细胞生长（精选十篇）
细胞生长 篇1
1材料与方法
.1材料收集与分离
取1例病人手术中切除的皮肤组织9块,重复试验3次。经PBS(磷酸缓冲盐溶液)冲洗后置入Dispase酶中,4℃过夜;收集皮片,置0.25%胰酶与0.02%EDTA(1∶1)混合液中,37℃,10~15 min,经吹打、过滤后收集单细胞悬液加入SKF上皮细胞培养液,以10×104/ml的密度接种于培养瓶中。当细胞铺满80%时,用0.25%胰酶消化后接种传代,取2~3代细胞进行试验研究。
1.2细胞培养与观测
在6孔板中接种表皮细胞,待细胞铺满后,制备80μm宽的划痕并标记,作为细胞迁移的基点。用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入培养基,试验组培养基中加入15.0 ng/ml的KGF,对照组不添加。置于37℃、5%CO2培养箱继续培养,于48、96、144 h观察,取10个迁移最远的不同点测量距离,以平均值作为表皮细胞的迁移距离。
1.3统计学处理
试验结果以SPSS 13.0软件进行统计学分析,采用独立样本t检验。P<0.05表示有显著性差异。
2结果与分析
2.1细胞培养结果
原代培养皮肤表皮细胞,3~5 d可见细胞贴壁生长。细胞展开后为多角形,呈典型的铺路石样,具有明显的上皮细胞培养特征(见图1)。
2.2划痕试验结果
24 h后,细胞可见明显迁移;48 h后试验组迁移距离较对照组远,试验组为(29.20±0.02)μm,对照组为(21.70±0.03)μm;96 h后试验组为(50.10±0.01)μm,对照组为(37.50±0.04)μm,有显著性差异;144 h后试验组划痕基本覆盖,而对照组仍可见明显的细胞空白区(见图2、3)。
与对照组相比,KGF促表皮细胞迁移能力随着时间的延长逐渐明显。96 h后两组间出现显著性差异,144 h后试验组细胞迁移的距离几乎是对照组的2倍。
3结论
划痕试验是体外试验中最常用的检测创伤愈合的模型,其有效模拟了创伤愈合初期由细胞伸展、增殖、迁移覆盖创面的过程[5]。本试验中,我们选择此模型用以观察KGF对表皮细胞迁移的影响。
Nguyen等[6]曾就KGF对乳腺癌细胞的增殖和迁移作用进行了观察,发现KGF可明显促进乳腺癌细胞迁移、增殖,并呈浓度依赖性。本次试验我们借鉴其他试验中所采用的KGF浓度来刺激人表皮细胞,结果发现,KGF可有效促进表皮细胞迁移。作用144 h后,试验组细胞迁移距离几乎是对照组的2倍,这与Marti等[7]在小鼠创伤模型中观察到的结果一致。已有研究表明,KGF是一种特异性的高效促上皮细胞增殖的生长因子,可以促进有丝分裂,这与c-myc、c-fos c以及核苷酸合成的调节酶的表达有关[8]。所以,试验组划痕愈合时间明显短于对照组,可能与KGF促进表皮细胞的增殖能力有一定关系,但对于KGF如何促进细胞迁移,目前还不明确,其机理有待进一步研究。
本试验利用体外表皮创伤模型观察KGF对人表皮细胞的促迁移能力,进一步证实和肯定其在皮肤创伤愈合方面的巨大潜能,为临床应用奠定了良好基础。
参考文献
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[7]Marti G P,Mohebi P,Liu L,et al.KGF-1 for wound healing in animal models[J].Methods Mol Biol,2008(423):383-391.
第八章 动物细胞培养和生长过程 篇2
动物细胞生产和培养过程
8.1背景
尽管先前有许多调查者研究了动物细胞在试管中的习性。但是。1949年，这种能产生有用物质的动物细胞首次被利用。在当时，J.F Enders 证明了脊髓灰质炎病毒在培养的动物细胞中可以生长，而这种细胞源于灵长类动物的神经和非神经组织中。
简洁的总接一下这一伟大的探索工作，开始与19世纪80年代早期。根据论证白细胞能在躯体外分裂。这种细胞是通过观察注入在血清、淋巴或腹水中以切成片状的动物组织所得。（1907年）Ｒ．Hａｒｒｉｓｏｎ的悬在下面的淋巴当中的（蝌蚪骨髓）组织方法。而这种盖玻片密封在一个中间挖空的载玻片上。这项伟绩（１９１３年）由Ｃａｒｒｅｌ所继承和发展。他研发了一种维持外来物质特别是细菌培养的复杂方法，其他人很少有这种能力，然而，截至１９２８年，培养基的发展促进动物细胞的增长以至于Ｍａｉｔｌａｎｄｓ能够在装有切碎的老鼠或小鸡胚胎的试管中培养病毒。ｅｎｄｅｒｓ在脊髓灰质炎的工作中运用此方法。脊髓灰质炎的作用是有他和他的同事通过使用抗生素获得相当多的帮助，这些抗生素在十年前是非常流行的，２０世纪５０年代早期Salk发明的脊髓灰质炎疫苗是由猴子的肾和睾丸细胞在试管培养中生产的。一旦这种技术被确立，培养中生长的小鸡或其他原始的胚胎细胞生产其他疫苗。【麻疹病毒（１９５８年）。流行性腮腺炎病毒（１９５１年）、腺病毒（１９５８年）】
８．２从动物细胞培养中获得的不同产物
动物细胞过去是现在仍然是从培养动物细胞中获得最具有商业性的产物，目前，每年生产大约１．５＊１０９剂量的口啼疾疫苗，近似于纽卡斯尔病和马立克氏病的家禽疫苗。人类病毒疫苗以每年１０８剂或者较低一点的速度在运用。干扰素生产的过程也是一大规模，接近或超过这些运用于兽医疫苗的情况下，然而有利于具体的合成杂交瘤细胞相对于免疫学方面是毫无疑问的，在未来的十年里是举足轻重的。表８。１中列出已经或者可能在培养动物细胞过程中获得的主要产物，这并不是唯一的产物，而是表现着主要产物以及能在这些区域内获得的物质的类型。
８．３产物生产方法的综述
图８。１到８。３概括的描述了对于动物细胞培养体系中产物的发展。它包括三个阶段，第一个阶段是准备阶段，第二阶段是动物细胞培养阶段，第三阶段是产物的产生阶段。早某种体系上（荷尔蒙和免疫生物产物）最后一阶段是区别于单元细胞的生产方式。然而在其它方面，最后一阶段跟病毒细胞培养的传染有关或与诱生剂有关。（如干扰素，见表８。３）
对生产经营的很多努力涉及到质量控制系统，与此同时，在线和离线检测在生物技术领域中随处可见。质量控制测试的设计不仅能够确保使用的物质能够促进细胞或产物的发展，还能确保他们摆脱外来的生体，例如，污染物
图表８。２清楚的表明生长培养基的准备工作是一项艰难而又需要专门的技术的过程，当培养基所确定的组份容易控制时，最有困难的两种组份是水和血清。
水可以从多种资源中获得，甚至蒸馏和去离子作用后，水也可能包含着对细胞生长不利的物质。对此，格陵兰冰岛底部所融化的病是一种很有用的参考物质，贮备水的缺乏带来一些困难。细菌能在室温蒸馏水中达到１０５单元的含量，同时远离组成的变量，这种细菌的产物少部分可能是有毒的，在８０C贮藏的水通常被攻克，在这个温度下表面将无菌。
也可以制备没有血清的培养基，但并非所有的细胞可以再生。然而这种细胞培养基的结合对密封材料的产生没有多大用处。
以去除免疫球蛋白成分的血清在病毒生产体系方面最有用这种病毒生产体系是通过当地生产的血清包含的对生产病毒的抗体的一种体系，虽然买的和做实验的血清的价格不菲，但是室内生产是有可能的，血清质量的控制的彻底性对可靠的重复运转是很有必要的。在零下２０C贮存预先测试的血清是经常可取的，因为他能够代替新鲜血清质量减退的这些时光，（通常夏天较容易）。牛胎血清经常被应用于细胞生长发面，但是牛胎血清既贵又罕见。带有噬菌体支原体这样的物质也是最可靠的。也能成批成批的管擦牛胎血清的生长特性，由于来自幼地鼠地肾的细胞，９０％利润从成年牛的血清也可以得到。动物细胞能生长在两种不同类型的培养基上，如果多数动物细胞首次被运用到表层或者固体基质。那么他们可以被诱导分裂，正好相反，一些可能在悬浮液中被诱导自由生长，前者被称为单层细胞，应为他们在基质上形成一层厚壁细胞，即使在连续培养的添加组织也能形成，依赖基质生长的细胞被称为是悬浮细胞或非贴壁依赖性细胞。
