细胞外信号调节激酶（精选四篇）
细胞外信号调节激酶 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试药与试剂
吴茱萸碱 (evodiamine, Evo) , 由中国药品生物制品检定所提供, 淡黄色粉末, 纯度>98%, 批号:110802-200606。AngⅡ (Sigma公司) , 胎牛血清 (华美生物工程公司) , DMEM培养基 (Gibco公司) , β-actin、PCNA、c-myc和ERK-1引物 (大连宝生物公司) , 引物序列见表1。Trizol (美国Invitrogen公司) , DEPC (美国Sigma公司) , 逆转录反应体系试剂盒 (美国ABI公司) , SYBRR GREEN PCR Master Mix (英国ABI公司) , MKP-1兔抗大鼠多克隆抗体, Actin兔抗大鼠多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司) 。
1.1.2 动物
SD雄性大鼠SPF级, 雌雄各半, 体重180~200 g, 第三军医大学大坪医院实验动物中心提供, 许可证号:SCXK (渝) 2007-2005。
1.1.3 主要仪器
二氧化碳CO2孵箱 (美国SHELL公司) , Icycler荧光定量PCR仪, 酶标仪 (美国BIO-RAD公司) , 逆转录仪 (德国Eppendof公司) , TE2000-S倒置生物显微镜 (重庆光学仪器公司) , TU1810紫外可见分光光度计 (北京普析仪器有限责任公司) 。
1.2 方法
1.2.1 VSMC制备与分组
大鼠断头处死, 无菌操作取大鼠胸主动脉中膜, 组织块贴壁法培养VSMC并传代。实验用3~7代VSMC, 分为正常对照组 (不含药物的DMEM培养基) , 模型组 (AngⅡ1.0μmol/L) , 吴茱萸碱低 (0.01μmol/L) 、中 (0.10μmol/L) 和高浓度 (1.0μmol/L) 组, 吴茱萸碱各试药组分别合用AngⅡ。
1.2.2 VSMC形态学观察与鉴定
倒置显微镜下观察传代细胞生长状况及形态, 采用特异性平滑肌α-肌动蛋白 (SMα-actin) 抗体进行免疫细胞化学染色鉴定。
1.2.3 MTT法测定VSMC增殖
按参考文献[7]方法, 细胞接种于无菌96孔板中, 同步化后加入各试药作用30 min, 再加入AngⅡ使其终浓度为1.0μmol/L, 培养24 h后加入MTT溶液20μL (5 g/L) , 孵育4 h, 磷酸缓冲盐溶液清洗3次, 每孔加入DMSO 150μL溶解甲臢, 振荡混匀10 min, 酶标仪450 nm波长检测其光密度 (optical density, OD) 值。
1.2.4 Real-time PCR检测VSMC中PCNA、c-myc、ERK-1 m RNA的表达
按参照文献[8]方法, VSMC1×106接种于无菌培养瓶中, 经药物作用24 h后, 采用Trizol法提取总RNA。取10μL RNA样品和490μL DEPC水于比色皿中并充分混匀, DEPC水调零, 紫外分光光度计分别检测其260 nm和280nm处的吸光度值, A260/A280比值>1.8, 纯度良好。根据A260值, 计算RNA浓度=A260×40μg/m L×稀释倍数。两步法逆转录c DNA:反应条件为37℃15 min, 85℃5 s, 反应终止。Real-time PCR扩增:反应条件95℃10 min预变性, 95℃15 s变性, 60℃1 min退火, 循环40次。采用相对定量法分析PCR结果, 以β-actin基因为内参照, 使用2-ΔΔCt法计算PCNA、c-myc和ERK-1基因的相对表达水平。
1.2.5 Western blot检测VSMC中MKP-1蛋白的表达
采用BCA法测定样品蛋白浓度, 取VSMC蛋白50μg上样, 经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜上, 然后与相应的一抗和二抗反应, 室温下孵育1.5 h, 放入BIO-RAD凝胶成像仪中, 选择化学发光, 扫描免疫印迹, Quantity One定量分析系统对图像进行灰度值测定, 以内参β-actin为对照, 获得各组蛋白条带相对值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行数据处理, 实验所有数据以均数±标准差 (±s) 表示, One-way ANOVA处理, 组间比较用方差分析, 方差齐用LSD法, 方差不齐用Tamhane’s-T2法, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VSMC鉴定及吴茱萸碱对其生长的影响
