细胞增殖与凋亡

关键词： 凋亡 肾癌 细胞

细胞增殖与凋亡（精选十篇）

细胞增殖与凋亡 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

标本均来自2006年1月～2008年1月石家庄市第二医院和解放军260医院泌尿外科,其中肾透明细胞癌30例、癌旁组织(距肿瘤组织边缘2.0cm以上[2])30例、意外伤亡正常肾组织10例。肾透明细胞癌及癌旁组织标本来源的病人年龄在52岁～78岁,男:女=2:1;正常肾组织标本来源的意外伤害者年龄在19岁～48岁,男:女=4:1。

1.2 方法

1.2.1

上述标本离体后分成三组,(1)肾癌组织组;(2)癌旁组织组;(3)正常肾组织组,均用10%的福尔马林固定48小时,石蜡包埋5μm切片,同时应用免疫组织化学(immunohistochemistry)方法观察细胞增殖标记物PCNA、细胞调亡(TUNEL法检测)、凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9的表达变化,以期通过对肾透明细胞癌组织细胞增殖与凋亡的研究,探讨这些因子的表达与肾癌的关系。

1.2.2 数据处理

所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数(400)下,每个组计数30个视野中的总细胞数和阳性细胞数,分别计算凋亡细胞与增殖细胞的百分比,作为凋亡指数(apoptotic index,AI)和增殖指数(proliferation index,PI)。Caspase-3、Caspase-9以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示抗原表达量。

2 结果

2.1 HE染色结果

正常肾组织镜下可见肾皮质迷路内有许多大小不等球形小体为肾小体,周围则为大量不同断面的(主要为横断面)肾小管,其中着色为深红色的为近曲小管曲部,而染色稍浅的则为远端小管曲部,细胞排列整齐,胞质染色深。肾透明细胞癌组织镜下可见肿瘤细胞体积较大,圆形或多边形,胞质染色浅,透明或颗粒状,核固缩,间质富有毛细血管和血窦。

2.2 PCNA免疫组化染色结果

正常肾组织内的细胞核有弱的阳性表达,癌旁阳性表达增加,高于正常肾组织;肾癌组织阳性表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,明显高于癌旁组织。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.3 TUNEL检测结果

在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,高于正常肾组织组,肾癌组织阳性表达最少。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.4 Caspase-3和Caspase-9免疫组化结果

Caspase-3和Caspase-9在正常肾组织中可见少量弱的阳性反应。癌旁组织阳性表达增加。棕黄色颗粒颜色较深,阳性染色见于细胞胞膜及胞浆;肾癌组织表达明显减少,在胞膜及胞浆表达,棕黄色颗粒颜色较浅。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.5 Caspase-3与Caspase-9的相关性分析

Caspase-3蛋白的表达与Caspase-9蛋白的表达之间成正相关(r=0.988,P<0.01)。

3 讨论

Caspase是含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶(cysteine-containing aspartate-specific protease),其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶,对底物门冬氨酸部位有特异水解作用。它在凋亡中所起的主要作用是:灭活细胞凋亡的抑制物;水解细胞的蛋白质结构,导致细胞解体,形成凋亡小体;在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白,从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件,它的激活与超常表达均引起细胞凋亡,因此又称死亡蛋白酶,通过与众多蛋白质因子的相互作用调控细胞凋亡[3]。

当线粒体跨膜电位在某种凋亡诱导因素作用下降低时,PTP开放,导致线粒体膜通透性增大,使细胞凋亡的启动因子如:细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡诱导因子(AIF)等从线粒体内释放出来,释放到胞浆中的细胞色素C结合凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1)和Caspase-9后,再激活Caspase-3,这是导致细胞凋亡产生的中心事件[4]。

我们分别以PCNA和TUNEL法标记了肾癌组织细胞的增殖和凋亡情况。细胞增殖与凋亡是组织正常生长,行使功能的两个基本要素。二者互相制约,处于动态平衡之中,组织细胞受损或增殖过度时,通过凋亡清除受损及异常过多的细胞,防止组织进一步损伤,而凋亡或其他原因丢失的死亡细胞则由增殖来补充,以保持正常的细胞数目及体积。这些精细的调节都是由一系列基因进行调控的,这一过程的失衡会导致疾病的发生。

肾癌细胞的生物学行为与癌细胞的增殖活性密切相关,PCNA是一种仅在增殖状态细胞内出现的非组蛋白型核蛋白。PCNA的表达越高说明DNA复制活跃程度增加,它是反映细胞增生的一项重要指标。[5,6,7]我们的实验显示:PCNA在正常肾组织、癌旁组织和肾癌组织中阳性表达不同,三组两两比较均有差异性,说明PCNA在肾透明细胞癌发生过程中起着重要作用,并且可以作为肾透明细胞癌诊断的一种参考指标。另外PCNA的活跃程度也反映了肾透明细胞癌的发生状态。

关于PCNA在肾透明细胞癌不同分期表达差异性的研究,目前还不完全一致,多数认为PCNA表达显著相关于高分期[8,9,10,11,12,13],但少数研究结果认为PCNA表达与分期无相关关系[14],我们的数据显示PCNA在正常肾组织、癌旁组织及肾癌组织之间有明显差异性,而在肾癌组织4个分期之间无显著性差异(P>0.05)。

我们的实验表明,肾癌组织PCNA表达增加,癌旁组织轻度增加,正常肾组织也有一定表达,但明显少于肾癌组织,表明增殖过度可能导致肾癌病变的发生。

在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。我们的实验TUNEL显示:凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,高于正常肾组织组,肾癌组织阳性表达最少,两两比较结果显示:正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4 个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。肾透明癌组织细胞存在增殖过度与凋亡减少,而且凋亡因子表达下调,说明细胞凋亡参与了肾透明癌组织病变的发生和发展,因此进一步揭示细胞凋亡在肾透明细胞癌发生中的机制。

Caspase-3、Caspase-9与肾癌:肾癌肿瘤细胞增殖与肿瘤凋亡减少有关,肿瘤细胞通过复杂的机制下调凋亡基因,从而使肾癌肿瘤细胞出现恶性增殖。Caspase家族是细胞凋亡下游关键酶,而且诱导细胞凋亡,实质上都是通过Caspase蛋白的次序激活来实现的。[15,16]Caspase-3是其家族中最重要的一员,是细胞凋亡效应分子,大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需通过Caspase-3介导信号传导途径导致细胞凋亡,[15,17]在我们的研究中,Caspase-3表达与细胞凋亡指数呈正相关,表明Caspase-3在肾癌中的低表达,致使细胞凋亡减少,致使细胞积累增多,导致细胞异常增生,使肾癌发生并发展,说明Caspase-3低表达是在肾癌中肿瘤形成的主要基础。

同时我们发现,肾癌Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下调,明显低于癌旁组织及正常肾组织组,更能表明肾癌组织存在细胞凋亡减少。Caspase家族广泛存在于机体细胞中,主要以酶原的形式存在。在凋亡信号的刺激下,Caspase酶原活化,Caspase-9位于Caspase级联反应的最上游,能在其他蛋白辅助因子的参与下发生自我活化并激活下游的Caspase-3,启动Caspase级联反应,诱导细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成员,大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需要通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡[18]。它作用于特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变,完成对底物的切割后可引起细胞凋亡。我们的研究中,Caspase-3蛋白表达与凋亡指数(AI)呈正相关,Caspase-3与Caspase-9蛋白表达亦正相关,更能说明,在肾癌组织中,存在细胞凋亡的过低表达。

综上所述,肾癌组织细胞存在增殖过度与凋亡减少,而且凋亡因子Caspase-3、Caspase-9表达下调,说明细胞凋亡参与了肾癌组织病变的发生和发展,因此进一步揭示细胞凋亡在肾癌发生中的机制,为肾癌发生和发展的研究提出新的思路,为探讨肾癌的治疗指出新方向,具有一定的临床意义。肾癌细胞的发生是多种基因相互作用的结果,各相关基因在肾细胞癌的发生发展过程中相互影响,共同促使了肿瘤的形成。

摘要：目的:本课题旨在通过检测人肾透明细胞癌组织中细胞增殖(PCNA)与凋亡(TUNEL法)及凋亡相关因子Caspase-3、 Caspgse-9表达的变化,研究这些因子的表达与肾癌的关系。方法:标本离体后分成三组,(1)肾透明细胞癌组;(2)癌旁组织组;(3)正常肾组织组,应用HE染色法、TUNEL法及免疫组织化学方法进行观察研究。结果:(1)HE染色结果:肾透明细胞癌组织镜下可见肿瘤细胞体积较大,圆形或多边形,胞质染色浅,透明或颗粒状,核固缩,间质富有毛细血管和血窦。(2) TUNEL检测结果:在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,肾癌组织阳性表达最少。(3) PCNA免疫组化染色结果:正常肾组织内的细胞核有弱的阳性表达,癌旁阳性表达增加,肾癌组织阳性表达明显增多。(4) Caspase-3、 Caspase-9免疫组化结果:Caspase-3 Caspase-9在正常肾组织中可见少量弱的阳性反应,癌旁组织阳性表达增加,肾癌组织表达明显减少。结论:癌旁细胞组织Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达明显高于正常肾组织及癌组织,癌组织表达最少;而PCNA则相反,癌组织高于癌旁组织和正常肾组织,正常肾组织表达最少。癌组织中Caspase-3和Caspase-9表达下降,PCNA表达升高说明细胞凋亡减少,癌组织细胞增殖旺盛,是肿瘤形成的重要机制。Caspase-3、 Caspase-9、 PCNA于肾透明细胞癌的表达在肿瘤分期间无明显差异性。

细胞增殖与凋亡 篇2

环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响

目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响.方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC-823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Shh、Gli-1 mRNA的表达情况.结果:环巴胺可明显抑制BGC-823细胞的`生长,呈时间剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;经32、64、96μmol ・L-1的环巴胺作用24h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、56.10%,明显高于空白对照组的2.10% (均P<0.01);Shh及Gli-1 mRNA均表达,环巴胺可下调Gli-1 mRNA表达,但对Shh mRNA表达无明显影响.结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Gli-1基因表达有关.