我们认为只是生长的单层细胞比悬浮细胞有特别少的致癌基因（能使细胞致癌的基因序列），因此对于人类的消耗，这种细胞被用于生产物质，多种也证明此种 细胞比在悬浮液中的生长的细胞有能力生成更多的病毒毒性。但是如病毒或是产物从悬浮生长的细胞生产制造，那么多数过程会相对容易些，兽医所使用的产物按这种方法所得（脚嘴病毒），同时也包括a-干扰素以及有关杂交瘤细胞的免疫学生物特性。尽管在选择测试体系方面，后两种产物所使用的细胞被证明是可以致癌的，但是在生产阶段不会有什么危害，或者是优先使用单位细胞的产物。在表8.2中，有一个对于单层细胞使用有利和不利条件的总结。我们可以得出结论，在细胞类型方面能够生产商业性细胞是很有必要的。并且也需要两种必要的但不同的技术，下面将陈述两种不同的技术。
8.4单层细胞培养系统
获取基质的生产细胞系统可以被划分为两种类型，一种是增加设备单元的数量以扩大进程；另一种是多重和过程。通过增加设备的尺寸来实现扩大
8.4.1单层细胞生长的多重过程
传统的来讲，固定的玻璃瓶或者是培养皿内已经生成了单层细胞，这种瓶子有许多结构，被命名为brockway，roux ,Carrel,Baxter或Medical Flats，钠玻璃可能被使用，但是硼硅酸盐会更受欢迎，因为他尽管越复杂，但越坚硬越容易修理。那玻璃瓶也许会单独使用，但是经常固定在搁架上便于运输。能够使细胞生长在瓶的内表面而不是瓶底的系统，它的发展同样是滚瓶系统的发展。尽管所使用的矩形瓶和十字型瓶也能够转动，但是对于这个系统，圆柱型瓶被广泛使用，有许多瓶子能够达到180cm长，滚筒上边放着瓶子，而这样的滚筒放在机械支架上。一套标准的设备可以转动12个瓶子，6~10套支架可以组成一个生产单元，在意大利布雷西亚的Zooprofilattico Sperimentale大学学院有7000个瓶子在每四个培养箱里可同时转动。再次，滚动瓶系统被发展到了极限，对于已大量瓶子为媒介的细胞和病毒的生长同时还要保持无菌培养，所以这种增长是很难克服的，布雷西亚单元高度的自动化装置提高了这种方法的经济可行性。
8.4.2单层细胞生长的单元程序
20世纪60年代中期，关于单层细胞的培养单元程序得到发展，同时单元程序的发展现在已变成一项易于接受的首选的实用技术。最近，其他方面的创始人重新检查了这一系统的许多细节，结果跟随最近的发展，不同的系统将在下边描述
根据可靠的成功的多重过程的运转，被设计取代他们的单元模式跟随多重系统的基本模式，这样，在器皿中的一套弹簧片单元程序得到发展，同时使人联想到一架子的瓶子，这样的系统有一次性的聚苯乙烯、聚碳酸酯和钠玻璃组成。后期的发展是采用一叠盘子同时以直接构造的形式转动他们，要么以水平的形式转动他们，后期系统正在扩大密集利用的情况下，目前作为B或纤维素细胞干扰素的一种方式，在清理与细胞培养运行期间，这种系统的扩大反映着一系列工程技术困难与操作问题，按照这种方式装入容器的表层数量很有限，却有两种结果：
（a）磁盘双方都被使用，（b）以稀释形式生产产物正如生长培养基冲洗过后，而培养基要么达到饱和程度，要么至少半饱和程度，总共达到外面容器的容积。从已经发展的大范围多试管细胞的繁殖，我们看到了滚瓶系统的发展，系统达到2001量的大规模发展，近期的一套细胞大量生长的设备，Gyrogen有一排平行的试管组成，这种试管是从1001的量结合外界圆柱形壳在外部力量的驱动下转动。这套昂贵的设备可用来生产，但是是否合理的利用能得到经济上有力的价值好没有被证实。半空纤维中的试管收缩是唯一导致生物量的发展。对小规模来讲，在外界纤维以细胞生长的方式刺激动物组织结构或者通过纤维腔来促使营养培养基的渗漏。这是非常有可能实现的，在两种意义上，这种系统有些优势，正如废弃物质（含有细胞毒素），和产物能够从细胞当中分开，这种细胞是通过纤维的半透膜产生的。最近，这种自然系统已经发展到了0.21，同时在良好的发展计算机控制和检测系统得到了商业化的应用和发展。
目前，为了细胞和产物的生产，许多项目组利用填充层，例如B干扰素，口蹄疫病毒和猪水疱病病毒。经过玻璃球瓶内的聚苯乙烯小白球随着弹簧不锈钢带的变化而变化，然而，伴随着大多数便利的集中在辅助培养基贮藏中控制活性（PH和二氧化碳），通过循环流动的培养基，最基本的填充曾在多数系统中是很普通的，他们相对容易和扩展，这是由于处理圆柱形填充的机械故障很容易得到排除处理，正如玻璃作为一种基质。操作的可靠性得到提高，同时实验室研究的 在玻璃表层和细胞之间的关系也没有改变，更愿意不来说，当在一个熟悉的基质中形成产品时，控制新的生物产品的生产者几乎没有多大问题。
很显然，静态填充床没有他们自己的问题。跨层的斜度是相同的，检测培养细胞有一些难度，但不能放在显微镜下观察。通过检测循环的培养基的成分，（细胞生长的葡萄糖浓度，细胞分裂的乳酸脱氢酶活性好最终病毒解体），尽管后边的问题容易处理，但是不均一的多项系统问题仍然存在。
A．J.van Wezel发展了对于单层动物细胞生长的同种系统。1967年它表明细胞以火胶棉镀膜能生长在0.2mm的葡聚糖纤维素A50颗粒上，凭借微小的搅动，这种颗粒可以成悬浮状态，相对密度为1.05，同时当系统从它本身的方式搅拌时，细胞可以吸附在这种为载体上，由于这些最初的观察，众多的观察者已经表明可以达到5001的量。生长在为载体上的细胞产生物质是有可能的。最新报告表明，来自非洲的猿猴肾细胞脊髓灰质炎病毒的产量是存在一个现代的为载体表面。其他为载体有聚苯乙烯、聚丙烯甚至是玻璃微球体。然而，在大多数情况下似乎葡聚糖为载体提供了最合适的基质。
众多研究者已经能够成功可靠的用为载体系统来操作，然而，有些研究人员的实验还有很大的困难，涉及到研究者所希望生成的特殊细胞任然有些困难。特殊细胞本身是集体组成的产物，以及他生成次生产物的方法问题。源于其他合适设备与不合适设备的不当使用以及培养基选择的不恰当问题上。这些选择阶段或者是细胞与玻璃粉。首次关键性的联合或者时候起贴壁细胞的可重复性。
总之，对于基质有要求的细胞的生产，在此环境下，微载体成为首选方法。而且操作良好并且可靠，但是玻璃球的填充层能够提供一个可靠的后补系统。其他系统也会有一定的位置，为准备一种独特的细胞类型能够生长和生产产物提供的特殊的环境。
8.4.3悬浮细胞的生产过程
悬浮动物细胞的培养过程不同于细菌的培养，一条近期的评论描述了许多需要检测和控制的参数，所使用的设备是一个有较低的搅拌和通风度相当标准的发酵器。把传统方法当作一个系统，并且此系统已经增大到8000L。来自于幼地鼠肾细胞货真不同细胞的用于口啼疫病毒的商业产物，如此规模得益于仓鼠，也就是所谓的2FFA-3.同样，有Nsmalwa淋巴细胞所产生的a-干扰素，目前以同样的规模的相似设备来生产。搅拌驱使系统的最基本的修改等同于气升式发酵罐的运用。通过在发酵罐底部引进气泡来提供三料的混合。因为这些在移动也提上是非常有效的而且不会破坏细胞。传统的喷射会对动物细胞引起严重的破坏，这种喷射通过产生一些小的气泡试图增加气泡的表层区域的面积。溶氧水平在标准状况下本身下降15%一下或者上升到溶氧量以上才会有害。但在气液接口处的相互作用的细胞可能会导致细胞活性的损失。令人惊奇的是，起因于叶轮的飞快的速度造成的物理搅拌似乎没有多大伤害，然而，对于相关参数的效应和数量的研究中需要被保留着。
当传统的的不锈钢槽作为科技的主导时。科技不发达的国家可能会修改一些系统。对此通过外磁条力量来驱动，101搅拌瓶可以制造出许多有用的疫苗，（每年均有5*106剂）。印度尼西亚的泗水市安装了此系统。在此地，每个月将产生250000剂疫苗。同样Polgolla和斯里兰卡基本设备的安装也很到位。
生产细胞还是为这些细胞收集信息，动物细胞的连续培养是可行并且有用的方式。最近研究已经表明了在系统的计算机在线监测和控制的优势。购买相应的计算机硬件设备也比较容易。