倒置显微镜下观察, 传代培养的细胞10 d左右平行排列呈典型的峰谷样形态。传代细胞通过SMα-actin抗体免疫细胞化学染色, 可见细胞浆被染成棕黄色, 胞核染成蓝色, 所有细胞染色均为阳性。实验所用高浓度吴茱萸碱与正常对照组VSMC比较, 形态学差异无统计学意义, 细胞存活率>95%, 表明吴茱萸碱对VSMC基本无毒性。
2.2 吴茱萸碱对AngⅡ诱导VSMC增殖的影响
模型组与正常对照组比较, 光密度值明显升高 (P<0.05) 。与模型组比较, 中浓度吴茱萸碱 (P<0.05) 和高浓度吴茱萸碱 (P<0.01) 能明显抑制AngⅡ诱导VSMC光密度值的升高, 吴茱萸碱对AngⅡ诱导VSMC增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性, 见表2。
2.3 吴茱萸碱对VSMC中c-myc、PCNA和ERK-1 m RNA表达的影响
模型组与正常对照组相比, PCNA、c-myc和ERK-1 m RNA的表达显著增多 (P<0.01) , 分别增加约1.6倍、2.6倍和9.5倍 (见表3) 。与模型组比较, 吴茱萸碱中、高浓度组明显下调PCNA、c-myc和ERK-1 m RNA的表达。
2.4 吴茱萸碱对VSMC中MKP-1蛋白表达的影响
与正常对照组比较, 模型组明显降低MKP-1蛋白的表达 (P<0.05) , 表达量仅为正常对照组的25%。吴茱萸碱中、高浓度组明显上调MKP-1蛋白的表达, 见表4及附图。
注:1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型组比较, P<0.05;3) 与模型组比较, P<0.01
注:1) 与正常对照组比较, P<0.01;2) 与模型组比较, P<0.05;3) 与模型组比较, P<0.01
注:1) 与正常组比较, P<0.05;2) 与模型组比较, P<0.05, 3) 模型组比较, P<0.01
1:正常对照组;2:模型组;3:吴茱萸碱低浓度组;4:吴茱萸碱中浓度组;5:吴茱萸碱高浓度组
3 讨论
VSMC可分为收缩和合成2种表型, 收缩型VSMC呈分化状态, 基本没有增殖能力;合成型VSMC为去分化状态而具有增殖能力[9]。当血管内皮细胞受损时血液中的各种细胞分裂因子, 如AngⅡ等可通过VSMC表面相应受体激活细胞增殖过程, 使收缩表型转变为合成表型, VSMC重新获得增殖能力, 并迁移至内膜, 同时分泌大量的细胞外基质, 从而发生一系列的血管增殖性疾病[10]。
细胞外信号调节激酶 篇2
关键词：异氟烷,神经元,细胞外信号调节激酶,cAMP反应元件结合蛋白
全麻药异氟烷因其价格便宜、毒副作用小、诱导快,是临床中应用广泛的吸入麻醉药之一。近年来研究表明,异氟烷急性暴露可诱发神经细胞凋亡,引起新生大鼠长期学习记忆能力下降[1,2];异氟烷还可以引发围术期成年患者术后认知功能障碍(Post-operativ cognitive dysfunction,POCD)并对神经系统发育、学习及记忆产生影响[3]。细胞外信号调节激酶(Extracellu lar signal regulated kinases,ERKs)是丝裂原活化蛋白激酶家族成员之一,介导细胞增殖、分化及存活。在中枢神经系统中,ERK可影响神经细胞增殖分化、突触可塑性、轴突生长等,与脑内长时程增强(Long-term potentiation,LTP)的形成以及学习记忆功能密切相关[4,5]。研究证明,许多形式的突触可塑性都需要ERK参与,同时动物实验证明,抑制神经细胞中ERK活性可导致动物学习功能的降低[6]。
环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)在突触可塑性中具有重要的作用,激活CREB可促进多种与突触可塑性相关的转录因子的转录[7],从而诱导产生一些与学习记忆十分相关的蛋白分子。
