环氧酶抑制剂

关键词：

环氧酶抑制剂（精选八篇）

环氧酶抑制剂篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2013年7月-2014年12月于本院心内科住院治疗的38例CHD患者作为观察组, 其中男20例, 女18例;年龄50~69岁, 平均 (57.9±2.6) 岁。所有入选患者临床上均明确存在心肌缺血表现, 同时经冠脉造影均已经确诊为CHD患者。排除严重创伤或接受重大手术者、半年内发生脑血管意外者、甲状腺机能减退者、肾病综合征者、孕妇及哺乳期妇女、存在自身免疫性疾病者、存在急慢性肝胆疾病者、恶性肿瘤者、瓣膜性心脏病者、结缔组织病者、心功能Ⅳ级者、过敏体质及精神病患者。另择同期健康体检的38例健康者作为对照组, 其中21例, 女17例;年龄50~68岁, 平均 (58.1±1.8) 岁。两组性别和年龄方面比较差异均无统计学意义 (P<0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试验试剂

胎牛血清为Gibco公司生产, VEGF为美国Peprotech公司生产, EGM-2培养液为美国Clonetics公司研发, 淋巴细胞分离液为中国科学院血液研究所研发。人纤维粘连蛋白、FITC标记的荆豆凝集素均为美国Sigma公司生产。Di标记的乙酰化低密度脂蛋白为美国Moiecular Probe公司生产, Matrigel-Matrix为美国BD biosciences公司生产, VEGF抗体、GAPDH抗体均为英国Abcam研发。

1.2.2 EPCs分离及培养

清晨于无菌条件下抽取两组研究对象空腹肘静脉血, 抽取量均为30 m L作为样本。将血液样本放入含有200μL肝素的50 m L无菌离心管中, 然后将等体积的PBS液加入离心管, 并进行混匀摇动。沿着管壁缓慢地将已经过稀释的抗凝血加入盛有淋巴细胞分离液的无菌离心管 (15 m L) 中, 淋巴细胞分离液与抗凝血的比例控制为1∶2。完成离心操作后, 将乳白色单个核细胞层吸出, 将其放入新的无菌离心管 (15 m L) 中, 然后将等量的PBS液加入离心管中, 并进行充分混匀[4,5]。进行离心操作之后将洗涤液去净, 然后将4 m L的EGM-2完全培养基加入离心管中, 同时进行充分混匀。EGM-2完全培养基中含有浓度为20%的胎牛血清, 100 U/m L的青霉素, 100 U/m L的链霉素[6,7]。将等量的细胞移入已包被人纤维粘连蛋白的6孔板中, 然后放置于37℃、CO2含量为5%的培养箱中进行培养, 在培养的第4、6天分别进行半量换液。

1.2.3 EPCs双染色鉴定

使用PBS液将非贴壁细胞清洗掉, 将2.4 mg/L Dil-ac LDL贴壁细胞放置于37℃环境中进行1 h的孵育之后, 对EPCs对Dil-ac LDL的摄取情况进行检测[7]。使用浓度为2%的多聚甲醛迪欧细胞进行10 min的固定, 然后使用PBS液进行洗涤。完成洗涤之后在标本中加入10 mg/L的FITC-UEA-I, 并将标本放置在37℃环境中进行1 h的孵育。使用激光共聚焦显微镜对FITC-UEA-I、Dil-ac LDL双染色阳性细胞为处于正在分化状态的EPCs进行鉴定。

1.2.4 EPCs的流式细胞仪鉴定

PBS液将非贴壁细胞洗掉之后, 使用浓度为0.125%的胰酶进行5 min的消化之后将细胞进行收集。实施1000 r/min的离心操作之后使用PBS液对待测细胞浓度进行调整, 调整为2×108万个/m L。分别将10 m L的FITC标记CD31、抗CD34抗体加入, 然后进行30 min的避光反应。使用冷的PBS液对细胞进行洗涤, 将未结合的相关抗体全部去除, 然后使用流式细胞仪进行鉴定。

1.2.5 EPCs药物处理

实施时间为7 d的EPCs培养之后, 更换培养液浓度为1%的胎牛血清EGM-2进行24 h的培养, 然后分别与0、10-6、10-5、10-4mol/L的s EHi t AUCB作用, 作用时间为24 h。同时取对照组研究对象的EPCs进行上述处理作为对照, 该组标本不加入任何药物进行干预。

1.2.6 EPCs迁移检测

使用含有0.02%EDTA的胰蛋白酶 (0.25%) 对各组经过处理之后的细胞进行消化, 再用没有添加生长因子的EGM-2对细胞浓度进行调整, 调整为1×105/400μL[8,9]。将细胞添加到趋化性实验装置中的上层, 装置中的Transwell小室滤膜是孔径为8μm的聚碳酸脂微孔滤膜。将含有0、10-6、10-5、10-4mol/L的t AUCB培养液添加到下层, 进行时间为24 h的孵育之后, 使用细胞刷将存在于滤膜上层的未迁移细胞全部刮除, 分别使用戊二醛 (2.5%) 和甲醇 (100%) 进行固定, 实施HE复染, 使用200倍显微镜随机对10个视野进行观测, 对EPCs迁移细胞数进行测定[10,11]。

1.2.7 EPCs体外血管形成能力检测及Westem印迹

对Matrigel进行1∶2的稀释后, 将其平铺于24孔板上, 放置于37℃的培养箱进行1 h的培养, 使得Matrigel充分聚合。取EPCs (1×104个) 接种到Matrigel板, 分别将含0、10-6、10-5、10-4mol/L的t AUCB培养液加入, 进行24 h的孵育之后, 倒置于显微镜对新生血管的生成情况进行观察。

1.3 统计学处理

使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计学分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用X2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs鉴定结果