然而动物细胞的连续型生产利用以及具有商业吸引力的细胞产物还，没有实现。
8.5后期过程
当动物细胞应用于原材料生产时，许多后期过程等同于蛋白质化学技术的其他领域。仍然考虑到存在些更多的独特细节的操作系统。例如，过滤、筛选操作，离心分离操作（适速），沉降操作，包析发的层析操作以及浓缩干燥（反渗透法），这些普通的加工技术很难应对，生物病毒物质的钝化，整个病毒颗粒活性子单元的产生以及用于有用物质的形成具有划时代意义。而这种划时代是以动物细胞为根据的独特的处理工程。
8.5.1钝化作用
尽管许多疫苗是由易感染的病毒粒子形成，但是一些被杀死或钝化。钝化在确保接受着没有没有危险是非常重要的，钝化药物通常使用甲醛，然而用B—丙醇酸内酯来钝化狂犬病毒。进来。用亚胺（乙炔和吖丙叮）来钝化脚口疾病病毒。然而亚胺会使脚口疾病病毒的结构发生轻微的变化。甲醛与衣壳体交联形成更稳定的结构。其他钝化法的紫外线辐射和缩水甘油醛，在所有钝化方法中，确保钝化的病毒具有单分散性是非常重要的，以至于失活剂不能阻止病毒在中型团块中有效的钝化。
8.5.2亚基的形成
病毒疫苗必须考虑接受疫苗者的危险，如果不适当的钝化可能会形成亚基。依靠亚基的裂解最终将会形成一小部分致疾病的病毒。能够形成亚基的病毒有狂犬病毒，肝炎病毒、单纯性疱疹、巨细胞病毒和流感病毒。近来，尝试从流感病毒中分离血凝素糖蛋白免疫原表明疫苗的有效性了、，尽管有效性和天然病毒不同，到目前为止，研究表明从病毒中分离出的糖蛋白的竞争性比原始病毒低。但当足够的材料管理可以得到足够的保护反应。8.5.3产品配方
活的病毒疫苗通常包含1~4种不同类型的病毒。每剂有10活性病毒，有些材料需要冷冻干燥保存再生物保护剂中像流感病毒，人或牛的牛痘病毒或血清蛋白谷氨酸盐和磷酸盐离子。另一方面，杀死的病毒疫苗大约10为一剂.这些混合物被称为佐剂，佐剂有强效的生物免疫原特性。佐剂的化学组成是不均等的，像强心苷、皂素、各种铝盐（氢氧化物，硫酸盐。磷酸盐）和一些确定的油脂，与水中悬浮的病毒均匀的发生生物交联结合形成水油乳状混合物。油水乳状物在含有去垢剂的无机盐水溶液中经过第二次乳化作用。这些物质的作用许多是一致的，他们促使身体和化学免疫系统最大速率合成大量的有用抗原。
8.6 基因工程动物细胞和细菌
在原核细胞和真核细胞中插入确定的核酸序列的能力对于细菌和动物细胞具有很广泛的意义。作为一种产物，蛋白质能够插入特定的核酸。而基于动物细胞的活的病毒疫苗形成过程不可能取代基于基因工程细菌的过程。这是清楚的，一些动物细胞生产的胰岛素和一些α-干扰素商业上用原核生物生产。另外一些像用于口蹄疫病毒
走路可促进大脑细胞生长 篇3
研究人员对120名55～80岁的男性和女性进行了试验，这些男女每周要进行3次、每次40分钟的散步。通常，大脑会随着年龄的增加而萎缩。但据美国科学促进会年会公布的报告，实验开始一年后对实验对象的大脑扫描显示，包括海马体在内的大脑核心区域最多增长了2%。
研究人员对此解释说，这一增长相当于大脑年轻了两岁，标志着大脑健康的“巨大”改善。而对照组实验对象（研究人员只要求他们做一些简单的伸展运动）的同一大脑区域却萎缩了约1.5%。
研究人员表示，即使进入老年阶段，大脑仍然可以改变。尽管会出现萎缩和认知能力下降，但似乎并不像此前认为的那样不可逆转。身体活动似乎是影响老年阶段大脑认知健康和认知能力最积极的方式之一，而身体活动加上一些脑力锻炼（例如猜谜）也有益于大脑健康。研究人员指出，进行脑力和身体锻炼越早越好。越早开展活动锻炼，身体就越健康。不同的锻炼改善大脑的方式略有不同，关键是要找到自己喜欢的锻炼方式。
（曹淑芬编译）
细胞生长 篇4
关键词：成纤维细胞生长因子19,成纤维细胞生长因子受体4,胃癌
胃癌是威胁人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内病死率排第2位[1]。手术切除和其他综合治疗的应用未显著改善胃癌患者的生存率。随着分子生物学技术的发展,胃癌分子靶向治疗给临床医生提供药物治疗的新模式。
成纤维细胞生长因子受体4 (fibroblast growth factor receptor 4,FGFR4)属于酪氨酸激酶受体家族, 在肿瘤的生长、分化、转移中起重要作用[2]。近年来研究表明,前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌等肿瘤中FGFR4过表达,并且FGFR4表达上调与乳腺癌的耐药性相关。目前越来越多的学者认为,成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor 19,FGF)是肿瘤治疗的潜在靶点[3]。成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)是FCF家族成员,其在肝癌、结肠癌、胰腺癌等许多肿瘤中显著表达。目前认为FGF19是FGFR4的特异性配体[4]。两者相互结合后能抑制核因子 -κB和细胞凋亡信号,并上调细胞增殖的有关基因表达。在肿瘤坏死因子-α 处理的细胞中, FGFR4的激活能引起核因子 κB抑制物激酶 β 活性下降,导致核因子 -κB在细胞中减少,减弱细胞凋亡效应。ROIDL等[5]研究表明,FGFR4能启动肿瘤生长,尤其是其高表达或结构性激活时,导致肿瘤细胞的增殖和生长,并与肿瘤的侵袭和转移相关。目前有关FGFR4和FGF19在胃癌中的表达及作用的报道相对较少。本研究通过免疫组织化学染色法分析50例可切除胃癌标本中FGF19和FGFR4的表达,旨在探讨其在胃癌中的作用,为FGF途径治疗胃癌提供基础。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2011年 ~2014年在海南省人民医院行手术切除且经病理证实的胃癌组织标本50例,所有患者术前未接受放、化疗或分子靶向治疗。所有标本经家属签字同意,并经医院伦理委员会同意通过。胃癌患者平均年龄(62.4±6.5)岁,其中胃体癌20例,胃窦癌22例,贲门癌8例;男性40例,女性10例;低分化23例,高分化27例。上述组织标本经4%甲醛固定,石蜡包埋,4μm切片。通过苏木精 - 伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色对胃癌进行病理分级和分型。依据美国癌症联合委员会胃癌TNM分期标准进行分期。
1.2免疫组织化学法
1.2.1试剂鼠抗人单克隆FGF19和FGFR4抗体购自美国Sigma公司,链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化酶(streptavidin- peroxidase,SP)免疫组化检测试剂盒、二氨基联苯(Diaminobenzidine,DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2染色通过10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(p H= 6.0)高压加热法,对胃癌组织以及癌旁正常胃组织切片,进行抗原修复,以消除内源性过氧化物酶的活性。经10%山羊血清封闭1 h,滴加一抗(鼠抗人Anti-FGF19,鼠抗人Anti-FGFR4,稀释浓度为1∶ 100),置入4℃孵箱过夜,与辣根酶标记的二抗反应,DAB显色,苏木精复染胞核,脱水,封片,置入倒置显微镜下观察并拍照。以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗作阴性对照组。 1.2.3判定标准细胞内出现棕色或褐色颗粒者为染色阳性,通过阳性细胞百分率和染色程度进行评分[6]。在每张组织切片的高倍镜下(×400)随机选取10个视野,在视野中计数100个胃癌细胞,染色细胞百分率计分标准:染色细胞百分率≤10%为0分, 11%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。染色强度计分标准:浅棕色为1分,棕色为2分,深棕色为3分。将染色细胞百分率的分值和染色强度的分值进行乘积评分,最后的得分作为染色程度进行统计学分析。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,应用配对样本Wilcoxon秩和检验,多变量间相关性分析用多元线性回归分析,两组变量间的相关性分析应用Spearman秩相关分析,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1胃癌组织中FGFR4和FGF19的表达