本实验采用神经细胞原代培养的方法,从细胞水平观察异氟烷对神经元ERK和CREB的影响,探讨异氟烷的神经毒性以及影响学习记忆能力的潜在机制。
1 对象与方法
1.1 主要材料
取24 h内新生的SPF级小鼠30只,雌雄不限,由辽宁医学院实验动物中心提供[动物许可证号:SYXK(辽)2009-0004]。DMEM培养基(美国Hyclone)、胎牛血清(FBS,浙江天杭生物科技有限公司)、神经元基本培养基(美国Introvigen)、p-CREB抗体(Cell Signal公司)、p-ERK1/2抗体(美国SANTA Cruz公司)、β肌动蛋白抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)、ECL发光试剂(美国Sigma公司)、Cell Titer-Blue TM Cell Viabiliy Assay试剂盒(美国Promega公司)。
1.2 小鼠大脑皮层神经元分离、培养及细胞分组
根据文献报道[8],选用出生24 h内的昆明小鼠,无菌条件下,断头处死小鼠取脑,于预冷的D-Hanks液中,分离大脑皮层后,显微镜下去除脑膜和血管;D-Hanks液洗2~3次,剪成小块。37℃下0.25%胰蛋白酶消化20 min后取出吹打,用含10%胎牛血清的DMEM终止反应。4℃下1000 r/min离心5 min,2次,弃上清液。DMEM调节细胞悬液浓度为5×105/m L,接种于培养瓶中,37℃恒温的CO2培养箱内培养。半量换液,1次/2~3 d。细胞培养7 d,经神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)免疫细胞化学法鉴定,神经细胞占全部细胞数的90%以上,取培养7 d的神经细胞进行试验。
培养细胞分为,对照组:常规培养;异氟烷暴露组:采用终浓度为0.96 mmol/L异氟烷的培养基培养细胞,分别培养12 h及24 h,共三组。每组分别取10只动物,细胞培养每组设10个复孔。
1.3 异氟烷溶液的配制
根据文献[8]的方法,将130μL液体异氟烷加入103 m L平衡盐溶液(Balanced salt solution,BSS)中,密封后摇床上摇匀24 h,充分溶解异氟烷,配制10 mmol/L储备液。使用前迅速将30 m L溶液倒入50 m L聚丙烯离心管中,震荡5~10 s,加入培养基(终浓度为0.96 mmol/L)后用于细胞处理。
1.4 MTS方法测定细胞活力
将细胞悬液稀释至1×105/m L,以每孔1×104个细胞接种于96孔板,每孔100μL。将培养板放入CO2培养箱内37℃培养过夜后,更换含有异氟烷的培养液继续培养24 h。根据说明书,每孔加入20μL MTS试剂,37℃下孵育4 h,592 nm处测定各组细胞吸光度值A。根据公式计算生存率,细胞生存率=(A各组-A空白孔)/(A对照组-A空白孔)×100%。
1.5 免疫印迹检测神经元ERK和CREB蛋白表达
收集各组细胞于1.5 m L EP管中,每管约1×106个细胞。加入裂解液300μL,吹打均匀后于冰上裂解30 min。12 000 g离心20 min,收集上清。BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白50μg上样至10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(120 V,1.5 h)、转印至硝酸纤维素膜、一抗孵育室温下2 h、HRP标记二抗孵育,最后ECL发光并成像进行灰度分析。以β-actin为内对照,目的蛋白的表达值以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。
1.6 RT-q PCR检测神经元ERK和CREB m RNA表达
Trizol法提取总RNA。SYBR GreenⅡ进行检测,热循环条件:95℃3 min,94℃15 s,60℃60 s,40循环。PCR扩增反应体积10μL:RNase Free d H2O23μL,SYBRRPrime ScriptTM(2×)5μL,ERK、CREB、18SrRNA上下游引物(10μmol/L)1μL,DNA模板1μL,每个样品3个复孔。采用比较Ct值(2-ΔΔCt法)相对定量法,改变的倍数(fold change)=2-ΔΔCt;ΔCt=Ct靶基因-Ct内参,ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt未处理组。以18Sr RNA为内对照。以2-ΔΔCt表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。PCR引物序列见表1。