作 者：任雪萍 姜藻 刘飞 顾晓怡 高峰 REN Xue-ping JIANG Zao LIU Fei GU Xiao-yi GAO Feng  作者单位：东南大学附属中大医院,肿瘤中心,江苏,南京,210009 刊 名：东南大学学报（医学版）  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF SOUTHEAST UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2008 27(3) 分类号：Q253 Q255 Q786 R735.2 关键词：环巴胺   胃癌细胞   细胞凋亡   Shh   Gli-1   基因表达  

细胞增殖与凋亡 篇3

[关键词]　姜黄素；黑色素瘤；B16—F10细胞株；线粒体凋亡

黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，其特点是恶性程度高、进展快、死亡率高［3］。临床恶性黑色素瘤的治疗常采用手术结合联合化疗方案［4］。本研究以黑色素瘤细胞株B16—F10为实验材料，观察姜黄素体外抑瘤作用。同时，以活性氧激活线粒体凋亡途径为切入点，探讨姜黄素抗黑色素瘤的可能分子机制［5］，进而推断姜黄素的分子药理学作用。

1　材料与方法

材料：姜黄素（纯度≥98%）；RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等；MTT；DCFH—DA活性氧探针；线粒体提取试剂盒；Caspase—9（p—35，sc—8355）兔抗小鼠多克隆抗体；Caspase—4（ab—25898）兔抗小鼠多克隆抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；常规生化试剂；B16—F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞株。

方法：①细胞培养：B16—F10细胞常规培养，每3天传代一次，实验时取对数生长期细胞，用0.25%Trypsin—EDTA液消化后，用培养基制成细胞悬液。②细胞生长活力测定：细胞于96孔板培养24、36、72小时；向待检测的细胞培养板中加入MTT溶液（每孔20μl），于CO2培养箱中孵育4小时；吸出培养板中的液体，加入100μl DMSO溶液，置于振荡器混匀10分钟，酶标仪在450nm波长下测OD值；采集数据，依照下列公式计算细胞生长抑制率：（1—实验组OD值/对照组OD值）×100%。③DCFH—DA活性氧检测：实验方法依照试剂盒说明进行，采用激光共聚焦显微镜观察，530nm发射波长附近激发为绿色。④细胞涂片TUNEL染色、荧光显微镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定30分钟、风干；1% Triton X—100 PBS透膜；加入TdT酶、荧光标记液及TUNEL检测液、孵育60分钟；抗荧光淬灭液封片、荧光显微镜观察、摄片。⑤细胞涂片Caspase—4，9抗体免疫组织化学显色、光镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定、风干；1%Triton X—100 PBS透膜；正常动物血清封闭抗原；加一定稀释度的Caspase—4，9一抗（50μl/片），4℃湿盒孵育、过夜；加入通用型2抗PV—6001；AEC显色（红色）、光镜观察、摄片。

统计学处理：定量数据采用SPSS11.0软件包进行统计学分析，结果以X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

姜黄素对B16—F10细胞生长抑制率的影响：用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四个浓度姜黄素孵育B16—F10细胞24、48和72小时，倒置显微镜下可观察到随着药物作用时间的增加B16—F10细胞形态学的变化：细胞变圆、体积缩小、悬浮细胞（脱落）显著增多。MTT法检测，数据换算、统计分析结果表明姜黄素对B16—F10细胞的生长抑制存在时间和剂量的依赖性。

姜黄素对B16—F10细胞氧化损伤：依照前期实验的结果，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，采用DCFH—DA活性氧检测试剂盒，在激光共聚焦显微镜下观察姜黄素对B16—F10细胞活性氧水平的影响。结果表明姜黄素孵育48小时，能显著增高B16—F10细胞内活性氧水平，引起细胞形态改变。与对照组比较，姜黄素孵育48小时，B16—F10细胞内活性氧自由基水平显著增高（P＜0.01）。

姜黄素对B16—F10细胞凋亡的影响：一步法TUNEL染色，荧光显微镜观察，绿色荧光示凋亡细胞。实验结果表明姜黄素作用24小时可诱导少量B16—F10细胞凋亡，作用48小时可诱导大量B16—F10细胞凋亡，图像分析结果显示与空白对照组比较，姜黄素作用48小时B16—F10凋亡细胞显著增多（P＜0.01）。

姜黄素对B16—F10细胞线粒体凋亡相关蛋白Caspase—4，9的影响：已知Caspase—9是诱发线粒体凋亡过程的关键蛋白，位于细胞的胞浆内；而Caspase—4同样是诱发细胞凋亡的起始因子，位于内质网膜上，二者共同介导氧化应激作用诱导的线粒体凋亡过程。依照前期实验的数据，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，用离心法制备细胞涂片，行常规免疫组织化学染色，测定姜黄素对B16—F10细胞Caspase—4，9表达的影响，结果表明姜黄素干预B16—F10细胞，可显著上调细胞内Caspase—4，9水平。

3　讨论

姜黄素通过诱导细胞凋亡发挥体外抗肿瘤作用：本实验观察到，姜黄素能够显著抑制黑色素瘤B16—F10细胞生长，且呈剂量和时间依赖性。该结果与桂飞等［6］的研究结果一致。细胞凋亡实验结果表明，姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性，作用B16—F10细胞48小时可探测到大量的凋亡细胞；与线粒体凋亡相关因子caspase—4，9检测结果表明，姜黄素作用B16—F10细胞48小时能显著升高细胞内caspase—4，9的水平。该实验结果初步提示姜黄素不仅直接杀伤肿瘤细胞，而且能通过诱导细胞凋亡表现为显著的抑瘤活性。

早期胃癌细胞凋亡与增殖活性的研究 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

收集我院1999年1月～2009年12月间未经放化疗的早期胃癌患者手术切除标本60例,其中粘膜癌40例,粘膜下癌20例。

1.2 方法

1.2.1 电镜观察

取60例早期胃癌切除标本新鲜组织,行常规超薄切片,用日本TEM-1200型透射电镜观察。

1.2.2 免疫组化染色

所有标本除常规HE染色外,均同时采用Envosion法免疫组织化学染色标记PCNA、P53单克隆抗体(购于福州迈新公司)为一抗作染色标记。

1.2.3 DNA含量测定

采用北京空军总医院与北京航空航天大学联合研制的CMIS真彩色医学图像分析系统。标本制成4μm厚石蜡切片,用Feulgen染色后测量细胞核DNA平均积分光密度值作为二倍体(2C)的参考值,每例测定100个以上癌细胞,50个以上淋巴细胞,经测量后自动显示并打印出癌细胞群中不同的DNA倍体所占的百分比和直方图。

1.2.4 TUNEL染色

TUNEL细胞凋亡检测试剂合为德国宝灵曼公司产品,试验步骤按凋亡检测试剂合说明书操作。选择5例正常胃粘膜作阳性对照。

1.2.5 观察指标

光镜下观察PCNA免疫及TUNEL染色切片,在200倍视野下每例计量5～6个视野,计500个细胞的阳性细胞百分率分别作为PI及AI。

1.3 统计学方法

采用方差分析,T检验及相关分析。

2 结果

2.1 超微结构

在60例胃癌中,20例可见凋亡的癌细胞和凋亡小体,它们或分散于癌细胞间或被癌细胞“吞噬”,凋亡癌细胞以核的改变突出,可见核染色质聚集于核膜下,而核中央染色质减少并形成环状或染色质聚集于核中央,而形成圆或椭圆形致密染色质块,其周围染色质变淡。染色质块碎裂后可见半月形致密块聚于核膜下,进而裂解呈花瓣状染色质碎块。凋亡细胞膜和细胞器大致保持完好,但一些细胞质密度较高,细胞体积缩小、桥粒减少,与周围癌细胞连接较疏松;有些癌细胞体积增大,细胞器呈局灶性增多,线粒体呈明显的代偿性“反跳”现象可多达数十个,粗面内质网增殖,脱粒并包裹形成大小不等有膜包绕的自噬性凋亡小体,其中含有多少不一的胞质、细胞器及染色质碎块。