EPCs形态:通过分离操作所得的外周血单个核细胞处于培养的第3~4天时, 可以观察到部分贴壁细胞呈不规则三角形或者梭形, 梭形细胞的数量不断增加。在培养的第7~8天时, 出现诸多个集落, 贴壁的梭形细胞从细胞团边缘出芽并不断生长, 表现为放射状分布。该种细胞中央呈圆形, 周边为放射状梭形细胞结构为典型集落。培养至14 d时, 细胞紧密融合生长, 表现为“铺路石”样形态特征。使用激光共聚焦显微镜对EPCs结果进行初步鉴定, 细胞可摄取Dil-ac LDL, 同时可与FITC-UEA-1相互结合。其中, 双染阳性细胞被认为是处于正在分化状态的EPCs。使用流式细胞仪对接受7 d培养的细胞进行检测时, 表达血管内皮祖细胞表面标记CD34+、CD31+的阳性细胞率分别为 (53.58±5.64) %和 (40.45±6.58) %。

2.2 t AUCB对EPCs迁移活性和体外血管形成能力产生的影响

观察组EPCs迁移活性明显低于对照组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 与接受处理前 (0 mol/L) 相比较, 10-6、10-5、10-4mol/L浓度的t AUCB EPCs迁移活性随t AUCB浓度增加而不断增加, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。观察组EPCs体外血管形成长度明显低于对照组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 与接受处理前 (0 mol/L) 相比较, 10-6、10-5、10-4mol/L浓度的t AUCB作用新生血管形成长度随t AUCB浓度增加而不断增加, 新生血管形成长度均表现为浓度依赖性, 见表1。

2.3 CHD患者t AUCB对其EPCs表达VEGF产生的作用

处理前观察组EPCs VEGF表达为0, 处理后t AUCB浓度为10-6mol/L时, 患者EPCs VEGF表达为1.43 mol/L;t AUCB浓度为10-5mol/L时, EPCs VEGF表达为1.49 mol/L;t AUCB浓度为10-4mol/L时, EPCs VEGF表达为1.52 mol/L, 与处理前比较差异有统计学意义 (P<0.05) , t AUCB对其EPCs表达VEGF呈浓度依赖性增强, 提示CHD患者t AUCB对其EPCs表达VEGF表现为促进作用。

3 讨论

EPCs为一类血管内皮前体细胞, 其直接参与到胚胎时期的血管发生和出生之后的血管新生[13]。因为EPCs存在转化成为血管内皮细胞, 进而促进血管生成的能力, 其目前已经成为对缺血性疾病进行研究的一种不可或缺的靶细胞。冠心病 (CHD) 实质上为一种缺血性疾病, 因此, 在临床上治疗CHD的关键及根本在于促进新生血管形成, 实现血运重建[14]。

EPCs作为一类可循环、可增殖、存在多重分化功能的前体细胞, 其成为治疗CHD的重要研究内容。李振等[15]研究结果显示, EPCs可通过分化和迁移等方式直接参与到缺血组织损伤修复及新生血管重建中。血管内皮生长因子 (VEGF) 为目前已知的一种具有最强促血管生长功能的因子, 其高度特异性地对血管内皮细胞发生作用, 对其迁移、分化及增殖产生良好的诱导作用, 进而促进新生血管形成[13]。所以通过增加VEGF水平促进血循环中的EPCs活性得到有效增强, 实现血管新生, 进而促进缺血心肌血液灌注得到有效改善[16]。本次研究结果显示, 与健康者比较, CHD患者EPCs的VEGF表达明显下降, 而应用t AUCB之后, CHD患者EPCs的VEGF表达又表现出显著增加的趋势, 且该作用表现为浓度依赖性。同时本次研究还发现, CHD患者EPCs迁移活性和血管生成能力亦有明显增加, 其增加速度与t AUCB也表现为量效关系。由此可见, s EHi制剂t AUCB对CHD患者的EPCs功能存在正向调节作用, 该种作用对血管新生产生良好的促进作用, 故其在促进心肌缺血缺氧状态改善上发挥着重要作用[17]。s EH环氧二十碳三烯酸 (EETs) 为一类具有较强生物活性的内生性脂质环氧化合物, 但是EETs在细胞内的半衰期较短, 经过可溶性环氧化物水解酶 (s EH) 迅速催化后其失活便被降解。可溶性环氧化物水解酶抑制剂 (s EHi) 通过对s EH产生抑制作用而促进EETs效用得到明显增强。白洁等[18]的临床研究结果显示, EETs对VEGF介导的血管生成作用具有良好的促进作用, 所以可以推断, s EHi-EETs-VEGF为s EHi对EPCs功能进行正向调节的一个重要通路。EPCs为血管病变细胞进行修复的一种种子细胞, 使用EPCs对相关心血管疾病进行治疗的方式为一种新型治疗策略。在对新型药物进行开发的过程中, 应使药物具备对EPCs特性进行调节的功能, 只有这样才能更好地实现治疗效果的提高[19]。在本次研究中, 对38例CHD患者应用新型s EHi制剂t AUCB之后, 患者EPCs的VEGF表达得到有效促进。这个研究结果为CHD防治药物的研制提供了一条新思路, 对CHD防治效果的提高具有重要价值。

多肽类DNA甲基化转移酶抑制剂篇2

【关键词】异常DNA甲基化；DNA甲基化转移酶抑制剂；多肽类抑制剂

【中图分类号】R394．3 【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0175-02

【Abstract 】 Recently, the epigenetics has come to the fore in cancer research. DNA methylation, one of the best studied of epigenetic modifications, has accepted more and more attention. Aberrant DNA methylation can induce cancer. DNMT inhibitors can invert the aberrant methylation and thereby cure the cancer. Diverse classes of chemical compounds including peptide are being discovered and evaluated as DNMT inhibitors targeting DNA hypermethylation. This review will mainly discuss the developing peptide inhibitors of DNMT for cancer.

【Key words】Aberrant DNA methylation； DNMT inhibitors； Peptide inhibitors.