1.7 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,组间计量资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验,组间两两比较采用LSD-t检验,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异氟烷对小鼠神经元生存率的影响
与对照组比较,12 h和24 h异氟烷处理组的生存率降低,生存率从对照组的100%分别降至(86.58±8.96)%和(78.63±8.23)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。
与对照组比较,*P<0.05
2.2 异氟烷对小鼠神经元ERK1/2和CREB活性的影响
Western blot方法检测小鼠神经元ERK1/2和CREB活性,结果显示,与对照组比较,异氟烷处理组小鼠神经元中p-ERK1/2和p-CREB表达水平均明显降低(P<0.05);随着异氟烷处理时间的增加,pERK1/2和p-CREB表达逐渐降低,处理12 h与24 h比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
与对照组比较,*P<0.05;与处理12 h比较,#P<0.05
2.3 异氟烷对小鼠神经元ERK1/2和CREB m RNA表达的影响
RT-q PCR方法检测了小鼠神经元ERK和CREB的m RNA表达。与对照组比较,异氟烷处理组小鼠神经元中ERK和CREB表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。
3 讨论
全身麻醉药目前已广泛应用于临床麻醉中,而其对学习记忆功能的影响也受到重视,有研究证实,吸入性麻醉药异氟烷可以诱导产生细胞毒性,造成大鼠中枢神经系统神经元凋亡[9,10],引起未成年小鼠大量脑神经细胞凋亡,产生术后认知功能或持续性学习功能障碍[11]。本实验从细胞水平探讨了异氟烷的神经毒性以及影响学习记忆能力的潜在机制。
本研究结果显示:与对照组比较,0.96 mmol/L异氟烷处理后小鼠神经元活力明显下降(P<0.05);磷酸化ERK1/2和CREB显著降低(P<0.05)。结果提示,一定浓度的异氟烷可以降低原代培养的小鼠神经元活力和ERK1/2、CREB的磷酸化水平,可能与异氟烷诱导学习记忆损伤及术后POCD相关。
ERK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,在神经系统中,ERK分布广泛,参与突触可塑性长时程增强电位诱导过程[12],也参与神经元的凋亡,在记忆过程中发挥重要作用。研究证明,将ERK通路阻断后,可抑制LTP的形成[13],而影响学习记忆功能。Mawhinney等[[14]发现,异氟烷可降低海马和皮质的磷酸化ERK1/2,导致空间认知功能障碍。Liu等[15]发现,低浓度及短时间应用异氟烷可以提高p ERK1/2水平,可能改善认知功能,而高浓度应用异氟烷超过4 h则会降低p ERK1/2水平,而损害认知功能。本研究也发现,0.96mmol/L的异氟烷溶液作用能对小鼠神经元产生明显的毒性作用,且随处理时间延长,p-ERK1/2的表达逐渐降低(P<0.05)。
CREB是一种分子量为43 k D的核转录因子蛋白,参与了神经干细胞增殖、细胞周期调控、学习记忆等正常生理活动[16]。CREB上Ser-133的磷酸化位点是许多蛋白激酶的作用靶点,一旦被磷酸化,CREB介导的转录启动并激发长时程增强电位相关蛋白的合成,对于神经突触可塑性长时间改变有重要作用[17]。有结果表明在脊椎动物CREB基因被破坏后,其长时记忆形成受到影响。施小娇等[18]发现:高浓度七氟烷可以引起大鼠麻醉后早期认知功能障碍,并呈剂量依赖性,CREB蛋白磷酸化的抑制以及记忆相关蛋白合成的减少可能是机制之一。本研究中异氟烷处理组小鼠神经元中p-CREB表达水平均明显降低(P<0.05);并随处理时间延长而逐渐降低(P<0.05)。