从FGFR4和FGF19在胃癌组织中的免疫组织化学法染色图片可见,FGFR4和FGF19在胃癌细胞中呈棕黄色颗粒,同一个视野下染色细胞数量较正常胃组织多。表明FGFR4和FGF19在胃癌中高表达。以最后的评分代表FGFR4和FGF19免疫组织化学法染色程度,分值的高、低代表FGFR4和FGF19表达程度的高、低。见附图。
对胃癌组织中FGFR4和FGF19免疫组织化学法染色评分的配对样本Wilcoxon秩和检验结果进行分析,胃癌组织与正常胃组织中FGFR4、FGF19的表达比较,差异有统计学意义(P <0.01);FGFR4和FGF19在胃癌中高表达,表明FGFR4和FGF19与胃癌的发生、发展有相关性(见表1)。FGFR4和FGF19表达与胃癌组织病理特征的相关性见表2。
2.2FGFR4表达与胃癌病理学特征的相关性
将FGFR4在胃癌组织中的免疫组织化学法染色评分结果与患者的性别、年龄、肿瘤浸润程度、分化程度、淋巴结转移、远处转移及病理分期进行多元性回归分析。结果仅病理分期进入方程。GFFR4在胃癌组织中的表达程度与TNM病理分期呈正相关, 分期越高,FGFR4表达越多,差异有统计学意义。见表3。
为排除变量间的共线性,本实验对FGFR4在胃癌中的染色程度与年龄、性别、浸润程度、分化程度、 淋巴结转移及远处转移进行两变量的秩相关分析。结果表明,FGFR4在胃癌中的表达与性别、年龄、远处转移、分化程度无相关性;而与淋巴结转移、病理分期有相关性,差异有统计学意义。见表4。
2.3FGF19表达程度与胃癌病理学特征的相关性
将FGF19在胃癌组织中的免疫组织化学法染色评分结果与患者的性别、年龄、肿瘤浸润程度、分化程度、淋巴结转移、远处转移及病理分期进行多元性回归分析。结果仅病理分期进入方程,FGF19在胃癌组织中的表达程度与TNM病理分期呈正相关,分期越高,FGF19表达越多,差异有统计学意义 (见表5)。FGF19在胃癌中的染色程度与年龄、性别、浸润程度、分化程度、淋巴结转移及远处转移进行两变量的秩相关分析。结果表明FGF19在胃癌中的表达与淋巴结转移、病理分期有相关性,与性别、年龄、远处转移、分化程度无相关性(见表6)。
2.4FGFR4和FGF19表达的相关性
FGF19在胃癌组织中的表达与FGFR4有相关性。FGFR4和FGF19在胃癌组织中表达的高、低与其在正常胃组织中的表达程度无相关性。见表7。
3讨论
胃癌的病因和发病机制目前还没有完全了解, 慢性炎症、理化致癌因素、不良饮食习惯、幽门螺杆菌感染、遗传因素等是现在已知的胃癌发病的高危因素。腺癌是胃癌肿瘤中最常见的病理类型。FGF信号通路在细胞增殖、分化、血管生成和创伤修复等许多生物学过程中发挥重要作用[7]。MIURA等[8]研究表明FGF的过表达或扩增与肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、白血病、胰腺癌、结肠癌及前列腺癌等恶性肿瘤的发生、发展相关。许多研究报道FGF的过表达、 异位表达、多态性及其受体阻断与人类很多肿瘤相关,如胃癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌和骨髓瘤等。
FGF19是成纤维细胞生长因子家族的成员,其与特异性受体FGFR4结合能抑制核因子 -κB信号通路和细胞凋亡,上调细胞增殖的有关基因表达[9]。 肿瘤细胞中FGFR4激活后,可以启动细胞内有关信号转导通路,刺激肿瘤细胞增殖以及抑制细胞凋亡, 参与肿瘤的浸润和转移过程。
FGFR4和FGF19在许多实体性肿瘤中显著表达,如肝细胞癌、肺癌及结肠癌。有研究显示, 通过FGF19阻断性抗体可以抑制FGFR4与FGF19的相互作用[10]。在肝细胞癌细胞株中,FGF19阻断性抗体能抑制FGF19作用的成纤维细胞生长因子受体底物2以及有丝分裂原激活蛋白激酶的信号通路;在结肠癌细胞株移植的小鼠模型中,FGF19阻断性抗体能显著抑制小鼠肿瘤生长;在FGF19转基因的小鼠模型中,FGF19阻断性抗体明显抑制肝细胞癌的生长与形成,提示FGF19可能与肿瘤的形成与发展相关。FGFR4在调节FGF19的活性中发挥重要作用。 Meta分析表明,FGFR4 A388G基因型相对FGFR G388G纯合子能增加肿瘤发病的风险,如乳腺癌和前列腺癌[11]。
本研究结果表明,FGFR4和FGF19在正常胃组织中低表达,在胃癌中显著高表达,提示FGF19-FGF R4信号通路可能在胃癌的发生、发展中起重要作用。 而且FGFR4和FGF19表达与病理分期和淋巴结转移有相关性,其表达越高表明肿瘤的分期越晚,淋巴结转移的数目越多。提示FGFR4和FGF19参与胃癌的浸润和淋巴结转移过程。此外,FGFR4与FGF19在胃癌组织中的表达与其在正常胃组织中的表达无相关性,表明其不会随正常胃组织中表达程度的变化而变化,胃癌癌前病变中FGFR4和FGF19表达不会影响其在胃癌中的表达。FGFR4和FGF19在胃癌组织中的表达程度呈正相关,说明存在配体 - 受体的关系。
注射用促肝细胞生长素说明书 篇5
注射用促肝细胞生长素对重型肝炎的效果是很不错的。引起重型肝炎的原因很多，包括乙肝病毒感染，甲、戊病毒及其它泛嗜病毒如EBV、CMV等感染，药物中毒，慢性酒精性肝损害等等，其临床分型常用急性、亚急性及慢性重型肝炎来划分。重型肝炎因其病情重、预后差而影响患者寿命，在我国，引起重型肝炎的最常见原因为乙型肝炎病毒感染，约占所有重型肝炎的三分之二。
注射用促肝细胞生长素系从新鲜乳猪肝脏中提取纯化制备而成的小分子多肽类活性物质。注射用促肝细胞生长素能明显刺激新生肝细胞的DNA合成，促进损伤的肝细胞线粒体、粗面内质网恢复，促进肝细胞再生，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能。注射用促肝细胞生长素能改善肝脏枯否细胞的吞噬功能，防止来自肠道的毒素对肝细胞的进一步损害，抑制肿瘤坏死因子(TNF)活性和Na+,K+-ATP酶活性抑制因子活性，从而促进肝坏死后的修复。同时具有降低转氨酶、血清胆红素和缩短凝血酶原时间的作用。
注射用促肝细胞生长素对四氯化碳诱导的肝细胞损伤有较好的保护作用。对D-氨基半乳糖诱致的肝衰竭有明显的提高存活力的作用。注射用促肝细胞生长素在临床上适用于各种重型病毒性肝炎(急性、亚急性、慢性重症肝炎的早期或中期)的辅助治疗。
促肝细胞生长素致低血糖反应1例 篇6
【关键词】 降纤酶;脑梗塞;观察;护理
【中图分类号】 R587.3【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0151-01
作者在应用促肝细胞生长素治疗酒精性肝病合并2型糖尿病时曾发生1例低血糖反应,现报告如下。
1 病例资料