2.2 TUNEL染色观察

凋亡细胞分散于癌细胞间,游离于间质或腺腔内,调亡小体多被癌细胞吞噬,凋亡癌细胞胞体变小与周围癌细胞分离,细胞核或胞质同时呈粽褐色着染,染色质凝集于核膜下或固缩成团块,进而碎裂。

2.3 免疫表型

本组所有病例PCNA染色均为强阳性表达(图1),P53阳性(图2)56例。

2.4 DNA倍体分析

DNA倍体测量可见二倍体(2C)、三～四倍体(3C～4C)、五倍体(王倍华值)及>5倍体分布百分率。因高非二倍体肿瘤较低非二倍体肿瘤恶性度更高,本文以>王倍华值作为分析参数。

2.5 AI、PI、AI/PI、>王倍华值与临床病理因素的关系

高分化癌AI(2.71±0.12)、AI/PI(0.079±0.009)均高于低分化癌AI(0.37±0.17)、AI/PI(0.062±0.005)(P<0.05),而PI值、>王倍华值则相反,高分化癌PI(41.60±0.17)、>王倍华值(31.70±18.88)则低于低分化癌PI(58.10±0.13)、>王倍华值(43.23±27.29)(P<0.05)。癌累及粘膜层、粘膜下层AI、AI/PI值逐层递减,粘膜层AI(3.22±1.01)、AI/PI(0.11±0.06)显著高于浆膜层AI(2.50±0.69)、AI/PI(0.06±0.04)(P<0.05);而PI、>王倍华值相反呈逐层递增(P<0.05)。肿瘤最大径分别<5mm、5～10mm和>10mm三组中,AI、AI/PI随肿瘤增大而递减(P<0.01),而PI、>王倍华值则随肿瘤增大而递增(P<0.05)。淋巴结阳性组较阴性组PI值高(P<0.05),其他均无统计学意义。

2.6 前哨淋巴结转移

本组前哨淋巴结转移6例,占8.3%,且癌灶直径均>10mm的粘膜下癌。

3 讨论

早期胃癌占同期胃癌的比例各国报道有所不同,美国约为3%～6%,中国为7.5%,而日本报道高达30%～40%,主要是对高危人群大量内镜检查的结果[1,2]。近年研究表明,早期胃癌的病因病理学特点、诊断及治疗方面已取得了很大的进展。从正常胃腺上皮细胞到胃癌细胞的演变是多步骤、多基因突变、激活的结果。研究认为,胃肿瘤的发生还与细胞凋亡过程被抑制有关[3]。现已知肿瘤的发生是由于多种癌基因的激活与抑癌基因的失活而改变了正常细胞凋亡与增殖的动态平衡。这种动态平衡的变化可用AI/PI值表示出来[4]。不同的肿瘤或同一肺瘤的不同时相其AI/PI值在不断变化,因此,AI/PI值的变化亦是评价肿瘤生物学行为的可靠指标。许岸高等[4]研究胃癌发现,在胃癌演化过程中起初凋亡与增值同时上升,而在不典型增生开始PI继续上升而AI逐渐下降,其早期癌AI值高于晚期癌。Birchal等[5]研究咽和口腔上皮凋亡时亦发现相同的变化,原位癌AI高于正常,但发展为浸润性鳞癌后AI与AI/PI又下降且低于原位癌。本文结果显示,分化高、体积小的早期癌,其AI及AI/PI值高,当肿瘤发展为浸润、体积大及分化低时,其AI、AI/PI值则变低。提示此时肿瘤以增殖为主,而凋亡受抑。

细胞增殖是细胞动态平衡的一个重要方面,PCNA标志着增殖细胞比例,在早期胃癌中有关PCNA的报道较少,PCNA指数与肿瘤大小、浸润深度、分化程度和淋巴结转移密切相关。有报道,PCNA指数高者预后不良,并提出DNA倍体与PCNA指数呈线性密切相关,二者综合分析为判断胃癌预后的可靠指标[6]。本文结果DNA>王倍华值与PI值呈正相关(r=0.272,P=0.0183),>王倍华值与分化程度、浸润深度、肿瘤大小有密切关系(P<0.05),但与淋巴结转移无明显关系。PI除与分化程度、浸润深度及肿瘤大小有关外,与淋巴结转移亦有密切关系(P<0.05)。经相关分析,PI与AI呈负相关(r=0.2263,P<0.05)。说明凋亡减少,增殖增多是早期胃癌预后不良的标志。

野生型P53基因诱导细胞凋亡而抑制了肿瘤的生长,突变型P53基因不能诱导细胞凋亡,在早期胃癌形成和演化过程中是一个重要事件。P53蛋白阳性表达显示P53基因突变对判断肿瘤生物学行为有重要意义[7,8]。本研究发现,结直肠癌中P53蛋白阳性率较高(57%),P53阳性组AI值明显低于P53阴性组(P<0.05),表明P53突变可显著降低癌细胞的凋亡率。

据报道,淋巴结转移与肿瘤大小、肿瘤浸润深度密切相关。Kimya研究发现,单灶性早期胃癌中之粘膜内癌的淋巴结转移率为2.4%,淋巴管浸润约1.2%,未见静脉癌栓出现,但粘膜下癌则分别为13.0%、34%及15%。Soma报道,肿瘤病灶越大,淋巴结转移范围也随之扩大,当癌灶直径<30mm时,淋巴结转移率为8.8%,而病灶>30mm时,则增至19.2%[9]。Smca[9]研究显示,淋巴结转移阳性者,其肿瘤直径平均为44.8mm,明显大于淋巴结阴性的33.5mm(P<0.01)。本组淋巴结转移率为8.3%且均为粘膜下癌,癌灶直径均>10mm,与文献报道相符。总的来说,淋巴结转移阳性病例其共同特征为:(1)组织学上以低分化或未分化癌居多;(2)癌灶直径>10mm。为提高淋巴结转移阳性的发现率,应尽可能对切除标本中的淋巴结进行连续病理切片,即使5mm、1mm的淋巴结也不例外,否则可能有约14.9%及5%的淋巴结被漏检,从而造成分期下降,影响治疗方案及生存率[9]。

摘要：目的 探讨早期胃癌细胞凋亡与增殖活性的临床病理意义。方法 收集60例早期胃癌标本,采用切口末端标记法(IUNEL),电镜观察显示凋亡细胞,免疫组化En-Vosion法显示PCNA及P53蛋白表达,利用图像系统分析癌细胞DNA倍体。结果 高分化型癌凋亡指数(ApoptosisIndex,AI)、AI/PI(PCNA Index,PI)均高于低分化型癌(P<0.05),而PI值、DNA>王倍华值,则高分化型低于低分化型癌(P<0.05);癌限于粘膜层、粘膜下层时AI、AI/PI值逐层递减,而PI值、DNA>王倍华值则逐层递增(P<0.05),肿瘤直径<5mm、510mm、>10mm三组AI、AI/PI值随肿瘤增大而递减(P<0.01),其PI值、DNA>王倍华值随肿瘤增大而递增(P<0.05)、淋巴结阳性组PI值较阴性组高(P<0.05),P53阴性组较P53阳性组AI值高(P<0.05)。结论 高分化、体积小的早期胃癌AI值较低,PI值增高;AI与PI呈负相关;PI值与淋巴结转移有关。显示癌瘤进展以细胞增殖为主而凋亡受抑。P53基因突变可显著降低癌细胞凋亡。

关键词：早期胃癌,凋亡,增生,P53蛋白

参考文献

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细胞凋亡与肝脏疾病 篇5

[关键词] 细胞 肝脏疾病

健康网讯:

细胞增殖与凋亡 篇6

黄芩属唇形科黄芩属植物,为多年生草本植物,以干燥根入药,是常用的传统中药之一,具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[5,6,7]。黄芩素是黄芩根中的主要黄酮类化学成分。有研究表明,黄芩素能抑制胶质瘤和骨髓瘤细胞生长及诱导细胞凋亡[8,9]。目前,黄芩素对结直肠肿瘤细胞的影响及作用机制还不十分清楚。本实验以人结肠癌细胞系SW480 为研究对象,观察黄芩素对SW480 细胞的生长抑制和诱导细胞凋亡的作用,探讨黄芩素在结肠癌中的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芩素、3-(4,5- 二甲基噻唑-2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐(商品名:噻唑蓝)[3-(4,5-dimethylthi ahiazo-z-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]和Hoechst 33258 购自美国Sigma公司,Annexin V-FITC kit购自德国Calbiochem公司;无血清细胞冻存(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司,Caspase-3 检测试剂盒购自美国Bio Vision公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结肠癌细胞系SW480购于上海生物研究所,来源为人结肠低分化黏液腺癌。 SW480细胞常规培养于含10%小牛血清的DMEM培养基,放置在37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中。 经胰蛋白酶消化、传代,收集对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率