依文献报道[19],0.28 mmol/L异氟烷相当于临床上1个最小肺泡浓度(Minimal alveolar concentration,MAC)的血药浓度,一般临床常用1.3 MAC。本研究将神经元暴露于0.96 mmol/L的异氟烷浓度中,明显高于临床常用量,随着处理时间的延长,神经元活力逐渐下降,与学习与记忆有关的蛋白表达受到抑制。结果提示临床中降低用药浓度,减少使用时间将有助于减少认知障碍及学习记忆能力下降的发生。
细胞外信号调节激酶 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
清洁健康SD大鼠45只, 2～3月龄, 雄性, 体重 (250±30) g, 购于大连医科大学动物实验中心, 许可证号:SXXK (ID 2008-0002) 。随机分为假手术对照组、CHF模型组 (CHF+生理盐水组) 、CHF模型治疗组 (CHF+Ghrelin) 各15只。
1.2 实验试剂及所需药品
ASK1免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司, Ghrelin购于吉尔生化 (上海) 有限公司。
1.3 心衰模型及给药方法
采用结扎大鼠冠状动脉前降支[6], 造成急性心肌梗死后形成心力衰竭动物模型。术前12h禁食、禁水, 按3.0mL/kg10%水合氯醛腹腔注射, 麻醉后, 将大鼠置于手术台, 进行心电检测, 剃去左胸前区毛发, 消毒, 于胸骨中线左缘约0.5cm, 经第二乳头至左腋顶、腋前线作一弧形切口, 依次切开皮肤、钝性分离胸大肌, 心跳最明显处 (3、4肋间隙) 分离肋间内外肌, 轻扩肋间隙, 轻挤出心脏, 在肺动脉圆锥与左心耳之间, 以心大静脉为标志取其上1/3为结扎点, 用0号无损伤线结扎冠状动脉左前降支, 假手术组挤出心脏穿线不结扎前降支, 轻轻挤压胸壁, 排出胸腔内气体, 缝合皮肤。术后可见特征性的ST段改变, 观测所属区域心肌颜色变白, 搏动减弱, 为造模型成功标志, 变剔除模型不合格大鼠。各组术后连用3d青霉素20万单位肌注/天·只。术后12h分别给:CHF模型组和假手术对照组尾静脉注射25μg/kg·d生理盐水, CHF模型治疗组尾静脉注射Ghrelin 25μg/kg·d, 每天早8～10时给药, 连用14d。
1.4 取材及指标观察
8周时对各组大鼠进行取材, 麻醉后开胸, 自左心房直接注射100k氯化钾5mL, 使心脏停搏于舒张期进胸, 用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液 (pH7.2～7.4) 冲洗, 迅速取出心脏, 清理周围组织并置10%甲醛中固定24～48h, 而后从心尖至心底横切成2～3 mm厚的3段心室组织切片, 待制作石蜡切片, 以备进行HE 染色观察心肌组织形态及免疫组织化学观测ASK1在大鼠心肌组织中表达的变化时使用。
1.5 统计学分析
实验数据应用SPSS 11.5统计学软件进行处理, 数据均采用 (均undefined表示, 组间两两比较采用q检验, P<0.05统计学有意义。
2 结果
2.1 大鼠心肌组织HE 染色观察
假手术对照组大鼠均可见心肌结构清晰, 肌纤维排列整齐, 细胞核呈杆状, 大小、形态均匀一致, 心肌纤维横纹、纵纹明显, 可见闰盘, 无炎性细胞浸润, 未见心肌细胞断裂和溶解。CHF模型组心肌组织变薄, 几乎看不到正常的心肌细胞, 主要由被纤维结缔组织替代, 排列与心肌收缩方向一致, 新生毛细血管、炎性细胞偶见。CHF模型治疗组与CHF模型组相比心肌损害有所减轻, 心肌纤维化程度低, 可见残存心肌细胞。 (见图1) 。
2.2 免疫组织化学观测ASK1表达
光镜下观察假手术对照组ASK1仅在胞浆有少量的表达, 呈棕黄色颗粒;CHF模型组组ASK1在胞浆表达量明显增加, 呈条索状或大面积分布的棕黄色颗粒;CHF模型治疗组组较CHF模型组组表达量明显减少 (见图2) 。经图像分析采用指标为阳性区域面积与总面积之比, 每张切片采集8个视野取其均值, CHF模型治疗组ASK1阳性表达区面积与总面积之比低于CHF模型组 (P<0.05) , 高于假手术对照组 (P<0.01) (见表1) 。
注:*P<0.05, **P<0.01。
3 讨论