患者,男,46岁,因“全身乏力、食欲不振5年,加重伴黄染浮肿半个月”而入院治疗,既往饮酒史25年,平均每日一斤,糖尿病病史3年,无药物过敏史,查体,体温36.5℃,脉搏76次/分,血压90/60mmHg,步入病室,精神差,查体合作,全身皮肤黄染,巩膜感染,浅表淋巴结未触及肿大,双肺呼吸音清,肝肋下一指,压痛(±),脾肋下未触及,双下肢指压性浮肿,神经系统查生理反射正常存在,病理反射未引出,心电图示大致正常心电图,空腹血糖13.3 mmol/L、超声示,肝右叶155cm,脾不大,尿常规示,尿糖++++,谷丙转氨酶(ALT)95U/dl,谷草转氨酶(AST)170U/ dl,AST/ALT1.79,谷酰转肽酶(GGT)1714U/L,碱性磷酸酶(ALP)225U/L胆碱酯酶(CHE)4083U/ml,白蛋白(ALB)27g,球蛋白(GLO) 32g,白球比(A/G)0.8,总胆口素TBTL99.0,直接胆口素DBIL61.6,间接胆口素(BIL)37.4,诊断为酒精性肝病。入院治疗,营养保肝,退黄,降糖及对症治疗。24天后查体,体温36.0℃,脉搏80次/分,血压90/60 mmHg,全身皮肤粘膜无感染,浅表淋巴结未触及肿大,双下肢无浮肿;神经系统查,生理反射正常存在,病理反射未引出,血糖6.9mmol/L,尿常规示均阴性,r-GT800 U/L。第25日给予5%葡萄糖200ml促肝细胞生长素80mg静脉滴注30d/min,静点拔出后立即出现面色苍白,大汗,四肢无力,心悸,饥饿感,即测血压80/50 mmHg,脉搏120次/分,血糖2.2 mmol/L。立即5%葡萄糖250ml,50%葡萄糖40ml静脉滴注,症状逐步缓解,45分钟后再测血糖为4.7 mmol/L,后进食,症状消失。
2 讨论
细胞生长 篇7
关键词：厚朴酚,视网膜母细胞瘤,增殖
厚朴酚是一种从厚朴中草药中提取出的一种联苯羟基复合物, 在医药行业具有广泛的用途, 临床上主要用于疼痛, 感冒以及抗焦虑等方面的治疗[1]。现代药理学研究表明, 厚朴酚在体外能具有抗炎和抗微生物效应, 并能抑制多种肿瘤细胞增殖[2,3]。但是否对视网膜母细胞瘤也具有抑制作用, 目前依然不清楚。本研究试图以视网膜膜细胞瘤HXO-RB44细胞为研究对象, 探讨其对该细胞的生长增持有无影响。
1 材料与方法
1.1 试剂
厚朴酚购自Sigma, 纯度为99.9%, 用二甲亚砜 (DMSO, Sigma) 溶解。胎牛血清、RPMI-1640培养基分别购自杭州四季青和Invitrogen公司。台盼蓝和四甲基偶氮购自Amreco, 碘化乙啶和RNA酶分别为Sigma和上海生工产品。
1.2 细胞培养
人视网膜母细胞瘤细胞HXO-Rb44购自中科院上海细胞库, 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基, 于37℃, 5%CO2, 饱和湿度培养箱中培养, 2~3天传代一次。
1.3 实验分组及细胞处理
细胞生长至对数期后, 用0.4%台盼蓝鉴定细胞活性, 当活性在98%以上的细胞才用于实验。分为实验室组和对照组。其中实验组当中根据厚朴酚的终浓度, 设5μM, 10μM, 20μM, 40μM, 共4个浓度组。对照组仅用0.1%的二甲亚砜处理。
1.4 MTT检测细胞增殖情况
将上述培养的细胞密度调整为105/ml, 按180μl/孔接种于96孔板。根据不同的实验目的, 加入不同浓度的厚朴酚, 每浓度设3个复孔。3 7℃, 5%C O2条件下继续培养24~72h。孵育结束后, 每孔加入20μl MTT溶液, 37℃继续培养4h。去除上清, 加入200μl二甲亚砜并避光震荡10~15min。震荡结束后用酶标仪获取各孔的O D值 (波长:490nm) 。生长抑制率 (%) = (1-实验组OD值/对照组气OD值) ×100%。
1.5 流式细胞学检测细胞周期和凋亡
细胞分组和处理同上, 收集处理后的细胞, 800rpm离心5min, PBS洗涤后用70%乙醇固定, 4℃过夜后800rpm离心5min, 弃固定液。随后加入20μl RNA酶于37℃处理30min, 加入800μl PI染色液, 40℃避光30min, 用流式细胞仪检测188nm波长下的红色荧光, 并用Modfit LT软禁计算各期细胞数的百分比。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件对数据进行分析处理, 数据用±S表示。各数据组间比较用one-way ANOVA检验。实验组和对照组的比较采用Dunnett’s t检验, P<0.05判定差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 厚朴酚对网膜母细胞瘤细胞增殖的影响
MTT结果显示, HXO-RB44细胞经不同浓度的厚朴酚作用后, 和对照组相比, 24~72h内对细胞均有不同程度的抑制作用, 其抑制效果随着厚朴酚浓度的递增而增强 (P<0.0 5) , 同时, 厚朴酚对HXO-RB44细胞的抑制效应还具有时间依赖性, 即随着作用时间的延长, 抑制效应更显著, 见表1所示。
*与对照组相比, p<0.05;▲各浓度组间两两比较, p<0.05
2.2 厚朴酚对网膜母细胞瘤细胞生长周期的影响
厚朴酚作用网膜母细胞瘤细胞24h后, 和对照组相比, 5~40μM厚朴酚均能增加S期细胞数量, G0/G1比例明显较少。随着厚朴酚浓度的增加, S期细胞随之增多。当其浓度为40μM时, G0/G1比值为12.35%。
*与对照组相比, p<0.05;▲各浓度组间两两比较, p<0.05
3 讨论
视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的恶性肿瘤之一。患儿双眼均可发病, 近年的流行病学证据显示发病率有升高的趋势。随着治疗水平的提高, 目前视网膜母细胞瘤的治疗不再以降低死亡率为目的, 而是保留眼球和现有视力。但事实上, 大多数患儿往往是有明显的白瞳或斜视后才开始就诊, 延误了治疗时机, 最终还是要摘除眼球, 因此患者的生活质量并未得到明显的改善。因此依然有必要进一步探索有效的治疗方法和药物。
厚朴酚是重要厚朴的主要成分, 有研究显示它对种肿瘤来源的细胞有抑制作用。100μM的朴酚可以抑制肿瘤细胞增殖, 并诱导其凋亡, 它可能通过激活caspase途径或抑制血管生成而参与其抗肿瘤活性[4]。在本研究当中, M T T结果显示, 不同浓度的厚朴酚能显著抑制HXO-RB44的增殖, 随着浓度的增加, 其抑制效应不断增强, 并与作用时间成正相关。流式细胞检测结果证明, 不同5~40μM的厚朴酚作用HXO-RB44细胞24h后, 能明显增加S期细胞的数目, 表明它对肿瘤细胞生长周期具有阻滞作用。随着药物浓度的递增, 效应逐渐增加。当浓度为40μM时, S期细胞比例达64.58%, G0/G1期细胞比例降至12.35%。证明厚朴酚能抑制细胞S期DNA的复制, 从而使细胞无法进入G 2/M期。
厚朴酚抑制HXO-RB44细胞增殖的机制目前依然不清楚。有报道证实厚朴酚能以时间和剂量依赖性方式抑制HL-60细胞增殖, 促进凋亡。该效应可被caspase-3和caspase-2的抑制剂所阻断。另外, 也可能通过p53途径抑制人结肠癌细胞凋亡[5,6,7]。厚朴酚对H X O-R B 4 4细胞的生长抑制是否也是通过caspase和p53途径发挥作用, 还有待进一步研究。
参考文献
[1]Tsai YC, Cheng PY, Kung CW, et al.Beneficial effects of magnolol in a rodent modelof endotoxin shock[J].Eur J Pharmacol, 2010, 641 (1) :67-73.