取收集对数生长期的SW480 细胞,常规消化制备单细胞悬液,调整细胞浓度为5×104个/ml,将细胞悬液以200μl/孔接种于96 孔板,5%CO2、37℃培养24 h。将实验分为4 组,前3 组分别加入相应的黄芩素溶液并使其最终浓度分别为25、50 和100μmol,第4 组为空白对照组,继续培养12、24、36、48 和72 h后每孔加入浓度为5 mg/ml MTT溶液10μl,孵育4 h后终止,振荡15 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度光密度(optical density,OD)值,并按照以下公式计算细胞生长抑制率(inhibition rate,IR):IR= (1- 空白组OD值/ 实验组OD值)×100%。根据抑制率曲线拟合48 h浓度与抑制率曲线,计算半数抑制浓度IC50。实验重复3 次。

1.2.3 Hoechst 33258染色观察细胞形态

将单细胞悬液接种于6 孔板,5%CO2、37℃培养24 h,加入黄芩素溶液并使其最终浓度为100μmol,设立空白对照组,继续培养48 h后,将细胞固定在4%多聚甲醛中10 min,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS) 清洗2 次, 加入0.5 ml浓度为10μg/ml Hoechst 33258 染色液,5 min后弃去染液并用PBS清洗2 次。染色后用荧光倒置显微镜进行观察。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡

调整SW480 细胞浓度为5×104个/ml,2 ml/ 孔接种于6 孔板中。待细胞贴壁后,分别加入相应的黄芩素溶液并使其最终浓度分别为25、50 和100μmol,设立空白对照组,继续培养48 h。胰酶消化后,4℃、300×g离心5 min,弃上清液,收集细胞。PBS清洗2 次后,加入100μl1×Binding Buffer重悬细胞,再加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI,混匀、避光,室温反应10 min。加入400μl 1×Binding Buffer,混匀。经流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Caspase-3活性检测

收集SW480 对数期细胞,调整细胞浓度接种于100 mm培养皿中,培养24 h后分别加入相应的黄芩素溶液并使其最终浓度分别为25、50 和100μmol,设立空白对照组,继续培养12、24、48 和72 h。收集细胞,100×g离心后弃上清液,加入细胞裂解液,充分混匀,冰上裂解20 min后离心,将上清液移入新的离心管并放置冰上,测定各样品的蛋白浓度。取等量的样品接种于96 孔板,每孔加入50μl 2×反应液及5μl浓度为4 mmol显色反应底物,混匀后37℃孵育1 h。在405 nm处测定其OD值。对照组计算值设定为100%,实验组值= 实验组OD值/ 对照组OD值×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用单因素方差分析来进行比较,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色法分析细胞生长的抑制作用

体外实验表明,黄芩素对SW480 细胞有直接抑制作用,并呈现剂量、时间依赖性(见图1)。作用48 h后,100μmol浓度的黄芩素对细胞的抑制作用最明显,达51.32%,与其他处理组比较,差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。72 h检测细胞抑制率低于48 h,但相同浓度下72 h与48 h抑制率比较,差异无统计学意义(P >0.05)。根据拟合曲线计算其半数抑制浓度IC50=93.51μmol。

(±s)

2.2 SW480 细胞的形态学变化

100μmol黄芩素作用SW480 细胞48 h,经10μg/ml Hoechst 33258 染色处理5 min后,与对照组细胞比较,荧光显微镜可观察到黄芩素处理组的细胞核中染色质凝集、固缩,形成明显的凋亡小体。见图2。

A:对照组;B:100μmol 黄芩素处理组

2.3 各组SW480 细胞的凋亡

不同浓度的黄芩素作用SW480 细胞48 h后,经流式细胞仪检测细胞凋亡率。对照组、25、50 和100μmol黄芩素处理组的凋亡率分别为(4.43±1.82)%、(5.57±2.19)%、(9.01±1.56)%和(14.89±2.04)%。与对照组比较,50μmol黄芩素处理组凋亡率升高,差异有统计学意义(P =0.029);100μmol黄芩素处理组凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P =0.003)。见图3。

A:对照组;B:25μmol 组;C:50μmol 组;D:100μmol 组;1)与对,P <0.05;2)与对照组比较,P <0.01

(±s)

注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与对照组比较,P <0.01

2.4 凋亡相关Caspase-3 活性

黄芩素作用SW480 细胞后,Caspase-3 活性随着时间延长呈上升趋势,24 h后下降,各组趋势一致。但与对照组比较,25μmol组Caspase-3 活性变化不明显;50 和100μmol组比较差异有统计学意义(P <0.05)。见表2。

3 讨论

细胞增殖和凋亡调控的紊乱与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。抑制肿瘤细胞的过度增殖,选择性诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的一个方向[10]。治疗上可以通过增加诱导凋亡基因的表达和抑制抗凋亡基因的表达来实现。本研究分析来自于黄芩的一种黄酮类化合物———黄芩素的抗肿瘤作用,将不同浓度的黄芩素作用于人结肠癌SW480 细胞并进行培养,通过MTT比色、形态学变化及流式细胞术检测细胞的增殖凋亡。

有研究表明,黄芩素能够通过不同途径抑制各种肿瘤细胞的生长并诱导其发生凋亡。黄芩素能够抑制肝癌细胞的增殖并诱导细胞的凋亡[11]。黄芩素通过抑制胃癌细胞血管内皮生长因子和肝细胞生长因子的表达来抑制胃癌细胞的增殖与凋亡[12]。黄芩素在20~120μmol浓度下能够显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 的生长[13]。黄芩素呈剂量、时间依赖性抑制人胰腺癌PANC-1 细胞增殖,影响肿瘤细胞伪足的形成,导致细胞的侵袭力下降[14]。黄芩素通过抑制人乳腺癌细胞富含AT序列的特异结合蛋白1 基因的表达,发挥其抑制乳腺癌细胞生长的作用[15];黄芩素经Caveolin-1/AKT/m TOR途径抑制人前列腺癌细胞的生长及侵袭[16]。

本研究表明,黄芩素能够明显抑制人结肠癌SW480 细胞的增殖,并呈剂量、时间依赖性,而实验中笔者观察到不同浓度黄芩素处理组72 h细胞抑制率相对48 h出现下降,但两者差异无统计学意义。根据对照组肿瘤细胞的生长曲线,发现72 h后细胞生长速度下降,分析出现该现象的原因可能与肿瘤细胞生长以及对药物敏感性下降有关,但具体机制需进一步研究证实。在显微镜下可以观察到黄芩素处理组肿瘤细胞发生细胞核中染色质凝集的形态学改变,提示在体外实验中黄芩素可能诱导结肠腺癌细胞发生凋亡。为进一步验证黄芩素促凋亡作用,本实验通过流式细胞术检测凋亡细胞所占的比例,100μmol浓度黄芩素处理组的细胞凋亡比例显著高于对照组(P <0.01),进一步提示黄芩素能够促进人结肠癌SW480 细胞的凋亡。

Caspase蛋白家族和Bcl-2 蛋白家族是参与凋亡进程的两个蛋白家族,前者负责凋亡的执行,后者调控线粒体的完整性[17]。目前已确定哺乳动物有14种Caspase酶类。其中Caspase-3 属于凋亡调控下游环节的剪切酶,可通过作用于多种底物,参与细胞凋亡的调控[16]。已有研究表明,Caspase-3 表达率降低与喉癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤的发生、发展有关[18]。

黄芩素可以促进SW480 细胞的Caspase-3 活性增加,提示黄芩素可能通过Caspase-3 依赖性信号通路来发挥促凋亡作用。

细胞增殖与凋亡 篇7

关键词：IGF-1,IL-1β,增殖,凋亡,p38 MAPK/NF-κB

颞下颌关节骨关节炎(temporomandibuar joint osteoarthrits,TMJOA)是骨关节炎(OA)的一种，主要特征是关节软骨的损伤，同时伴有滑膜及软骨下骨改变[1]。白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是一种炎性细胞因子，与TMJOA的发生有着密切的关系[2]。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是机体内软骨增生和改建的重要生长因子[3]。近年来，有研究证明IGF-1对软骨损伤具有修复作用，但其机制尚未明确，因此本实验以IL-1β诱导的软骨细胞凋亡模拟体内炎性环境下软骨细胞的变化，检测其细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、p38 MAPK NF-κB表达等情况，研究IGF-1对髁突软骨细胞凋亡及增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM培养基，双抗(含100 U/ml青霉素，100μg/ml双链素)(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Gemini公司);MTT，二甲基亚砜(DMSO),ESCO CO2培养箱(新加坡ESCO公司);碘化丙啶(PI)，鼠抗人p38 MAPK多克隆抗体，鼠抗人NF-κB p65多克隆抗体，鼠抗人II型胶原单克隆抗体(美国Sigma公司);BCA试剂盒;Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(中国碧云天公司);流式细胞仪(美国BD公司);Tanon EPS-300电泳仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 人髁突软骨细胞的原代培养