DNA甲基化与组蛋白去乙酰化作为研究最广泛的两种表觀遗传修饰方式备受关注［1］。DNA甲基化主要发生在CpG岛的胞嘧啶, 使用S-腺苷蛋氨酸(SAM 或 AdoMet)作为甲基供体，甲基基团与二核苷酸的胞嘧啶环第5号碳原子以共价键的形式结合，形成5-甲基胞嘧啶。整个过程由DNA甲基化转移酶（DNMTs）催化。到目前为止，已经发现的DNA甲基化转移酶包括：Dnmt1, Dnmt1b, Dnmt1o, Dnmt1p, DDnmt3a,Dnmt3a2, Dnmt3b和Dnmt3L ［2］。

全基因组低甲基化和局部特定基因的高甲基化都可以诱导肿瘤的发生。药物干预可以改变DNA的甲基化状态。目前作用于全基因组甲基化的药物鲜有报道［3］。大多数已报道的化合物均指向降低DNA甲基化水平，并激活抑癌基因的表达［4-5］。

1 DNA甲基化转移酶抑制剂

DNA甲基化转移酶抑制剂根据其结构可以划分为［6］：核苷类和非核苷类抑制剂（见表1）。核苷类DNA甲基化转移酶抑制剂主要包括5-氮胞苷（5-azacytidine），地西他滨（zebularine）等［7］。由于5-azacytidine，zebularine这类药物需要以共价键的形式并入到DNA链中，而且缺少特异性，会与其他DNA结合蛋白作用。因此该类药物显示了较高的毒性。而直接作用于DNMT催化区域的药物可以避免这种毒副作用［8］。

近年来，各种非核苷类DNA甲基化转移酶抑制剂被检测到具有去甲基活性。包括被FDA批准上市的药物普鲁卡因和普鲁卡因胺；第一个通过合理药物设计得到的合成类药物RG108；各种天然产物类分子如EGCG，姜黄素，小白菊内酯，psammaplin A，mahaniene等［9］；第二代寡义核苷酸药物MG98［10］。

表1 DNA甲基化转移酶抑制剂

2 多肽类抑制剂

多肽药物是当前医药市场的亮点。目前，FDA已批准上市了各种作用于不同靶点的多肽药物［11］。目前已报道的作用于DNMT的多肽药物并没有被广泛研究。

2.1 Pep515p：1997年，Glickman等研究了Dnmt1的翻译后修饰［12］。2007年，Goyal等进一步研究并鉴定了Dnmt的磷酸化位置［13］。Serine515是N端调控区域的主要磷酸化位点。EKIYISKIVVE是来源于Dnmt1的Ser515附近的多肽序列。该序列在多种已知的Dnmt1蛋白中具有较高的同源性。

EKIYISPKIVVE的设计依赖于蛋白的磷酸化对酶活性的影响可以通过区域-区域间的相互作用调节。而Ser 515位于DNA甲基化转移酶的N端调控区域, 正好可以与C端催化区域发生相互作用。在所测条件下，未磷酸化的多肽Pep515（EKIYISKIVVE）对Dnmt1的IC50为1500uM而磷酸化的多肽Pep515p（EKIYISPKIVVE）IC50值为150uM。而且，Pep515p可以特异性的抑制Dnmt1的催化区域，对Dnmt3a的活性无影响。在实验中用于对照的化合物WDGMAAGNAIER和KIVSEIYKIVE只有在高浓度时才会影响到Dnmt1的活性。这项数据显示了丝氨酸的磷酸化会影响甲基化转移酶的N端调节区与C端催化区域间的相互作用，进一步影响该多肽对DNMT1的抑制活性。

2.2 Bovine lactoferricin

牛乳铁素LactoferricinB（FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF），一个富含阳离子的多肽，具有抗菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤等多种生物学功能。25个氨基酸中，六个氨基酸残基即LfcinB 4-9（RRWQWR-NH2）组成了牛乳铁素的活性中心，尤其是位于6位及8位的Trp对LFB的抗菌活性有着重要的影响［14-15］。

牛乳铁素因为其卓有成效的抗菌作用受到广泛的关注。近来研究表明牛乳铁素对多种肿瘤细胞具有毒性作用。Roy等证实牛乳铁素还可抑制白血病细胞HL-60的转移。Vogel等推测该多肽可能通过影响DNMT的表达而起到抗肿瘤的作用。随后，Zhang等［16］通过qRT-PCR，Western Blot等实验证实，牛乳铁素可以降低DNMT蛋白及mRNA在Jurkat T-leukemia细胞中的表达。

2.3 Depsipeptide：HDAC环肽抑制剂包含已经上市的FK228(也被称为FR-901228，NSC-630176) 及FR901375等。FK228于2009年12月5日被FDA批准上市，用于甲状腺肿瘤﹑白血病﹑胰腺癌等多种疾病的治疗。研究表明FK228以前药的形式存在，当进入细胞中，它的二硫键即被还原为二个硫醇，从而与HDAC的锌离子结合。很多研究者报道了有效合成FK228的方法。Maro等合成了一系列相对于FK228活性更高的衍生物并研究了它们的构效关系［17-18］。

资料显示去甲基化药物5-aza-CdR和去乙酰化抑制剂在调节基因表达时起着相互重叠的作用，DNA甲基化，组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化可能共同组成了影响基因表达的调控体系。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA等可以抑制Dnmt3b的表达。所以我们有理由推断组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以直接影响DNA甲基化转移酶的活性。Wu等研究发现HDAC环肽类抑制剂具有去甲基能力［19］。当给予0.5 nM到5 nM的Depsipeptide 96小时时，RT-PCR显示Dnmt3a的表达以剂量依赖性方式在降低。然而，HDAC环肽抑制剂不能影响Dnmt1的表达，但它却可以阻止Dnmt1与p16, SALL3等抑制癌基因的结合。