[2]Shen JL, Man KM, Huang PH, et al.Honokioland magnolol as multifunctional antioxidativemolecules for dermatologic disorders[J].Molecules, 2010, 15 (9) :6452-6465.
[3]Kuo DH, Lai YS, Lo CY, et al.Inhibitoryeffect of magnolol on TPA-induced skininflammation and tumor promotion in mice[J].JAgric Food Chem, 2010, 58 (9) :5777-5783.
[4]Li HB, Gao JM, Ying XX, et al.Protectiveeffect of magnolol on TBHP-induced injury inH460 cells partially via a p53 dependentmechanism[J].Arch Pharm Res, 2007, 30 (7) :850-857.
[5]Zhong WB, Wang CY, Ho KJ, et al.Magnololinduces apoptosis in human leukemia cells viacytochrome c release and caspase activation[J].Anticancer Drugs, 2003, 14 (3) :211-217.
[6]Hoi CP, Ho YP, Baum L, et al.Neuroprotective effect of honokiol and magnolol, compounds from Magnolia officinalis, on beta-amyloid-induced toxicity in PC12 cells[J].Phytother Res, 2010, 24 (10) :1538-1542.
细胞生长 篇8
1 试验
1.1 钛片的制备和碱活化
均匀剪出1 cm×1 cm的钛箔片若干;配制5 mol氢氧化钠溶液:分析天平称取200 g氢氧化钠, 溶解倒入容量瓶定容至1 L, 摇匀。钛片的碱活化处理:采用碱活化的方法在钛表面形成多孔结构, 取部分干燥清洁的钛片浸没在5 mol氢氧化钠溶液中, 60℃反应24 h, 用去离子水超声清洗后在80℃去离子水中再反应24 h, 最后用去离子水超声清洗, 干燥。
1.2 人脐静脉内皮细胞的培养
无菌条件下取健康剖宫产产妇的新鲜脐带 (长度约20 cm) ;将切去针尖的不锈钢注射器针头插入脐静脉一端, 用止血钳固定;注入生理盐水冲洗脐静脉直至冲洗液清亮;在脐静脉的另一端用同样的方法固定另一个注射器针头;两端用一次性注射器封闭。脐静脉内注入适量的0.1%II型胶原酶 (约10 m L/20 cm) , 37℃消化15~20 min后收集消化液;用含15%新生牛血清的F12培养液冲洗脐静脉1次, 收集冲洗液, 同消化液一起离心 (1 200 r/min, 8 min) 。弃上清, 加入F12完全培养液 (含20%FBS、20μg/m L ECGS、2 mmol/L-谷氨酰胺) 4 m L, 反复吹打重悬细胞, 移入塑料细胞培养瓶, 37℃、5%CO2条件下静置培养。隔日换液, 直至细胞融合度达80%~90%即可传代。
1.3 人脐静脉内皮细胞外基质的构建
抛光钛片和碱活化的钛片经高温高压灭菌后置于24孔板中, 每孔中加入1 m L密度为1×106cells/m L的HUVECs细胞悬液, 该接种密度基本可以保证HUVECs在钛片形成融合的单层。37℃、5%CO2条件下继续静置培养7 d后, 加入含20 mmol氨水和0.5%Triton X—100的PBS缓冲液, 脱去细胞成分, 暴露细胞外基质。20 min后用PBS冲洗5次, 每次3 min。
1.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的表征
脱去细胞外基质的样品在3%的戊二醛溶液常温固定30 min, PBS清洗后经过梯度酒精脱水 (50%、70%、80%、90%、100%两次, 每次15 min) , 醋酸异戊酯脱醇 (不少于1 h) , 临界点干燥后喷金, 扫描电镜 (SEM, QUANTA 200, FTI, Holland) 观察。测定细胞外基质改性前后钛表面的水接触角来反映材料的亲疏水性。碱腐蚀前后的钛片表面通过漫反射红外光谱 (DR-FTIR, IR 550, Nicolet, Madison, USA) 表征钛表面的基团变化情况。千万分之一天平 (Sartorius ME5, German, Sartorius AG) 称量细胞外基质改性前后样品的质量。
1.5 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的细胞相容性
无菌的碱活化钛片及HUVECs细胞外基质改性后的钛片置于24孔板中, 加入300μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HU-VECs (2×104cells/m L的HUASMCs) 细胞悬液, 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 贴壁8 h后将样品转移至新的培养板, 加入1 m L新F12完全培养液。分别培养1 d, 3 d后各取出三个样品, PBS清洗后用2.5%戊二醛固定。细胞骨架蛋白F-actin免疫荧光染色的方法来定位和观察细胞, 荧光显微镜下观察。
将各组无菌的样品置于24孔板中, 加入400μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HUVECs细胞悬液 (2×104cells/m L的HUASMCs) , 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 分别在培养1 d和3 d后弃去旧的培养液, 然后每孔加入CCK-8反应液400μL (含有15%FBS和10%CCK-8试剂的F12培养基) , 37℃孵育4 h, 轻轻摇匀后吸出200μL反应液于新的96孔板中, 450 nm测光密度值 (OD值) , OD值大小可以反映样品上黏附的HUVECs (HUASMCs) 的数目。
1.6 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的血液相容性
富血小板血浆 (PRP) 的制备:志愿者的新鲜静脉全血, 加入含3.8wt%枸掾酸钠 (Na3C6H5O7·2H2O) 的抗凝剂, 全血与抗凝剂的体积比为9∶1, 充分混匀后离心 (1 500 r/min, 15 min) , 取上层淡黄色的液体即为PRP。
血小板在材料上的黏附和SEM检测:将光滑钛片 (Ti) 和碱活化后的多孔钛片 (Ti-OH) , 以及HU-VECs细胞外基质改性后的钛片 (Ti-ECM和Ti-OH-ECM) 分别置于干净24孔聚苯乙烯的细胞培养板中, 每孔加入200μL PRP覆盖实验样品, 37℃, 5%CO2条件下孵育1 h后吸出PRP, 加入PBS后轻轻震荡, 3次洗涤以排除非特异性吸附的血小板。黏附血小板的样品用3%的戊二醛溶液室温固定30 min, PBS洗涤, 然后常规脱水脱醇处理, 临界点干燥后喷金, SEM观察。
2 结果与讨论
2.1 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的SEM形态学观察
高密度接种的HUVECs在抛光钛片及碱活化钛片上连续培养7 d后, 加入脱细胞液后, 样品表面已无可见细胞成分, 细胞外基质得以暴露。光滑钛片上细胞外基质与基底的结合力较弱, 局部区域出现了脱落的现象 (图1B) , 高放大倍数下残留的细胞外基质呈现出颗粒状的分布, 无明显纤维结构。但在碱活化的粗糙表面, 细胞外基质呈现均匀的分布, 除了颗粒状物质存在外, 还有均匀的纤维网络状结构, 与基底的多孔结构有着明显区别, 高倍镜下细胞外基质的纤维清晰可辨 (图1D) 。
2.2 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的接触角测量和DR-FTIR检测