选取安康市中心医院2010～2015年间接受颞下颌关节病手术患者软骨组织10例，术前均征得患者知情同意，并经安康市中心医院医学伦理委员会批准。选取无炎症的髁突软骨组织，剪成1 mm2左右大小组织块，加入4倍量0.25%胰酶，37℃振荡消化30 min，加入等量含10%血清的DMEM培养基移入离心管，1 000 r/min，离心8min，去上清，加PBS漂洗2次，均匀铺在25 ml的培养瓶中，加入DMEM培养液培养，隔天换液，取3～6代细胞用于后续实验。

1.2.2 人髁突软骨细胞的鉴定

选取第3代软骨细胞爬片培养，待细胞贴壁至70%后在爬片上滴加4%多聚甲醛固定20 min,H2O2冲洗10 min。部分爬片滴加山羊血清封闭30 min;滴加鼠抗人II型胶原单克隆抗体(1∶100，一抗)，4℃过夜;次日滴加通用型二抗50μl,37℃孵育1 h;DAB显色，苏木精复染，自来水冲洗，脱水后封固。部分爬片1%甲苯胺蓝染色25min,H2O2冲洗，脱水封固，镜下观察。

1.2.3 MTT检测细胞活性

选取第3代对数生长期的软骨细胞按5×103/孔接种至96孔板内，培养24 h后，加入不同处理的培养基，各浓度设置5个复孔，分为对照组、IL-1β(10μg/L)组、IL-1β+IGF-1组(0、1、10、50、100μg/L)，并设置调零孔，培养24 h后，每孔加入20μl MTT溶液，孵育4 h，弃上清液，加入100μl DMSO，振荡后，酶标仪检测吸光度值(A490)

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布

选取第3代对数生长期细胞，按上述方法分组处理，24 h之后收集细胞。用1 ml 70%的乙醇在-20℃下固定12 h，冷PBS悬浮细胞，加入50μg/ml PI染液，避光温育30min，流式细胞仪检测细胞周期，计算增殖指数PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

选取第4代对数生长期细胞，按上述方法分组处理，24 h后收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒参照说明书操作，在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blot检测

选取第4代对数生长期细胞，按上述方法分组处理，24 h后，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉封闭，在杂交袋中与相应的一抗(均为1∶1 000)4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h,PBST洗膜3次，最后用ECL发光液在暗室曝光并压片。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，组间差异采用t检验、单因素方差分析方法比较，多重比较采用LSD-T检验，以P<0.05为差异为具有统计学意义。

2 结果

2.1 人髁突软骨细胞的培养与鉴定

原代软骨细胞贴壁后呈现三角形、多角形或不规则形(图1A);II型胶原免疫细胞化学染色见胞质为棕黄色，呈阳性(图1B)，甲苯胺蓝染色后细胞外基质可见蓝色异染颗粒，细胞核染成深蓝色(图1C)，经鉴定培养的细胞符合软骨细胞生长特性。

A:相差显微镜观察第4代髁突软骨细胞形态;B:免疫组化检测Ⅱ型胶原表达;C:甲苯胺蓝染色

A:Observation of the cells of the 4th passage by phase-contast microscope;B:TypeⅡcollagen expression examined by immunohistochemistry;C:Toluidine blue staining

2.2 IGF-1抑制IL-1β诱导的细胞增殖活性降低

MTT结果显示，与对照组相比，IL-1β作用之后，细胞活性降低为68.13%(图2)。而在IGF-1处理之后，细胞活性明显的升高，并呈现一定的剂量依赖效应(P<0.05)。

#:与control组比较，P<0.05;*:与IL-1β组比较，P<0.05

#:Compare with control,P<0.05;*:Compare with IL-1βgroup,P<0.05

注:1与control组比较;2 IL-1β组比较，P<0.05

流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示，与对照组比较，IL-1β作用之后，G0/G1期，S期的比例升高，G2/M比例和细胞增殖指数(PI)降低;而在IGF-1处理之后，PI明显升高(表1)(P<0.05)。

2.3 IGF-1抑制IL-1β诱导的细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，与对照组相比，IL-1β作用之后，细胞出现了明显的凋亡现象(图3)，其中早凋百分数为13.26%，晚凋百分数为21.04%;而在IGF-1处理之后，细胞凋亡明显被抑制，并呈现一定的剂量依赖效应(P<0.05)。

2.4 IGF-1抑制IL-1β诱导的Bcl-2/Bax比值降低

Western blot结果显示，与对照组相比，IL-1β作用之后，细胞中Bcl-2/Bax比值降低，Caspase-3表达升高(图4);而在IGF-1处理之后，Bcl-2/Bax比值升高且Caspase-3表达降低，并呈现一定的剂量依赖效应(P<0.05)。

A:Western bolt;B:组间比较;#:与control组比较，P<0.05;*:与IL-1β组比较，P<0.05

A:Western blot;B:Comparision among groups;#:Compare with the control,P<0.05;*:Compare withIL-1βgroup,P<0.05

2.5 IGF-1抑制IL-1β诱导的细胞中p38 MAPK/NF-κB表达上调

Western blot结果显示，与对照组相比，IL-1β作用下，细胞p38 MAPK与NF-κB蛋白表达显著升高(图5)，而不同浓度IGF-1(0、1、10、50、100μg/L)预处理后，p38 MAPK和NF-κB p65蛋白的表达均显著下降，并呈现一定的浓度依赖性(P<0.05)。

3 讨论

颞下颌关节骨性关节炎(TMJOA)的发病机制除了年龄、遗传及生物力学等因素外，细胞因子与炎症介质亦参与其中[4]。软骨细胞作为靶细胞，受到IL-1β等炎症介质的作用必然影响到自身的增殖、分化以及凋亡[5]。本实验结果显示，髁突软骨细胞在IL-1β作用之下，细胞活性明显下降。

IGF-1主要在骨和软骨细胞中分泌，促进软骨细胞以及骨细胞的增殖[6]。另外，无论是内源性或外源性IGF-1，都在细胞周期进程中发挥重要作用，从而促进软骨细胞的增殖分化[7]。本实验表明，IL-1β诱导下，软骨细胞活性明显降低，细胞增殖指数(PI)降低;而IGF-1预处理之后，细胞活性和细胞增殖指数均明显逐渐增加。

A:Western bolt;B:组间比较;#:与control组比较，P<0.05;*:与IL-1β组比较，P<0.05

A:Western blot;B:Comparision among groups#:Compare with the control,P<0.05;*:Compare with IL-1βgroup,P<0.05

Bcl-2家族是细胞程序性死亡中的调节因子，包括抑凋亡基因(Bcl-XL,Bcl-2)以及促凋亡基因(Bax,Bid)[8]。Huang等[9]对兔颅下颌关节研究显示，Bcl-2以及Bax蛋白通过凋亡信号途径参与软骨细胞的生存或死亡。Bcl-2与Bax的比值反映了软骨细胞增殖或凋亡的过程，当Bcl-2/Bax比值增大，细胞趋向增殖，反之则细胞走向凋亡[10]，另外Caspase-3蛋白的激活也是细胞凋亡的标志。本实验揭示，在IGF-1预处理之后，Bcl-2/Bax比值逐渐增大，Caspase-3的激活量逐渐减少，细胞凋亡明显被抑制。

近年来，人们发现丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPKs)信号通路在OA发病机制中发挥了关键性作用[11]。有研究证实，在炎症过程中p38 MAPK诱导MMP-13的表达，促进了软骨的破坏，而NF-κB参与了MMP-13的表达[12]。本实验证明，IL-1β诱导下，p38 MAPK和NF-κB的蛋白表达均显著上升，IGF-1预处理下，p38 MAPK和NF-κB p65蛋白的表达均显著下降。这表明p38 MAPK/NF-κB通路可能参与IGF-1对软骨细胞的作用。

综上所述，通过IL-1β和不同浓度IGF-1作用，发现IGF-1可通过抑制p38 MAPK/NF-κB活化，促进细胞增殖，并拮抗L-1β诱导的髁突软骨细胞凋亡。通过研究IGF-1在颞下颌关节软骨中的作用，提出将IGF-1应用于临床的思考，对颞下颌关节病的治疗有着重要的意义。

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细胞增殖与凋亡 篇8

1 材料与方法

1.1 主要材料与实验试剂

乳腺癌细胞系SK-BR-3(ER-/PR-/H er-2+++)由复旦大学乳腺癌研究所提供。D M EM培养液、胎牛血清由G ibco公司生产。M TT、二甲双胍由Sigm a公司生产,A nnexin V-FITC&PI凋亡检测试剂盒由南京凯基生物公司提供,产品编号:K G A 105。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在5%二氧化碳、37℃条件下,SK-BR-3细胞置于含10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、100 IU/m L青霉素、100 m g/L链霉素的D M EM培养液中培养。待细胞融合至80%,用0.25%胰酶消化传代后接种(细胞密度5×104)于培养瓶或孔板,待细胞融合至约70%后用于实验。