3 結语

DNA甲基化作为表观遗传最主要的修饰方式之一受到众多关注。异常的DNA甲基化使得DNA甲基化转移酶抑制剂成为了极具潜能的抗肿瘤药物。由于核苷类DNA甲基化转移酶抑制剂毒副作用，非核苷类DNA甲基化转移酶抑制剂成为了当前该领域药物开发的热点。近几年，作用于Dnmts的抑制剂取得了较快的进展。Kuck及Franco等利用Dnmt1的同源模型分别对小分子化合物及天然产物进行了虚拟筛选，得到了若干相对于RG108活性较好的化合物［20-21］。当前，对已作用于DNA甲基化转移酶的多肽药物研究甚少，我们是否可以以现有的多肽药物为基础得到更加有效的去甲基化药物。

参考文献

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微生物环氧化物水解酶的研究进展篇3

环氧化物水解酶 (EH) 能选择性水解外消旋环氧化物生成具有光活性的环氧化物和二醇。微生物来源的EH不对称拆分外消旋的环氧化物, 不仅底物谱广泛, 而且具有酶的来源广泛, 对映体选择性高, 不需要金属离子和辅酶, 菌体可以通过发酵大量得到, 在非水介质中也能保持较高催化活性等特点[1]。

近年来, 微生物EH拆分外消旋的环氧化物已成为研究的热点, 相关的文献报道较多, 且部分酶已经被分离纯化和测序, 并被克隆到不同的宿主中表达, 改善了酶的催化特性, 为EH的大规模制备和应用提供了条件。

1 微生物EH的简介

1.1 微生物EH的催化反应机制

大多数EH属于α/β折叠型的酶, 含有两个功能性的结构域 (核心结构域和帽子结构域) , 由α螺旋和β折叠组成。活性位点为亲核残基Asp、His和羧酸残基 (Asp或Glu) , 帽子结构域中至少存在一个Tyr在催化过程中提供质子[2]。其催化反应机制为:第一步, 天冬氨酸残基亲核攻击环氧化物上的环碳原子, 形成共价酯中间体;第二步, 另一天冬氨酸残基辅助组氨酸活化水分子, 使酯中间体水解, 释放出产物。

Rhodococcus erythropolis DCL14的柠檬烯环氧化物水解酶 (LEH) 具有不同的结构和催化反应机制。该酶分子量较小, 为α螺旋和β折叠弯曲形成的口袋状结构, 活性位点为Arg99、Asp101和Asp132。其催化反应机制为:Asp101为环氧化物的氧提供质子;Asp132吸引水分子中的质子, 辅助环氧碳的亲核攻击;Arg99定位两个天冬氨酸的羧基, 稳定电荷;Tyr53、Asn55、Asp132与水分子形成氢键, 定位于有利于水分子亲核攻击底物的氧环, 水解过程中没有酯中间体的形成[3]。

1.2 EH活力的快速检测方法

目前, 已报道的快速酶活检测方法一般是基于显色试剂与底物或产物反应, 通过颜色变化定性检测酶活或比色法定量检测酶活。这些快速方法的建立将有助于微生物酶源的快速筛选和基因改造的研究。

1.2.1 直接分光光度法

Tej Bhatnagar等[4]以A. niger水解对硝基苯基环氧乙烷 (pNSO) , 反应液经氯仿萃取, 直接在280nm处测定吸光值。与HPLC检测比较, 1.29个HPLC中的酶活单位相当于1个分光光度法中的酶活单位。该方法适用于对pNSO有高活力的酶, 可用于大量样品的酶活快速检测。但是适用范围窄, 只能用于一定波长处或范围内有高吸收值的环氧化物, 而且还需要底物和产物分离的步骤。

a.twostepmechanism[2];b.onestepmechanism[3].

1.2.2 4- (对硝基苄基) 吡啶 (NBP) 法

4- (对硝基苄基) 吡啶 (NBP) 能与烷基化物质如活性卤代化合物、环氧化合物等反应, 生成的中间体经碱化可产生紫色、蓝色或棕色芳甲烷类染料。Frank Zocher等[5]以NBP为显色剂, 建立了96孔板法和滤纸法, 对120株链霉菌 (Streptomyces) 的EH活力进行初筛, 快速得到了3株高活力的菌株。国内, 李从发等[6]以苯基环氧乙烷为模型化合物, 选择580nm为测量波长, 650nm为参比波长, 建立了定量检测含有细菌细胞等混浊体系中环氧化物的双波长微板法。该类方法可用于酶或细胞的酶活检测, 但不适用于以卤代环氧化物为底物的酶活检测。

1.2.3 NaIO4氧化法

NaIO4氧化法是利用NaIO4的强氧化性, 将酶水解生成的邻二醇氧化成醛或酮, 通过一定方法检测醛、酮的量或NaIO4的消耗量, 从而检测EH的活力。该类方法是通过酶解和化学氧化相结合的机制而建立, 而且检测的是产物, 降低了假阳性现象, 具有检测方便快速、应用潜力大的优点。

Fabrizio Badalassi等[7]以潜荧光的环氧化物为底物, 经酶水解拆分、NaIO4氧化、β-消除反应后, 释放荧光物质7-羟基香豆素, 筛选EH活力 (图2) 。该方法以特定的环氧化物为底物, 因此, 检测到有活力的EH并不一定对特定的底物有拆分活力。

Cesar Mateo等[8]利用NaIO4氧化苯乙烯类环氧化物水解生成的二醇, 最后在290nm测定吸光值。由于水解和氧化是同时进行的, 通过在线检测吸光值的变化, 还可测定酶的动力学参数。但只适用于以芳香类环氧化物为底物的酶活力快速检测。

F.Cedrone等[9]使用NaIO4氧化经EH水解生成的二醇, 以肾上腺素反滴定剩余的NaIO4, 无色的肾上腺素被氧化成深红色的肾上腺素红, 在490nm测定吸光值, 从而确定酶活力, 建立了用于纯酶反应的筛选系统。Daniel Kahakeaw等[10]还建立了用于全细胞反应的高通量筛选系统。该方法被认为是最具潜力的方法。

1.2.4 其它方法

Bert van Loo等[11]以番红O为指示剂, 以1, 2-环氧丁烷为底物, 在琼脂平板上对定向进化的菌株EH活力进行筛选, 有活力的菌株会呈现均匀的粉红色, 无活力的菌株会出现一个无色的外圈。