HUVECs在光滑和多孔钛片上分泌和沉积细胞基质后, 引起钛片表面亲水性的明显改变 (图2) 。在抛光的钛片上, 细胞外基质改性后接触角均值有所升高, 但这种差异并不具有统计学意义。细胞外基质改性后的光滑钛片上不同部位的接触角差异较大, 最高为84.5°, 而最低仅为22.5°, 这种接触角的不均匀可以进一步证明细胞外基质在光滑钛片上部分脱落的情况。相反, 细胞外基质改性后的碱活化钛片的接触角有显著的增高, 这种增高有统计学意义 (P<0.01) 。
HUVECs细胞外基质改性前后的抛光钛片和碱活化钛片的DR-FTIR图谱表明, 由于细胞外基质在抛光钛片上的脱落, 使其DR-FTIR图片上并没有出现明显的新的吸收峰, 而2 365 cm-1处的共同的吸收峰则可能是空气中CO2吸收峰。钛表面暴露在空气中能迅速形成一层氧化物薄膜, 表面含有少量的羟基[7], 除了碱活化所产生的3 405 cm-1处的-OH吸收峰之外, 还有许多新的吸收峰出现, 包括2 960 cm-1和2 916 cm-1处的C-H吸收峰, 1 650cm-1处的C=O吸收峰, 以及2 916 cm-1处的N-H吸收峰, 进一步证明了细胞外基质在碱活化表面的成功构建 (图3) 。
2.3 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞外基质分泌量
如图4所示, 细胞外基质在光滑钛和碱活化钛上构建后, 后者的细胞外基质质量明显高于前者, 光滑钛上细胞外基质的质量不均一, 最高可达0.06 mg, 最低只有0.02 mg, 进一步补充说明细胞外基质在光滑钛表面有部分脱落现象, 而碱活化钛片构建细胞外基质更具有质量稳定性。一方面, 钛的粗糙度能够影响蛋白质在钛表面的吸附, 随着粗糙度增大, 表面积增加, 蛋白质的吸附总量也是增加的[8—10], 另一方面, 钛表面的羟基越多, 与蛋白的反应活性越高[11]。
2.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞黏附及增殖
体外接种HUVECs的CCK测定结果表明 (图5) , 不论是培养1 d或者3 d, 碱活化的钛片上HU-VECs黏附数量的平均值与光滑钛片上相比较有一定程度的降低, 但两者间没有统计学差异。不论是在抛光的钛片还是碱活化的钛片上构建细胞外基质后, HUVECs黏附的数量均有明显的增加, 且这种增加有统计学差异。碱活化后使得钛片粗糙度增加, 而粗糙表面往往会对内皮细胞的生长起到抑制作用[12,13], 细胞外基质改性后的碱活化钛片上细胞黏附的平均数量比同样经细胞外基质改性后的光滑钛片上的数量相比有一定的提高, 但没有显著差异。
HUASMCs在各组样品上黏附1 d、3 d的荧光显微结果和细胞毒性检测结果 (图5) 显示, 各组样品均促进平滑肌细胞的黏附与增殖, 细胞外基质改性后的Ti和Ti-OH的表面更有利于平滑肌细胞的生长, 且碱活化组钛经细胞外基质改性后表面的平滑肌细胞增长与改性前相比有统计学意义 (P<0.05) , 研究表明平滑肌细胞在血管内的正常生长对控制内皮细胞的形态和表型有重要作用。
2.5 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的血小板黏附及激活
体外血小板黏附实验结果表明 (图7) , 在抛光的钛片上有大量的血小板黏附, 血小板团聚并伸出大量的伪足, 说明血小板激活程度很高;由HUVECs构建细胞外基质后, 血小板黏附的数量有一定程度上的减少, 但血小板的团聚和激活程度 (形态上) 与光滑钛片基本相似。碱活化处理可以明显减少血小板在钛片上的黏附[5,14], 血小板的团聚程度没有明显改变, 但血小板伸出的伪足有明显减少;在碱活化钛片上进一步沉积细胞外基质, 使得血小板黏附数量进一步降低, 血小板团聚程度降低, 大部分血小板呈圆形, 只有少数伸出伪足[1]。
3 结论
促肝细胞生长素的质量研究 篇9
促肝细胞生长素是从健康乳猪肝脏中提取的小分子生物活性多肽物质, 主要成分为HGF, 能刺激正常肝细胞DNA合成, 促进肝细胞再生, 其制剂为注射用促肝临床上主要用于各种重型病毒性肝炎 (急性、亚急性、慢性重症肝炎的早期或中期) 的辅助治疗, 是我国研制治疗肝病的一类新药[5]。
2试验材料与仪器
2.1 试验材料
新鲜的未哺乳小牛的肝脏 (哈尔滨市肉类联合加工厂提供) 。
2.2 主要试剂
氧氯化磷、氢氧化钾、五氯化磷、8%盐酸、乙腈、磷酸三乙酯、甲醇、氯仿、氯化钠。
3方法与结果
生产工艺线路为:新鲜小牛肝脏
3.1 合格的小牛肝脏准备:
取新鲜小牛肝脏, 目检, 表面应光滑, 无任何豆状突起, 色泽为粉红色。将合格的小牛肝脏盛装于洁净的塑料袋中, 密封, -18℃以下冷冻保存。
3.2 新鲜小牛肝脏匀浆液制备
将新鲜的小牛肝脏洗净, 剔除筋膜, 切成5～10 cm的小块, 按总量比例1:1 (纯化水:肝脏) 加人纯化水, 在胶体磨通人冷却水的条件下, 匀浆4次, 得肝脏匀浆液。
3.3 匀浆液冻融提取
将匀浆液于-18℃冷冻, 冻实后, 室温缓慢化冻, 完全融化后, 再将其于-18℃ 冷冻, 如此反复5次, 破碎肝脏细胞, 提取多肽[4]。
4确证组份的试验
注射用促肝细胞生长素是用小牛肝脏经提取、分离、精制而得的促肝细胞生长素溶液经冻干而制得。其主要成份为促肝细胞生长素及其他小分子多肽, 为证明其组分, 我们按国家药品标准“促肝细胞生长素溶液”中鉴别项下实验方法和高分子量物质检查方法对促肝细胞生长素组份进行了以下试验, 以确定研制的注射用促肝细胞生长素组分为促肝细胞生长素。并对中试产品用促肝细胞生长素溶液按国家药品标准促肝细胞生长素溶液进行检测。[2]
4.1 鉴别
参照国家药品标准注射用促肝细胞生长素项下规定的方法进行鉴别。
4.1.1 阳性对照溶液的制备
取注射用促肝细胞生长素 (规格20 mg) , 加水溶解, 制成每1 ml中含多肽 10 mg的溶液。
4.1.2 供试品溶液的制备
取供试品加水溶解, 制成每1 ml中含多肽10 mg的溶液。
4.1.3 阴性对照溶液的制备
取甘露醇适量, 加水制成3%溶液。
4.1.4 双缩脲显色反应
结果表明:注射用促肝细胞生长素含有多肽成份。阳性对照和供试品对双缩脲反应均为显蓝紫色, 符合国家药品标准促肝细胞生长素溶液鉴别项下的规定, 阴性对照无颜色变化, 赋形剂对此鉴别检验无干扰。该显色反应可用于注射用促肝细胞生长素多肽的鉴别。
4.2 含量测定
4.2.1 福林酚测定法
按国家药品标准“注射用促肝细胞生长素”多肽含量测定方法进行。
4.2.2 供试品的测定结果
取三批供试品, 按含量测定项下方法进行测定。
结果表明:三批供试品多肽含量均符合含量限度的规定。
以上测定方法表明, 用国家药品标准注射用促肝细胞生长素规定的含量测定方法--福林酚法测定多肽含量, 可用于本品质量标准的控制[1]。
5质量研究
注射用促肝细胞生长素为促肝细胞生长素溶液加适量赋形剂制成的无菌冻干品, 根据国家药品标准注射用促肝细胞生长素, 对本品进行质量研究, 介绍如下。
5.1 样品与对照品
供试品品名:注射用促肝细胞生长素阳性对照 品名:注射用促肝细胞生长素规格:20 mg, 规格:80 mg, 阴性对照 品名:甘露醇。
5.2 含量限度
国家药品标准“注射用促肝细胞生长素” (规格20 mg) 规定, 多肽应为标示量的90.0%～115.0%。经检验符合国家药品标准“注射用促肝细胞生长素”的规定。
5.2.1 性状
为冻干后的自然性状, 观察供试三批样品, 均为乳白色疏松固体。
5.2.2 鉴别
参照国家药品标准“注射用促肝细胞生长素”项下规定的方法进行鉴别。
5.2.3 阳性对照溶液制备
取注射用促肝细胞生长素 (规格20 mg) , 加水溶解, 制成每1 ml中含多肽10 mg的溶液。
5.2.4 阴性对照溶液制备:
取甘露醇适量, 加水制成3%溶液。
5.3 双缩脲显色反应
取上述溶液各1 ml, 加双缩脲试液 (取硫酸铜1.50 g和酒石酸钾钠6.0 g, 加水500 ml使溶解, 边搅拌边加入10%氢氧化钠溶液300 ml, 用水稀释至1000 ml, 混匀) 4 ml, 混匀, 室温放置15 min。
结果表明:注射用促肝细胞生长素含有多肽成份。阳性对照和供试品对双缩脲反应均显蓝紫色, 符合国家药品标准注射用促肝细胞生长素的规定, 阴性对照无颜色变化。该显色反应可用于注射用促肝细胞生长素多肽的鉴别。[3]
参考文献
[1]李良铸, 李明晔.最新生化药物制备技术.北京:中国医药科技出版社, 2001, 3 (1) :9-12.