1.2.2 二甲双胍体外抑制乳腺癌细胞增殖的实验研究

M TT法检测细胞增殖抑制率:将SK-BR-3细胞用0.25%胰酶消化后,以1×106/m L接种于96孔培养板中,37℃过夜。将细胞分为A组(SK-BR-3细胞正常培养组,加入PBS,模拟药物)、B组(SK-BR-3细胞+0.5 m m ol/L二甲双胍)、C组(SK-BR-3细胞+2.0 m m ol/L二甲双胍)和D组(SK-BR-3细胞+8.0 m m ol/L二甲双胍),每组设3复孔。分别于培养12 h、36 h、72 h后将96孔板中的细胞以500 g离心3 m in,弃100μL上清液,加M TT10μL(5 m g/m L),37℃孵育4 h,每孔加入D M SO150μL,震荡10 m in摇匀,上酶标免疫测定仪检测每孔O D 570值。计算细胞增殖抑制率,抑制率=(1-处理组A/PBS液对照组A)×100%。

1.2.3 二甲双胍诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

采用A nnexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,按试剂盒说明书操作:将A、B、C和D组细胞分别培养24 h,悬浮细胞离心(2 000 r/m in离心5 m in)收集;贴壁细胞用不含ED TA的胰酶消化收集(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);用PBS洗涤细胞二次(2 000 r/m in离心5 m in)收集1~5×105细胞;加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5μL A nnexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀;室温、避光、反应5~15m in,1 h内进行流式细胞仪的检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件。计量资料采用均数±标准差表示。计量采用独立样本的t检验;计数资料比较采用χ2检验。设P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 二甲双胍体外抑制乳腺癌细胞增殖结果

二甲双胍体外抑制乳腺癌细胞增殖结果,分别见表1、图1、图2。

/%

注:各浓度二甲双胍处理组与对照组比较,P<0.05,差异有显著性。

由图1、图2可见,随着二甲双胍浓度的逐渐增加和干预时间的推移,SK-BR-3细胞的增殖抑制逐渐增加。

2.2 二甲双胍诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

由图3可见,流式细胞仪检测二甲双胍诱导SK-BR-3细胞凋亡的结果显示:A、B、C和D组的细胞凋亡率分别为3.21%、4.43%、6.88%和15.09%。B、C和D组与A组对比,仅D组的细胞凋亡率差异有显著性(χ2=8.79,P=0.003)。D组的细胞凋亡率与B组相比差异也有显著性(χ2=7.04,P=0.008)。

3 讨论

二甲双胍由于具有稳定降血糖、低血糖及乳酸酸中毒发生率低等临床优势而被广泛应用于2型糖尿病患者的临床治疗。最近研究表明[10],二甲双胍对多种肿瘤如前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌及乳腺癌等均具有抑瘤作用。主要机制可能为二甲双胍作用于细胞周期,使细胞周期停滞,同时通过激活细胞凋亡信号转导通路促进肿瘤细胞凋亡。JIR A LER SPO N G等[4]回顾性临床研究揭示,糖尿病合并乳腺癌患者中,接受二甲双胍治疗患者较未服用二甲双胍患者,新辅助化疗的病理完全缓解率较高(24%v8%,P=0.007)。但此研究未揭示不同分子分型乳腺癌患者口服二甲双胍与患者新辅助化疗疗效的关系。针对不同分子分型的乳腺癌,二甲双胍的作用仍不清楚。

CR ISTIN A等[11]应用基因组学及蛋白组学方法,研究揭示了二甲双胍通过激活A M PK信号转导通路,抑制乳腺癌细胞M期相关基因表达,从而阻止乳腺癌细胞周期于G 2期。D O W LIN G等[12]报道二甲双胍通过激活A M PK系统抑制m TO R的表达并干预翻译的起始过程来抑制人乳腺癌细胞的生长。国内学者汪洋等[13]应用不同浓度二甲双胍干预雌激素受体表达不同乳腺癌细胞,观察二甲双胍对细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,二甲双胍对ER阳性乳腺癌细胞的抑制作用优于ER阴性的乳腺癌细胞,可能与低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,H IF-1α)的低表达有关。刘杏娥等[9]研究了二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞的作用。结果显示,二甲双胍通过抑制EG FR信号通路的分子活化而抑制了三阴性乳腺癌细胞的增殖,同时促进其凋亡。V A ZQ U EZ等[14]研究发现,二甲双胍能抑制H er-2阳性乳腺癌细胞的增殖,在低治疗浓度时能抑制H er-2酪氨酸激酶的活性,而在高浓度时能显著降低H er-2的表达。但此研究未揭示二甲双胍抑制H ER 2受体通路后下游关键分子的表达情况与H ER 2阳性乳腺癌细胞增殖抑制的关系。二甲双胍对H ER 2阳性乳腺癌细胞的作用机制仍未阐明。

本研究结果发现,不同浓度的二甲双胍与H ER 2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞共同培养后,随着二甲双胍的浓度逐渐增加,作用时间的不断延长,SK-BR细胞的增殖抑制也逐渐增强。SK-BR-3细胞经二甲双胍处理后,细胞凋亡率明显高于对照组(P值<0.05)。这一结果提示二甲双胍能在体外诱导SK-BR-3细胞凋亡,抑制细胞增殖。二甲双胍抑制癌细胞的增殖和促进癌细胞的凋亡的分子机制尚不清楚[17,18]。

综上所述,二甲双胍能够抑制H ER 2阳性乳腺癌细胞的增殖并且促进其凋亡,相关分子机制还有待进一步研究。

摘要：目的 探讨二甲双胍对人HER2阳性乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响。方法 不同浓度的二甲双胍干预人HER2阳性乳腺癌细胞SK-BR-3后,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,观察二甲双胍对HER2阳性乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响。结果 不同浓度的二甲双胍与SK-BR-3乳腺癌细胞共同培养后,随着二甲双胍浓度的逐渐增加,SK-BR-3细胞的增殖抑制也逐渐增加,细胞存活率逐渐下降。统计分析表明,不同浓度的二甲双胍处理组与对照组比较,差异均有显著性(P值均<0.05)。乳腺癌SK-BR-3细胞经二甲双胍处理后,细胞凋亡率(15.09%)明显高于对照组(3.21%),两者比较,差异有显著性(χ2=8.79,P=0.003)。结论 二甲双胍对人HER2阳性乳腺癌细胞有增殖抑制及促凋亡作用,其分子机制有待进一步研究。

细胞增殖与凋亡 篇9

1 材料和方法

1.1 材料

胆管癌细胞QBC939引自中南大学细胞中心(来源),四唑盐(MTT)购于美国Sigma公司,新生牛血清(NCS)购自杭州四季青公司。EGCG购自美国Sigma公司,纯度大于95%,以二甲基亚酚(DMSO)溶解。

1.2 细胞培养

QBC939细胞培养于含10%新生小牛血清的1640培养基,对照组肿瘤细胞置于37℃,5%二氧化碳,95%空气和饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中常规培养;置于三气培养箱(2%氧气、5%二氧化碳、93%氮气、37℃、饱和湿度)中低氧培养48 h诱导缺氧。

1.3 MTT法检测茶多酚对缺氧QBC939细胞生长抑制率

QBC939细胞按4×104/孔接种于96孔板,依次加入不同浓度的茶多酚(0、10、20、40、80和160μmol/L),孵育12、24、48、及72 h,每组设复孔6个,置于三气培养箱培养48 h,收集细胞,选用酶标仪和MTT比色法测定胆管癌细胞存活率,测定波长为570 nm。细胞生长抑制率(%)=(缺氧诱导对照组A值一实验药物干预组A值)/(缺氧诱导对照组A值一空白组A值)×100%。统计并计算茶多酚抑制缺氧诱导胆管癌细胞的效率。根据对肿瘤细胞的抑制率确定下一步实验药物浓度。

1.4 过河实验

生长旺盛的QBC939细胞以0.25%胰酶消化、培养液洗涤终止消化后,用含10%小牛血清培养液配制104/m L的QBC939细胞悬液,按每孔3 m L加入6孔板,二氧化碳培养箱培养24 h,使细胞贴壁,吸弃原培养液,加入不同浓度的EGCG(0、40、80和160μmol/L),三气培养箱内继续观察48 h,吸弃孔中培养液,PBS液冲洗1次;用10μL枪头在孔中划一直线后,用PBS冲洗两次;加入含10%小牛血清培养液,继续培养,每两小时观察1次,直至划痕被细胞填满。同样实验重复6次。和缺氧诱导对照组。