2 微生物EH的基因工程研究

近年来, 人们已从自然界筛选得到了多种产EH的微生物, 但是往往存在产酶活力低, 对映体选择性不高等问题。虽然一些EH已被分离纯化并用于不对称水解反应, 但是分离纯化的过程易导致酶活的损失而且费时。因此, 人们把目光投向了如何获得高对映体选择性的EH和高产EH的菌株。

随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步, 快速获得新的EH基因已成为可能, 且来源于真菌A. niger和细菌A. radiobacter AD1的EH分子的微观结构已通过X射线分析, 为酶的基因工程研究提供了条件。

研究表明, 通过基因克隆表达和分子改造的方法可以提高酶活力和对映体选择性, 提高其不对称拆分环氧化物的能力。而且近来的研究也主要集中在如何提高酶活力和对映体选择性。

2.1 微生物EH基因的克隆表达

目前为止, 已有多种来自真菌和细菌的EH基因被克隆, 并在不同的宿主中表达 (大肠杆菌、毕赤酵母、耶氏酵母等) , 获得产酶活力有提高的基因工程菌, 为EH的分子改造奠定了基础。

基因克隆采用的技术手段主要是有反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 和聚合酶链式反应 (PCR) 。来源于Rhodotorula glutinis的EH基因通过RT-PCR被克隆到不同的宿主中表达, 以毕赤酵母和大肠杆菌作为宿主, 酶活力均有所提高, 其中E. coli Rosetta为宿主时, 酶活力提高了66倍。以毕赤酵母为宿主, 在含2.5%水的正己烷中拆分20mmol/L环氧氯丙烷, 60min后ee值可达99%, 收率为28.5%, 与已报道的黑曲霉在环己烷中拆分60mmol/L环氧氯丙烷16h, ee值达到99%, 收率为20%相比, 收率和反应时间均有改进[12,13]。Michel Labuschagne等[14]通过RT-PCR获得编码Rhodotorula mucilaginosa EH的cDNA, 在毕赤酵母中表达, 其水解2, 3-环氧丙基苯的活力和选择性都要远远高于野生型菌株。Zhiqiang Liu等[15]在克隆Rhodococcus opacus EH基因时, 首先分离纯化了酶蛋白, 测定氨基酸序列, 然后根据序列信息设计引物, PCR获得酶的基因, 在大肠杆菌中表达, 活力可达到10U/mg。

2.2 微生物EH的分子改造

基因克隆表达技术提高了微生物EH不对称拆分环氧化物的活力, 但在提高对映体选择性方面的作用不显著, 因此, 通过分子改造来提高其对映体选择性是十分必要的。微生物EH的分子改造采用的方法主要为定点突变和定向进化。

2.2.1 定点突变

定点突变通过突变引物的设计和聚合酶链式反应 (PCR) 向所需要改变的基因位点添加、删除或替换碱基, 具有突变效率高、可重复性好的特点。该技术已应用在EH的催化机理和蛋白结构分析过程中, 并被用于分析酶分子中特定位点的氨基酸, 研究该氨基酸对酶的对映体选择性和活性的影响, 有利于EH的定向改造。

Yanbin Liu等[16]将A.niger SQ-6 EH的343位Glu定点突变为Asp, 根据水解pNSO的动力学常数变化, 分析了343位Glu在水解中的功能并预测酶的活性位点为Asp191、His369和Glu343。A. radiobacter AD1 EH的215位Tyr被Phe取代后, 选择性水解苯基环氧乙烷, E值由16提高到了30[17]。位于亲核残基Asp附近的108位Phe突变对酶活力和对映体选择性的影响较大, 当被Cys取代时水解顺-2, 3-环氧丁烷生成 (2R, 3R) -2, 3-丁二醇的活力提高了6倍, 当被Ala取代时水解环氧环己烷生成 (1R, 2R) -1, 2-环己二醇的活力提高了150多倍[18]。因此, 在活性位点附近的单氨基酸取代能够改善酶的催化特性, 有利于生产手性环氧化物和手性二醇。

2.2.2 定向进化

与定点突变不同, 定向进化是以随机突变, 基因表达和高通量筛选对映体选择性突变株为基础的, 不需要事先了解酶的结构和作用机制信息, 通过体外模拟自然进化机制, 改造酶的基因[19]。在过去的十几年中, 定向进化已成为改进酶功能的重要方法, 并成功地应用于EH的改造。

定向进化有两个基本步骤:建立突变体库和高通量筛选有益的突变体。在EH改造中, 建立突变体库的方法主要为易错PCR、DNA改组及饱和突变。A. niger EH经过一轮易错PCR, 以苯基环氧丙基醚为底物, E值由原来的4.6 (ee 56%) 提高到10.8 (ee 74%) 。对映体选择性提高的突变酶存在着217位Ala被Val取代 (A217V) , 332位Lys被Glu取代 (K332E) 和390位Ala被Glu取代 (A390E) , 其中两种突变 (K332E和A390E) 是远离活性中心的[20]。A. radiobacter AD1 EH经过易错PCR和DNA改组, 不仅水解对硝基苯基环氧丙基醚 (pNPGE) 的对映体选择性提高了13倍, 而且水解环氧氯丙烷和1, 2-环氧己烷的对映体选择性也有大幅度提高[11]。2005年, Lingyun Rui等[21]使用DNA改组和饱和突变的方法改造A. radiobacter AD1 EH, 存在219位Ile被Phe取代 (I219F) 的突变酶水解苯基环氧乙烷的选择性提高了4倍, E值由17提高到了91, 酶活力也提高了1倍。DNA改组产生的190位Leu被Phe取代 (L190F) 的突变酶和饱和突变产生的190位Leu被Tyr取代 (L190Y) 的突变酶水解苯基环氧乙烷的活力也分别提高3.8倍和1.7倍。

2.3 问题与措施

2.3.1 问题

目前的研究虽然提高了酶活力和对映体选择性, 但是酶的其它特性还需要进一步改进, 如酶在有机溶剂中的稳定性, 对底物和产物的耐受性, 区域选择性等, 以符合工业化应用的需要。