心肌细胞受到缺血缺氧、氧化应激、炎症因子、机械负荷、神经内分泌因子如Angll等多种因素刺激下诱导心肌细胞凋亡, 并且在缺血早期心肌细胞主要通过凋亡的方式丧失, 随着损伤加重和时间的延长, 缺血中心区域便出现坏死, 出现血流动力学障碍, 心肌的舒缩失调, 最终进展为慢性心力衰竭。在缺血缺氧、氧化应激等诱导下, ASK1参与凋亡信号传导, 导致心肌细胞的凋亡和心室的重构。近年来, Ghrelin强大的生物学功能被越来越多的学者所认知, 并应用到相应的领域, 其不仅能有效地促进生长激素分泌, 还能调节内分泌、促进摄食、增加体重、维持能量代谢正平衡、改善恶病质, 以及降低血管抵抗、改善血流动力学、抗细胞凋亡, 故Ghrelin可能从多层次多角度逆转CHF的病理生理过程[7,8]。
大鼠心肌组织HE 染色观察CHF模型治疗组与CHF模型组相比心肌损害有所减轻, 差于假手术对照组, 免疫组织化学观测ASK1发现CHF模型治疗组ASK1阳性表达区面积与总面积之比低于CHF模型组 (P<0.05) , 高于假手术对照组 (P<0.01) , 从而我们可以得出Ghrelin可抑制心肌组织中ASK1的表达, 从而改善心功能, 延缓CHF的进程。推测其原因可能为Ghrelin能够清除大鼠体内过多的氧自由基, 使ASK1的表达减少, 从而使血管内皮细胞及心肌损伤减少, 抑制心肌细胞凋亡, 提高心肌收缩力, 改善心功能, 从而改善心肌细胞的重塑。最近研究发现, JNK和p38MAPK在细胞的增殖、分化、基因表达、细胞凋亡及纤维反应过程发挥着关键的调控作用, 与心脏损伤关系密切, 曹济民[9]证明GHRP可下调p38的表达, 延缓CHF的进程;陈乃峰[10]也证明了GHRP可以对下调JNK的表达, 对心脏有保护作用, 而Luyendyk[11]发现ASK1是氧敏感性MAPKKK, 除了可激活MKK3/MKK6-p38外, 还能够激活SEK1-JNKK途径、诱导细胞凋亡, 结合本实验结果, Ghrelin治疗组ASK1表达减少, 其很可能是通过降低磷酸化p38及JNK的活性, p38及JNK活性下降又反馈性抑制ASK1的表达, 从而延缓CHF的进程。目前国内外Ghrelin对CHF大鼠心肌中ASK1表达的变化的研究甚少。通过本研究显示, Ghrelin能抑制心肌组织中ASK1的表达, 改善心功能, 延缓CHF的进程, 延缓心肌重塑, 但其具体机制仍需进一步的研究。
摘要：目的:探讨格瑞林对CHF大鼠心肌组织中ASK1表达的影响。方法:采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠CHF模型, 通过HE染色观察大鼠心肌细胞形态变化, 免疫组织化学观测ASK1在大鼠心肌组织中表达的变化。结果:CHF模型治疗组心肌损伤较CHF模型组明显减轻, 差于假手术对照组;CHF模型治疗组ASK1阳性表达区面积与总面积之比低于CHF模型组 (P<0.05) , 高于假手术对照组 (P<0.01) 。结论:格瑞林可抑制心肌组织中ASK1的表达, 改善心功能, 抑制心肌重塑, 延缓CHF的进程。
关键词：格瑞林,心力衰竭,凋亡信号调节激酶1
参考文献
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细胞外信号调节激酶 篇4
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
人支气管上皮细胞系(Human Bronchial Epithelial cells,16HBE)，购自上海麦莎生物材料公司(NO.367ZY00-A16);分析纯硫化镍(Ni S)购自天津科密欧公司产品;抗人ERK1单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司;恒温培养箱购自NUAIR公司;超净工作台购自上海智成净化设备公司;高压蒸汽消毒锅购自TOMY公司;相差倒置显微镜购自Nikon公司;凝胶电泳仪、全自动定量绘图酶标仪(550)购自Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 支气管上皮细胞的培养