1.5 流式细胞仪检测EGCG对低氧诱导QBC939细胞周期和凋亡的影响

25 cm培养瓶分别接种细胞4×105;缺氧诱导的肿瘤细胞用EGCG(0、40、80、160μmol/L)分别作用48 h,按细胞周期检测试剂说明书处理细胞后上流式细胞仪进行检测。设常养培养组。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测VEGF含量

实验分组同上,收集细胞上清,按试剂盒要求,测定上清中VEGF含量。

1.7 统计分析

所有数据均以均数±标准误(x±s)表示。用SPSS 13.0进行统计学处理,组间差异采用单因素方差分析,双侧P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 茶多酚对缺氧QBC939细胞的抑制作用

EGCG呈浓度(0、10、20、40、80和160μmol/L)和时间(12、24、48和72 h)依赖性抑制缺氧胆管癌细胞的增殖。EGCG(10、20、40、80和160μmol/L)各浓度组作用48 h及72 h的抑制率较12 h和24 h组显著增加(P<0.05),但72 h与48 h差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 EGCG对缺氧诱导的胆管癌细胞迁移能力的影响

由表2可知,与对照组比较,缺氧诱导(EGCG,0μmol/L)肿瘤细胞过河时间显著缩短;EGCG(40、80和160μmol/L)处理后,胆管癌细胞过河时间显著延长,表明EGCG可抑制缺氧胆管癌细胞迁移。见表2。

注:覮与缺氧诱导组比较,P<0.01

2.3 EGCG对低氧诱导QBC939细胞周期的影响

与常氧对照组比较,缺氧培养可导致G1期细胞显著减少,而S期和G2期细胞显著增加;与缺氧对照组肿瘤细胞比较,EGCG(40μmol/L)对缺氧诱导QBC939细胞周期影响不明显;EGCG(80μmol/L)使缺氧诱导的QBC939胆管癌细胞G1期细胞显著增多(P<0.01);EGCG(160μmol/L)使缺氧诱导的QBC939胆管癌细胞G1期细胞显著增多,同时伴有S期和G2期细胞减少(P<0.01)。见图1。

2.4 EGCG对低氧诱导QBC939细胞凋亡的影响

常氧对照组肿瘤细胞凋亡率为(11.9±1.7)%,缺氧诱导组凋亡率下降为(6.5±0.9)%(P<0.01);EGCG(40、80和160μmol/L)处理组细胞凋亡率均显著增加(P<0.01)。见图2。

2.5 EGCG对低氧诱导QBC939细胞VEGF合成的影响

常氧对照组肿瘤细胞内VEGF合成量为(1 822.1±102.3)Pg/mL;经缺氧诱导后胆管癌细胞VEGF合成为(2 515.2±190.1)Pg/mL;经不同浓度的EGCG(40、80和160μmol/L)处理后,VEGF合成分别逐渐下降,见表3。

注:覮与缺氧诱导组比较,P<0.01

A:常氧对照组;B:缺氧诱导组;C:EGCG干预组(40μmol/L);D:EGCG干预组(80μmol/L);E:EGCG干预组(160μmol/L)

A:常氧对照组;B:缺氧诱导组;C:EGCG干预组(40μmol/L);D:EGCG干预组(80μmol/L);E:EGCG干预组(160μmol/L)

3 讨论

胆管癌存在持续低氧的微环境,肿瘤细胞为适应缺氧,细胞内系列缺氧基因激活,肿瘤血管新生增加,肿瘤细胞增殖和转移加快。本实验发现:低氧诱导QBC939细胞活力和迁移能力也明显增强;细胞分裂相增加,S期细胞明显增多,表明缺氧具有促胆管癌细胞生长作用。VEGF是一种重要的细胞缺氧适应的应答因子,也是一种重要的促血管生成因子,可特异地刺激肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建,可直接反映肿瘤生长的速度和转移倾向,在肿瘤细胞生长、凋亡、存活和分化中起关键作用,VEGF表达在多种肿瘤中,与血管增生和术后转移及复发呈正相关[3,4,5];本实验中,胆管癌细胞体外低氧培养48 h后,VEGF合成明显增高。这也表明VEGF是肿瘤细胞为适应缺氧微环境并维持其生长和侵袭的重要调控环节。

绿茶是一种应用非常广泛的饮料,主要成分有茶多酚、咖啡碱、脂多糖等[6]。EGCG是茶多酚的主要成分,含酚性羟基最多,抗氧化能力最强,表现抗基因突变、抑制炎症反应、抗病毒及清除自由基和抗氧化等作用[6,7],近年研究表明,EGCG具有抗大肠癌、胰腺癌、胃癌等消化道肿瘤作用[8,9]。本组的细胞周期实验发现:EGCG处理后,缺氧胆管癌细胞增殖与迁移显著下降,缺氧胆管癌细胞G0/G1细胞所占比率增加,S期细胞明显减少,出现G1/S阻滞的细胞增殖抑制,表明EGCG具有细胞生长抑制作用,且呈剂量依赖性;凋亡流式检测结果显示,经不同浓度EGCG预处理后,缺氧胆管癌细胞凋亡率逐渐增加,提示EGCG具浓度依赖性诱导细胞凋亡。研究已经发现,EGCG可以抑制IKKa蛋白表达,导致p65核移位受阻滞,可下调Bcl-2、上调Bax-和促进Caspase-3的剪切[10,11],故EGCG的促胆管癌细胞凋亡作用可能与以上机制有关。

本研究中,探讨不同浓度EGCG对胆管癌细胞的影响是否与抑制VEGF表达有关的实验发现,缺氧胆管癌细胞合成VEGF较常氧组显著增高,经EGCG预处理,胆管癌细胞合成VEGF水平下降,且与浓度相关,表明EGCG对肿瘤细胞VEGF合成有抑制作用。

综述以上结果推测,EGCG通过下调VEGF的表达,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长及转移,诱导缺氧胆管癌细胞凋亡。

参考文献

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[10]YAN Z,YONG-GUANG T,FEI-JUN L,et a1.Interference ef-fect of epigaliocatechin-3-Sallate on targets of nuclear factorkappa B signal transduction pathways activated by EB virusencoded latent membrane protein 1[J].Int J Biochem Cell Bid,2004,36(8):1473-1481.

细胞增殖与凋亡 篇10

研究证实,阿托伐他汀钙(ATV)通过钙调通道差异性表达来减弱野百合碱诱导的PAH大鼠的肺动脉重构[4]。Guerard等[5]证明普伐他汀可抑制野百合碱诱导的PAH进展,改善肺动脉内皮依赖性舒张功能。此外,Taraseviciene-Stewart等[6]研究提示辛伐他汀能够显著降低平均肺动脉压力,缓解右室肥厚,其机制可能与抑制凋亡蛋白Caspase-3激活、减少肺微血管内皮细胞凋亡有关。信号转导通路磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是许多生命活动中关键的信号转导分子,参与调控细胞分裂﹑分化﹑凋亡、增殖及迁移等活动。经ATV后处理可激活PI3K/AKt信号通路,减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤[7]。但ATV是否参与调控PASMCs的生物学行为仍不十分清楚。因此,本研究旨在探讨ATV对野百合碱诱导的PASMCs增殖的调控作用,探讨PI3K/AKT信号通路是否参与ATV逆转野百合碱诱导的PASMCs增殖,从而为ATV治疗PAH提供新思考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

野百合碱购于上海纯优生物科技有限公司;ATV购于上海研生实业有限公司;双抗购自友康基业生物科技有限公司;细胞培养液DMEM-F12购自Invitrogen公司;SYBR Green PCR Master Mix染料荧光定量Real-time PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;胎牛血清购自Gibco公司;蛋白电泳仪、PVDF膜购于BIO-RAD公司;紫外分光光度仪购于美国BIO-RAD公司;Odyssey红外荧光扫描成像系统购于美国LI-COR公司;抗PI3K、AKT、Bcl-2及Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司;6孔板和96孔板购自上海拜力生物科技有限公司;共聚焦显微镜FV300购自日本Olympus公司。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统购于Media Cyberneties公司。

1.2 PASMCs细胞培养

Wistar乳鼠购于哈尔滨医科大学附属第二临床医院动物中心。动物实验研究遵循哈尔滨医科大学所制订的有关实验动物保护和使用的指南,并经实验动物伦理委员会批准(批准文号:2009104)。本研究采用组织块种植法:取Wistar乳鼠,脱颈椎处死后,消毒后剖开胸腔,迅速取出心肺置于D-Hanks液中。迅速剥离肺动脉主干及左右肺动脉,用D-Hanks液反复漂洗。剥除血管外膜的纤维脂肪层,沿血管外侧纵向剪开,将血管内膜面向上,用刀片去除内皮细胞,在DMEM-F12培养液中漂洗2次。将中膜剪成0.5 mm×1 mm小块,移入培养瓶内,组织块之间距约0.5 cm。然后将培养瓶翻转,置于37℃、CO2培养箱中。1 h后轻轻翻转并加入含20%胎牛血清的DMEM-F12培养液,使组织块浸泡在培养液中,置于37℃、CO2培养箱中静置培养1周。1周后再观察及换液。此后,改用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液,每隔3 d换液1次。当大部分组织块长出细胞晕,并且相邻组织块间细胞晕融合时,振摇培养瓶,使组织块脱壁,吸除培养液和脱壁组织块,加入2~3 m L无菌D-Hanks液清洗2次后,用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化分散细胞,进行传代培养。通过三瓶置换法纯化PASMCs。第3~6代细胞用于后续实验。

