于宗教和伦理的限制,这样获得神经干细胞的途径在很多国家被禁止｡

幸好,通往罗马的路不止一条,科学家们发现神经干细胞不仅存在于胚胎,而且还存在于骨髓､脐血里,如果从这些途径获得神经干细胞,就不存在宗教的禁忌｡于是,很多研究者把注意力集中在非胚胎的神经干细胞来源上｡

但问题是,脐血中神经干细胞的含量很小,如果我们要利用它,就必须分离､纯化和扩增,就像要从矿石中筛取钻石一样｡但到目前为止,科学界还没有成熟的分离､提纯和扩增的技术平台,没有公认的标准来规范这个过程｡也就是说,没有人知道哪种分离方式最好,纯化到什么程度才可以用于移植,扩增后的干细胞要达到哪些指标才是“合格”的｡

至于第二个难题,就更加复杂｡动物的大脑是一个精密到无法想象的“黑匣子”,至今人们对大脑的了解不多,神经系统是传递信号的“道路”,一个挨着一个的神经细胞巧妙而精确地传递电信号,才让我们在看到台阶时知道要抬腿｡就算我们解决了第一个难题,把“安全”的神经干细胞移植进大脑,这些干细胞能不能到达需要修补的地方?到达以后能不能像其他神经细胞一样传递信息?这些,都没有确定的答案｡

除了上面两个难题,还有很多临床使用的细节无章可循,比如移植的方法､途径､佐剂､适应症等等｡而且,神经干细胞治疗的效果评定,也是正在研究中的课题｡“如果有人解决了这些难题,一定能得诺贝尔奖｡”周长福说｡很多科学家都致力于解决这些问题,尽管科学家对神经干细胞移植将来应用于临床充满乐观的信心,但他们不得不面对的是,距离成熟的临床应用,还很遥远｡

神经干细胞“亢奋症”

在专业研究人员眼里,神经干细胞移植离临床治疗还有很长的距离,但那些支持临床应用的人,却只拿“效果”说话｡“我们用了这么几年以后,应该说没有出现毒副作用｡”“我们治疗的脑瘫病人90%以上都有效果｡”在一家开展神经干细胞移植的医院里,医生这样说｡浙江某医院干细胞治疗康复中心的史主任说,他们只想做“实在的工作”,不追求商业目的,所以一直没有过多宣传,但他还是忍不住告诉记者:“我们很多治疗病例,可以说是世界首例的｡”

“一项新技术在没有被证明确实有疗效之前,就不能在临床上应用,最多只能用来做临床试验,那样的话不仅要病人知情同意,还不能收取费用,并必须遵循有关临床试验的法规｡”方舟子在接受记者采访时表明了他的观点｡与他的态度类似,暨南大学附属医院一位康复科医师,也非常不赞同把“神经干细胞移植”应用于临床｡

对于“神经干细胞移植”应用于临床的质疑之声,从来没有停歇过,但这项备受争议的治疗技术,还是蓬勃地发展了起来｡

2005年,国内几家医院开始开展神经干细胞治疗,曾经在医学界掀起热烈的讨论,北京宣武医院是国内神经科实力非常强的医院,医院的几位医生对“神经干细胞移植”应用于临床发表了看法,并发表在《健康报》上｡

记者联系到当年这个报道中反对“神经干细胞移植”临床应用的专家,他们的观点至今没有改变｡

“据我掌握的资料神经干细胞移植在帕金森氏病等治疗方面有一定的效果是指可以产生多巴胺类物质｡至于对诸如运动功能､言语功能､认知功能､吞咽功能､二便功能等最重要的神经功能的恢复方面,至今我没有发现国际上有任何循证医学的证据表明神经干细胞‘移植’是有效的｡”其中一位神经康复专业的医师这样答复｡