[2]WS-10001- (HD-0806) -2002, 国家药品监督管理局.促肝细胞生长素溶液质量标准.
[3]隋丽娅, 黄萍, 杨思泉.促肝细胞生长素注射液细菌内毒素检查法.医药导报, 2004, 23 (5) :328-330.
[4]高英, 俞玉忠.福林酚法测定脑蛋白水解物溶液中的多肽含量.海峡药学, 2004, 16 (6) :57-58.
丝裂霉素对喉癌细胞生长的影响 篇10
1资料与方法
1.1 实验对象
人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株由山东医学科学院微生物室赠。
1.2 实验主要试剂及配制[2]
丝裂霉素为浙江海天药业有限公司生产, 青霉素为山东鲁抗药业公司生产,链霉素为瑞阳药业有限公司生产。1640培养液(含10%小牛血清) 美国sigma公司 ,RPMI-1640粉 10.39g。
1.3 实验主要仪器
日本产DEV5酶联免疫检测仪;SW-CJ-IF医用净化工作台为苏州净化设备厂产品;HERAcellRCO2培养箱为德国Heraeus公司产品;普通光学显微镜、倒置显微镜PM-10AD及相机IMT-2均为日本Olympus公司产品;医用低温冰箱(SANYO);YXQG02型电热式蒸汽消毒器为山东新华医疗器械厂产品。
1.4 细胞培养[3]
1.4.1 取材:
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中。
1.4.2 人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞正常培养:
培养于含10%胎牛血清,100μ/ml青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液中,全部实验均选用指数生长期细胞,接种于相适应的培养板中。
1.4.3 MTT法测定MMC对Hep-2细胞存活率的影响:
MTT法的作用原理:细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的四甲基偶氮唑兰(MTT)还原为紫色的结晶物(Formazaman)并沉积于细胞内或细胞周围,通过比色测定结晶量记录结果,并按公式计算细胞存活率。细胞存活率=实验组光吸收值 /对照组光吸收值×100%。结晶量的多少可以反映出活细胞数量、细胞活力及细胞的氧化还原状态等多种指标。
1.4.4 nm23免疫组化染色:
采用nm23免疫组化染色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)对Hep-2细胞中的nm23抗转移基因进行检测。
1.5 统计学分析
对实验数据进行统计,并进行χ2检验。
2结果
2.1 Hep-2细胞MMC作用后活细胞计数
Hep-2细胞MMC处理后,结果表明,正常培养的细胞极少出现台盼蓝阳性染色的细胞。处理3h、6h,台盼蓝阳性染色细胞未见明显增加;12h后染色的比率达到(19±4.2)%,24h后,阳性细胞为(69±3.1)%,表明12h后有细胞死亡,24h后大部分死亡,48h后基本死亡。
2.2 MTT对细胞存活率的检测
四唑盐(MTT)比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。外源性的MTT能将活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能,这种还原能反映出线粒体良好的功能,细胞数量越多,表现出总的还原能力越强。MTT指标还反映细胞内的氧化还原状态处于氧化压力条件下,导致对MTT还原能力的减弱。Hep-2细胞在MMC处理3h后,MTT的值约为对照组的一半,然后MTT值呈渐进性下降(Fig.1.5),结合形态学及台盼蓝拒染分析(Fig.1.6),MMC刺激的开始几小时内,MTT值的下降是细胞内氧化压力上升的一种体现,长时间MMC药物处理培养后出现的MTT值渐进性的下降则与此时出现的细胞死亡相关。
2.3 Hep-2细胞中nm23的表达
喉癌细胞中nm23蛋白的表达情况:统计学分析 P<0.01。nm23蛋白阳性表达见于细胞浆或细胞浆及细胞核,呈清晰棕黄色且明显深于背景着色;nm23蛋白阴性表达见于细胞浆或细胞浆及核,呈清晰深蓝色。
3讨论
MTT法是检测药物对肿瘤细胞增殖影响的常用指标。本实验的研究结果表明,在一定范围内细胞数与OD值呈线性关系,MMC抑制Hep-2细胞的生长。分析时效关系时可见,随MMC作用时间延长,IR增大,引起细胞生长速率减慢。因此,临床上若小剂量、短期连续使用MMC可能抗癌效果更佳。这可能是nm23过表达导致喉癌细胞对MMC抗药的主要原因之一。这一结论为临床喉癌化疗方案的选择提供了理论依据。
二磷酸核苷激酶(NDPK)催化二磷酸腺苷以外的二磷酸核苷转变成相应的三磷酸核苷,调节细胞中三磷酸核苷的含量,也调节有丝分裂纺锤体及细胞骨骼中微管的聚合而影响细胞分裂。当NDPK发生改变时,由微管聚合而成的纺锤体异常,促进正常细胞向肿瘤细胞转移。
nm23蛋白有与二磷酸核苷激酶(NDPK)相同的氨基酸序列和NDPK活性,因此认为nm23抑制转移能力可能与发挥NDPK样功能有关。它能使GDP还原为GTP,而GTP有调节细胞膜蛋白的功能,参与跨膜信息的传递。另外,nm23还参与微管的聚合和分解,影响细胞骨架状态,通过调节细胞内微管系统的状态和阻断肿瘤信息的传递而抑制肿瘤的转移。
综上可以认为由于肿瘤的转移包括多种特异性基因的激活及(或)失活,其转移的每个步骤都可能被多个不同基因的DNA或RNA水平的变化所调节。因此,并非某个基因在任何肿瘤中都有抑制肿瘤转移的作用。显然nm23基因是作为癌基因还是抑癌基因取决于它是否正常以及哪个信号途径受损。如果nm23基因表达引起生长抑制途径上的G蛋白激活,它就有抑癌作用,反之则促进肿瘤生长及转移。
本文结果可见,丝裂霉素对人喉癌细胞(Hep-2 cell)有抑制作用,能够影响到喉癌的生长。
摘要：目的:探讨丝裂霉素(MMC)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞活性的影响。方法:采用体外细胞培养实验方法,应用MTT、台盼蓝拒染等技术检测MMC对Hep-2细胞活力的影响,同时应用nm23免疫组化染色检测nm23蛋白的表达水平。结果:Hep-2细胞在MMC作用下,48h后细胞死亡率达90%,nm23蛋白在喉癌细胞中随MMC作用时间的延续表达量增多。结论:丝裂霉素影响人喉癌细胞(Hep-2)的生长,降低Hep-2细胞的活性而达到治疗作用。
关键词：Hep-2,nm23,丝裂霉素,MTT
参考文献
[1]邹淑娟,梁恩虎,李思忠,等.47例喉癌综合治理结果分析〔J〕.齐鲁肿瘤杂志,1994,2:128.
[2]鄂征.组织培养技术及其在医学研究中的应用〔M〕.北京:中国协和医科大学出版社,2004:321-479.