1.3 药物干预

将PASMCs细胞分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。野百合碱组PASMCs细胞培养液中加入野百合碱(1μmol/L);对照组给予等剂量的生理盐水;野百合碱+ATV组在培养液中加入1μmol/L野百合碱的同时给予ATV(10μmol/L);野百合碱+ATV+SC79组在培养液加入1μmol/L野百合碱的同时给予ATV(10μmol/L)和SC79(AKT特异性激动剂,150μmol/L)。继续培养48 h后用于后续的实验。

1.4 MTT实验

收集各组PASMCs细胞,以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板,每孔培养液总量200μL,于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h,每孔加入20μL MTT溶液(5 mg/m L),继续培养4 h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2~3遍后,再加入含MTT的培养液。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白对照孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),每组设定3个复孔。以加药前的吸光值作为100%,各时间点与其比较。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡

将爬满PASMCs细胞的载玻片用PBS洗涤1次。室温下晾干,利用4%多聚甲醛固定PASMCs细胞30 min,再用PBS冲洗载玻片2次,每次5 min。4 m L3%H2O2加36 m L甲醇配制的封闭液封闭细胞10 min。PBS洗2次,每次5 min。加入穿透液(通透液的配制:0.1%Triton X-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制),冰上(2~8℃)促渗2 min。加入Roche原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色,每张载玻片加50μL TUNEL反应混合液,放入避光湿盒中,于37℃孵箱中孵育1 h。在暗室中利用PBS洗玻片2次,每次5 min。加入DAPI进行细胞核染色,37℃培养箱孵育10 min。用抗荧光淬灭封片液进行封片,置于荧光显微镜下观察,计算每组细胞的凋亡率。

1.6 免疫印迹(Western blot)分析PI3K、AKT、Bcl-2以及Bax蛋白的表达

将各组细胞培养瓶置于冰上,PBS洗涤细胞3次,每个培养瓶中加入适量细胞裂解液,超声裂解组织,每次工作20 s,间歇30 s,反复5次,之后放置冰上裂解30 min,13 500 r/min高速离心机于4℃条件下离心15 min,收集上清液于-80℃冰箱中保存。取1μL样品应用BCA试剂盒测定细胞中蛋白质浓度。依次配制分离胶和积层胶,每个孔道中加入80~100μg的样品量。电泳槽联通电泳仪电源,90V电压跑浓缩胶。待测样品和进入分离胶后,电压改为120V,电泳60~90 min后,溴酚蓝快迁移出分离胶时停止电泳。按照“纤维垫-滤纸-凝胶-硝化纤维膜-滤纸-纤维垫”的顺序由下至上排列安装好,恒定300 m A电流,转膜时间为80 min。取出NC膜置于5%的脱脂奶粉中,在4℃的环境中封闭2 h。分别用一抗PI3K抗体(1∶200)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、GAPDH(1∶1000)在4℃冰箱中孵育过夜。取出孵育过抗体的NC膜,用PBS-T洗涤3次,每次10 min。然后用(1∶4000)稀释的红外荧光标记二抗均匀铺展在NC膜上,避光孵育1 h后用PBS-T洗涤3次,每次10 min。最后用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行检测,计算其灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据,计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATV能明显抑制PASMCs细胞增殖

MTT实验检测结果表明,与对照组(1.03±0.04)比较,在野百合碱能诱导作用下,PASMCs细胞的增殖明显上调(1.68±0.07),差异有高度统计学意义(P<0.01),而ATV能明显逆转野百合碱诱导PASMCs细胞的增殖的能力(0.55±0.18)(P<0.01)。

2.2 ATV能促进PASMCs细胞的凋亡

TUNEL染色法结果证明,与对照组比较,PASMCs细胞经过ATV处理后,被TUENL染色染成绿色的凋亡细胞明显增多,而野百合碱处理组不会引起细胞凋亡数量的增加(P<0.01)(图1,封四)。

2.3 ATV能抑制PASMCs细胞中PI3K/AKT信号通路

Western blot检测结果显示,与对照组及野百合碱组比较,野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中PI3K和AKT的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图2)。

与对照组比较,**P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

2.4 AKT特异性激动剂SC79逆转ATV的作用

Western blot检测结果显示,与野百合碱+ATV组比较,AKT特异性激动剂SC79可以显著逆转ATV抑制PASMCs细胞中AKT的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图3)。

2.5 ATV能调控PASMCs细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达

Western blot检测结果显示,与对照组及野百合碱组比较,野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中Bcl-2的表达,促进Bax蛋白的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图4)。

与野百合碱组比较,**P<0.01;与野百合碱+ATV组比较,##P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

与对照组比较,**P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

3 讨论

PAH是慢性阻塞性肺疾病发展成肺源性心脏病的重要环节,其发病机制尚未完全阐明。本研究采用野百合碱体外诱导PASMCs增殖,研究ATV对PASMCs增殖及诱导凋亡中的作用。研究结果提示:(1)野百合碱在体外诱导PASMCs增殖,且ATV能明显抑制野百合碱诱导增殖的能力。(2)ATV能明显诱导PASMCs发生凋亡。(3)ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号通路而发挥作用。(4)ATV能明显诱导促凋亡蛋白Bax的表达,而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

ATV是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂,可以有效降低体内胆固醇合成[8,9,10]。近年来大量研究发现ATV还存在着除了降低血清胆固醇水平的特性之外的“多效性”作用。这些作用包括抗氧化、刺激内皮祖细胞分化、改善内皮功能、抗炎等[11,12,13]。此外,ATV可有效抑制血管平滑肌细胞增生,稳定动脉斑块,改善心肌重构,抗血小板以及抗凝等[14]。然而,ATV在抑制PAH发生发展方面的研究较少,本研究提示ATV可能通过诱导PASMCs发生凋亡而发挥抗凋亡的作用。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞功能的重要的信号转导通路[15],包括生长因子在内的多种刺激能够激活血管平滑肌细胞的PI3K,进而提高细胞内IP含量,然后活化AKT,参与调控细胞的迁移、增殖和凋亡等[16]。文献报道,PI3K/AKT信号通路在血管平滑肌细胞增殖的发生发展过程中起着非常重要的作用[17]。近年来有研究证实,生长因子及缺氧等可激活PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路,诱导PASMCs增殖;而抑制PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路,则可抑制生长因子及缺氧刺激的PASMCs增殖,提示PI3K/AKT信号通路可能特异性介导PASMCs的增殖[17,18]。Wang等[19]进一步证实PI3K/AKT信号转导通路可通过特异性调控细胞周期蛋白的表达,促进细胞周期进展,诱导PASMCs增殖,且活体动物研究进一步证实抑制PI3K/AKT信号通路可预防及治疗多种诱因导致的PAH的发生。Chao等[20]报道,PI3K/AKT和ERK/p38 MAPK信号通路的平衡决定了PASMCs表型的变化。本研究发现ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路而发挥抑制PASMCs增殖的作用。本研究免疫印迹检测结果显示,与对照组比较,ATV能够增加抑制AKT蛋白的磷酸化,并且诱导促凋亡蛋白Bax的表达而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。TUNEL实验进一步证明我们的结论,ATV能够诱导PASMCs发生凋亡。

总之,通过本研究提示ATV通过作用于PI3K/AKT信号通路调控PASMCs细胞增殖,诱导细胞凋亡,为PAH治疗提供新的治疗策略。

摘要：目的 探讨阿托伐他汀钙(ATV)对野百合碱诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡作用及其分子机制。方法 将PASMCs随机分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。应用MTT法检测PASMCs细胞的生长情况,荧光TUNEL法分析PASMCs细胞凋亡情况,并用免疫印迹法检测PASMCs细胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2以及Bax表达的变化。结果 与对照组比较,野百合碱组PASMCs细胞增殖明显增强(P<0.01),ATV能明显抑制MCT诱导的PASMCs细胞增殖(P<0.01),且ATV可明显降低PI3K/AKT通路蛋白及Bcl-2蛋白的表达,而升高Bax蛋白的表达,诱导PASMCs细胞凋亡(P<0.01)。此外,AKT特异性激动剂SC79能逆转ATV的作用。结论 ATV通过作用于PI3K/AKT信号通路调控PASMCs细胞增殖,诱导细胞凋亡,为肺动脉高压治疗提供新的治疗策略。