定向进化过程中, 根据已报道的快速检测方法以及底物、产物的特性, 建立高通量的筛选系统是十分关键和必要的。

2.3.2 措施

定点突变能对特定的位点进行突变, 可以用于在EH分子中引入随机突变不易获得的关键性的残基或结构元素, 定向进化可以产生有利于提高EH催化特性的结构变化。两者的结合必将有助于进一步改善EH的催化特性, 提高其选择性水解的能力, 增加在工业生产中的应用。

基因克隆表达不仅可用于微生物来源的EH, 而且可用于动植物来源的EH, 拓宽酶的来源, 增加对动植物来源的EH催化特性的认识。随着一些生物的基因组序列测定, 通过分析基因组的序列信息挖掘新的EH基因并经克隆表达研究EH的特性, 也是获得新型EH的有效方法之一。

3 微生物EH的应用

EH早期的研究工作主要集中在哺乳动物细胞中的EH, 但是由于哺乳动物的酶量少, 来源有限, 制约了它的实际运用。随着微生物EH种类的增多, 其应用方面的研究也逐渐增多。许多学者使用高的底物浓度和不同的反应体系来扩大拆分外消旋环氧化物的规模。Justine Deregnaucourt等[22]使用A. niger EH拆分三氟甲基取代苯基环氧化物, 采用两相反应体系 (有机相-水相体积比为1:5) , 底物-酶的质量比为58, 底物浓度为360g/L (1.8mol/L) , 4h后ee值可达到99%。

微生物EH催化生成的有光学活性的环氧化物和二醇是有机合成的重要中间体。常用的催化方式主要有三种:第一, 采用单酶法。Daniel P. PienaarD等[23]利用Yarrowia lipolytica EH获得了许多手性的羟基化杂环类化合物, 如S-3-羟基四氢呋喃、S-N-苯基-3-羟基吡咯烷、S-N-苯基-3-乙酰氧基吡咯烷等, 它们是合成杂环类药物的重要前体物质。Xin Jia等[24]使用Sphingomonas sp. HXN-200 EH拆分3-氯乙烷、苯基环氧乙烷, 生成的S-3-氯苯基环氧乙烷可以进一步合成IGF-1R激酶抑制剂BMS-536924。这种拆分方式的不足在于产率不能超过50%。第二, 采用化学-酶法。Cleij等[25]利用A.niger EH拆分α-2-甲基-2-异丁基苯基环氧先得到S-环氧化物和R-二醇, R-二醇用化学方法可以重新环化为消旋的环氧化物, 然后继续拆分, 有效地提高了产率。S-环氧化合物开环后, 可进一步合成抗炎药物S-2-异丁基苯丙酸 (布洛芬) , 同时得到R-构型的二醇, 还可以环化为消旋的环氧化物, 然后继续拆分, 这样产物的循环利用有效地提高了产率。第三, 采用双酶法。Li Cao等[26]利用两种选择性互补的酶 (Solanum tuberosum EH和Agrobacterium radiobacter AD1 EH) 水解苯基环氧乙烷, 得到了R-1-苯基-1, 2-乙二醇, 外消旋的苯基环氧乙烷可达到完全转化。

4 展望

酪氨酸酶抑制剂的研究进展篇4

关键词：酪氨酸酶,抑制剂,植物来源,人工合成

酪氨酸酶 (Tyrosinase) , 又称多酚氧化酶, 是一种含铜金属酶, 广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中, 并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为, 羽毛, 毛发, 眼睛, 昆虫表皮, 种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素, 都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能, 是生物体内参与黑色素 (melanin) 合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段:远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化, 由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌;远端步骤包括化学反应和酶反应, 最终合成黑色素。

酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用, 因此, 可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。

酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛, 不仅有天然产物, 而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列, 这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。

1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂

众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示, 很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用, 并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。

1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂

多酚类化合物, 如单宁酸, 广泛的存在于自然界中, 与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂, 另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物, 如4’, 5, 7-三羟基黄酮、槲皮素、苦参酮、苦参碱F均在植物中被分离出来。Kubo等人详细研究了天然产物对酪氨酸酶抑制的构效关系。研究发现, 文献中所有的黄酮类化合物之所以能够作用酶的活性中心来抑制酶的活性, 原因是3位上自由羟基的存在。但是, 进一步的研究发现, 对于另一些不含3位羟基的黄酮类衍生物, 如4’-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮和7-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮, 仍然对酪氨酸酶具有抑制性。Badria和el Gayyar发现含α-酮基的黄酮类衍生物对酪氨酸酶也具有抑制效果, 原因可能是L-DOPA和含α-酮基的黄酮类衍生物具有相同的二羟苯基。上述的结果揭示了天然产物中新的酪氨酸酶抑制剂, 这些化合物会被进一步研究以便将来用于治疗色素沉着。另一类重要的多酚类化合物是没食子酸及其衍生物, 以D-葡萄糖多酯的结构出现, 并且这类化合物在食品工业上作为添加剂应用非常广泛。各种没食子酸衍生物从绿茶和五倍子中被分离出来, 并且其中的一些对酪氨酸酶抑制作用很强。研究发现, 没食子酸在3位和黄酮成酯后对于酪氨酸酶活性具有很大影响。有趣的是从五倍子中分离而得的1, 2, 3, 4, 6-五-没食子酰-β-D-葡萄糖 (PGG) 抑制酪氨酸酶的活力并没有因为被苯环上酯化、羟基化、甲基化而下降。