将冻存的16HBE细胞株从液氮中取出后迅速将冻存管放入37℃水中快速摇动，使其尽快解冻。在生物安全柜中，用无菌吸管吸出细胞悬液，加入离心管中，补加一定量含10%小牛血清的MEM细胞培养液，1000r/min，离心5 min(离心半径=10 cm)，弃去上清液，使用10%小牛血清的MEM细胞培养液重悬细胞，接种于无菌培养皿中，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，二三天换1次培养液。倒置显微镜观察细胞形态，细胞生长至70%～80%融合状态时，用0.125%胰酶消化传代，三四天传代一次。
1.2.2 受试物的处理与配制
将16HBE细胞接种于25 ml培养瓶中，6×106个/孔，每孔设5个复孔，培养24 h后，Ni S染毒组以无血清MEM培养液溶解，终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0μmol/L，配制:Ni S粉末过筛后，将直径小于5μm的颗粒悬浮在p H 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后超声分散颗粒。高压消毒4℃保存。临用前再次超声悬液，对照组用无菌的MEM处理细胞24 h，无菌PBS洗涤细胞2次，胰酶消化后制成细胞悬液，以备下面实验使用。
1.2.3 实验分组
采用随机化的原则将细胞分为正常对照组、硫化镍染毒组(Ni S浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0μmol/L)
1.2.4 用Western blot法检测16HBE细胞中P-ERK1的表达
用蛋白提取试剂盒提取细胞的总蛋白，经加热变性处理后，先以每泳道20UL作SDS-PAGE凝胶电泳，再用BIO-RAD标准装置100 m A冰浴上转膜3 h，将蛋白转移至PVDF膜上，经室温封闭过夜之后分别加入P-ERK1一抗(工作浓度1∶2000，室温1.5 h)和酶标二抗(工作浓度为1∶1500,37℃温育0.5 h)，最后在暗室中进行发光、压片和洗片等处理，并以β-action作内参对各样本进行标准化定量，各组P-ERK1蛋白的表达水平以各样本与其内参灰度比值(相对灰度值)的平均数表示。
1.3 统计学处理
本次实验采用SPSS 13.0统计软件进行相关分析，多组间比较采用方差分析，两组之间的比较采用t检验，P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
Western blot检测结果见图1。实验发现，正常对照组P-ERK1有极微弱表达，硫化镍不能明显激活P-ERK1的表达(P>0.05)，Ni S(2μmol/L)+P-ERK1特殊抑制剂U0126(10μmol/L)刺激16HBE细胞24 h后P-ERK1的表达量较Ni S(2μmol/L)有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
注:硫化镍与正常对照组比较，均P>0.05。
3 讨论
镍是人类在工作和生活环境中广泛接触的一种金属。常见接触镍化物的职业包括:镍的冶炼、提纯行业、电镀行业、制造不锈钢和生产镍铬电池的行业等。有流行病学资料显示，职业与镍相关的人群，肺癌发病率较高，但其致癌机制目前尚不清楚。本文采用Western blot法检测支气管上皮细胞中P-ERK1的表达，探讨镍致癌的分子机制。
ERK亚族至少包括两个亚型:ERK1和ERK2。ERK为脯氨酸导向的丝氨酸、苏氨酸激酶，可磷酸化与脯氨酸相邻的丝氨酸、苏氨酸。在丝裂原刺激下，ERK接受上游的级联反应信号，可以进入细胞核。因此，ERK可以磷酸化胞浆蛋白，而且可以磷酸化一些核内的转录因子如C-myc、C-fos、C-Jun、Elk-1和ATF等，从而参与细胞增殖与分化的调控[4]，ERK通路还参与应激刺激、炎症介质等引起的细胞反应，表明ERK通路的激活与炎症反应也有密切相关[5]。
我们本次实验发现，硫化镍不能激活P-ERK1的表达，其机制尚不清楚，硫化镍有可能激活P38和JNK通路，从而直接或间接发挥致癌作用[5,6,7]，但我们有理由相信，在细胞内以MAP-KKK-MAPKK-MAPK为主干，再加上各种上游影响因子和下游作用底物，构成了一个功能多样、反应灵敏的信号转导网络。虽然对MAPK信号途径的研究历史还不长，许多细节还有待阐明，但由于该通路在细胞生命活动中所扮演的重要角色，研究它有助于镍致癌的分子机制探讨。
参考文献
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