1.2 醛类及其他类别化合物

大量的醛类及其他类别化合物在高等植物中被分离。这些化合物, 诸如肉桂醛、2-烯醛类、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、茴香醛、枯茗醛、3, 4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸等均是酪氨酸酶抑制剂。醛基和巯基、氨基、羟基一样, 是一种具有生物活性的亲核基团, 因此能够和酶的伯氨基形成席夫碱反应。比较各种醛类及其结构类似物, 如肉桂酸、茴香酸、枯茗醛、枯茗酸、安息香酸对酪氨酸酶的抑制能力, 其中枯茗醛最强, 因为枯茗醛的醛基受到异丙基和甲氧基这两种供电子基团的诱导效应的影响容易在酶的活性部位形成比较稳定的席夫碱。如2-烯醛类化合物, 亲油性烷基链的长短对抑制性会产生影响。因为酪氨酸酶的活性中心是疏水性的“口袋”, 随着碳链增长, 分子的亲酯性提高, 因此与酶的结合力增强。Kubo等人研究发现, 除了2-羟基-4-甲氧基苯甲醛之外, 芳香类的醛是酪氨酸酶的非竞争性抑制剂。大部分的抑制研究是通过衡量酶的半抑制浓度 (IC50) 来确定的, 当然, IC50是一个重要的指标, 但是不是唯一的指标, 它仅在于描述二酚酶活性抑制上比较准确。因此, 研究更多的酪氨酸酶单酚酶和二酚酶抑制动力学参数必要的。

1.3 真菌来源酪氨酸酶抑制剂

除了来自于高等植物, 从真菌中也发现了很多酪氨酸酶抑制剂。M a d h o s i n g h和Sundberg从圆生蘑菇分离、纯化得到了两种酪氨酸酶抑制剂, 通过Lineweaver-Burk双倒数方程发现, 抑制剂Ia为竞争性抑制剂, 而另个抑制剂Ib为非竞争性抑制剂。从黑曲霉中分离得到的金属硫蛋白对酪氨酸酶活性中心的铜原子具有很强的螯合性, 因此对酪氨酸酶的抑制性非常强。分析其抑制机理, 可能为蛋白所带的巯基能够和醌发生亲核反应, 生成无色的硫醚。经体外研究发现, 从圆蘑菇中分离的蘑菇氨酸不仅是酪氨酸酶二酚酶的非竞争性抑制剂, 而且是单酚酶的竞争性抑制剂。

2 人工合成酪氨酸酶抑制剂

表2列出了各种通过人工合成而来的酪氨酸酶抑制剂。有一些市售药物也是酪氨酸酶抑制剂, 尽管它们的结构比较简单。

2.1 药物

抗高血压药卡托普利通过不可逆的非竞争性抑制单酚酶和竞争性的抑制二酚酶活性, 从而阻止了黑色素生成, 机理为生产的醌受到亲核进攻形成无色的产物]。对单酚酶和二酚酶的抑制为正协同性。该药会和酶形成卡托普利-铜复合物以及能够与活性部位的半胱氨酸残基形成二硫键。抗甲状腺药物甲硫咪唑对单、二酚酶均有抑制作用。和卡托普利相比较, 和酶的作用机制类似, 但是抑制类型却不同。

2.2 合成化合物

很多文献报导了诸多化合物, 如过氧化氢、羟胺、钛铁试剂和芳香族羧酸均是酪氨酸酶抑制剂。另外一些文献报导了抑制剂与酶是慢结合型抑制机理。过氧化氢抑制酪氨酸酶可以分两个阶段, 并且第一阶段相对第二阶段迅速。酶的抑制程度大小取决于过氧化氢浓度及其环境的p H, 并且在限氧条件下抑制速度比供氧条件下要快。铜螯合剂 (如环庚三烯酚酮和叠氮钠) 和底物类似物 (如L-含羞草碱、L-苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、苯甲酸钠) 均能够阻止过氧化氢对酪氨酸酶的失活, 表明酶活性中心的铜原子对于失活至关重要。另一种酪氨酸酶抑制剂羟胺在低浓度 (33mmol/L) 时会缩短单酚酶的延滞时间, 而当浓度大于20mmol/L时, 羟胺将会抑制二酚酶酶活, 减少了黑色素的生成, 并且在限氧条件下的失活速率会加快, 原因为羟胺会和醌形成具有颜色的肟。羟胺和二酚酶作用导致了酶的抑制是由于有色产物引起的光谱变化和羟胺对酶的失活。在N-取代亚硝基胍类化合物中抑制能力最大的是N-环戊基-N-亚硝基胍, 其IC50值为0.6μmol/L, 去掉亚硝基或者羟基, 化合物对酪氨酸酶没有抑制性, 说明这两个官能团是影响酪氨酸酶活性的必须官能团, 作用机理可能为化合物对活性中心的铜原子有影响。与L-DOPA相比, 钛铁试剂是一种弱的还原剂, 当酪氨酸在羟基化时, 少量还原剂的存在能够促进反应, 钛铁试剂只延长反应的延滞时间, 而几乎不会影响L-DOPA的生成。然而, 钛铁试剂在较高浓度下还原性增加, 而延滞时间会缩短。

半胱氨酸和大量的芳香族羧酸是酪氨酸酶的抑制剂。通过抑制剂的本身属性和酶的测活途径来判断是竞争性、非竞争性、混合型、还是反竞争性类型。但是, 半胱氨酸和谷胱甘肽这类含巯基的化合物在较高浓度时, 氧气变得无关紧要, 都能够使酶失活。研究发现二甲硫醚是蘑菇酪氨酸酶的竞争性慢结合抑制剂, 是研究的第一个挥发性的酪氨酸酶抑制剂。二甲硫醚在植物组织中有一定的生理作用, 高浓度的二甲硫醚会抑制酪氨酸酶的表达, 因此可以抑制植物的褐变。

参考文献

[1]陈清西, 宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J], 厦门大学学报:自然科学版, 2006, 45 (5) :731-737.

[2]李韶勇, 孙命, 曲娜, 等.黑色素的合成及其常见抑制剂的作用机理, 天津师范大学学报[J], 2002, 22 (1) :17-21.

血管紧张素转化酶抑制剂研究进展篇5

关键词：血管紧张素转化酶抑制剂,作用,用途,不良反应

近年来, 各种治疗心血管疾病的药物不断问世, 血管紧张素转化酶抑制剂 (ACEI) 得到了广泛的应用, 现就该类药综述如下。

1 发展史

于1981年第一代ACEI卡托普利在美国上市。第2代ACEI依那普利是于1976年日本化学家发现的, 并于1984年在德国上市。相继第三代的ACEI赖诺普利于1987年在美国和新西兰上市[1]。

2 作用机制、结构特点及分类

肾素-血管紧张素-醛固酮系统 (RAS) 在高血压发生、发展中起着重要作用, 其中血管紧张素II (AngⅡ) 是主要的效应肽。ACEI阻止血管紧张素I转换为血管紧张素II, 不灭活缓激肽, 产生降压作用。作用机理如下:抑制循环中RAS;抑制组织中的RAS;降低交感神经兴奋性, 减少神经末梢去甲肾上腺素释放;减少内皮细胞形成内皮素;增加扩血管的缓激肽和前列腺素的量;醛固酮分泌减少, 以减少水钠潴留[2]。ACEI按其对ACE活性配基锌离子作用特性的不同分为三类[3]:含有巯基的卡托普利等;含有羧基的依那普利等;含有磷酸基的福辛普利等。

3 药理作用与临床应用

3.1 降压作用

应用ACEI使Ang I转变成Ang II受阻, 降低血浆中Ang II的浓度, Ang II还可以使体内醛固酮分泌减少, 从而使血管舒张, 血压下降;降低Ang II的水平, 同时还可以降低交感神经兴奋性, 使去甲肾上腺素的合成与释放减少, 使血管舒张, 血压下降;ACEI还可以抑制缓激肽的降解, 使体内缓激肽的量增大, 血管舒张, 血压下降。

ACEI在临床试验中作为单药治疗, 其降低血压的效应相当于利尿药和β受体阻断药。单药治疗大约60%~70%患者都有效。大多数1小时内出现降压效应。ACEI也可和钙通道阻滞药合用增加效应。该类药尤其适用于伴有心力衰竭、急性心梗、左心室肥厚的高血压患者。该类药与利尿药及β受体阻断药合用于重症或顽固性高血压疗效较好[4]。

3.2 改善心功能

Ang II及醛固酮是促进心肌细胞增生、胶原蛋白增加、心肌间质纤维化, 导致心肌及血管重构的主要因素[5]。小剂量的ACEI可减少Ang II及醛固酮的生成, 因此能预防和逆转心血管重构, 改善心功能。ACEI可抑制体循环及局部组织中Ang I向Ang II的转化, 使血液及组织中Ang II含量降低, 从而减弱了Ang II的收缩血管作用, ACEI还能抑制缓激肽的降解, 使血中缓激肽的量增多, 从而使血管扩张, 减轻心脏负荷, 降低心肌耗氧量。ACEI可用于治疗轻、中、重度心力衰竭, 是目前常用的抗慢性心功能不全药。

3.3 抗心律失常

研究表明ACEI可使心梗、心功能不全患者心房颤动的发生率降低, 预防心房颤动的发生, 减少致命性心律失常引起的猝死[6]。

3.4 保护肾脏

ACEI的肾脏保护功能的主要机制是通过影响肾小管间质和抑制肾小球高压与肥大, 改善肾小球滤过和减少蛋白质的排泄量[7]。ACEI可以减缓血压正常或伴有高血压的Ⅰ型糖尿病患者的肾病进程。ACEI能有效的治疗糖尿病伴有的高血压、心衰、动脉粥样硬化, 显著降低冠心病的发病率与死亡率。

3.5 抗动脉粥样硬化

引起动脉粥样硬化 (SA) 的主要原因是血管内皮损伤, 血管内皮受损时, 成纤维细胞生长因子释放增多, 而且Ang II促进血小板释放血小板生长因子, 从而刺激血管平滑肌细胞增生。由于ACEI抑制ACE减少Ang II的生成, 从而产生抗动脉粥样硬化的作用[8]。有人在高血脂的兔子和猴身上证实了卡托普利的抗SA作用。

3.6 抗肿瘤

通过实验观察, ACEI可以抑制肿瘤细胞生长[9]。希望在不久的将来ACEI将作为抗肿瘤药物的新成员得到临床应用。

4 不良反应

ACEI较常见的不良反应为血管神经性水肿、刺激性干咳;皮疹、味觉异常;皮肤瘙痒;眩晕、头痛、倦怠;高钾血症、低血压;恶心、腹泻;中性粒细胞减少;蛋白尿、肾功能异常;致畸等[10]。其中发生率最高的是刺激性干咳和血管神经性水肿。

5 展望

目前, ACEI在高血压、心力衰竭、心梗、糖尿病等方面得到了广泛应用。期望在不久的将来, 除心血管疾病外, ACEI也能用于其他疾病的治疗, 如肿瘤、阿尔茨海默病等。

参考文献

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[9]相同玲.血管紧张素转换酶抑制剂抗肿瘤作用的研究进展[J].中国医师进修杂志, 2010, 33 (10) :74-76.

环氧酶抑制剂篇6

1 治疗高血压

1.1 ACEI作用机制

通过竞争性抑制血管紧张素转化酶 (ACE) 而发挥作用。其降压作用主要通过抑制ACE, 阻止血液及组织液中血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 的形成而实现。AngⅡ是体内最强的缩血管物质, 且能促进醛固酮分泌, 导致水、钠潴留及促进细胞肥大、增生, 与高血压及心肌肥厚等疾病的形成具有密切的关系。本品的降压作用尚与下列因素有关: (1) 抑制激肽酶Ⅱ, 减少缓激肽的降解[1], 延长缓激肽的扩血管作用; (2) 增加前列腺素的释放; (3) 直接抑制AngⅡ增加血管对神经兴奋所致收缩反应的作用; (4) 大剂量时可抑制突触前膜去甲肾上腺素的释放[2]; (5) 减少内皮细胞形成内皮素。

1.2 适应证

本品用于轻、中、重度高血压病、顽固性高血压、肾血管性高血压、糖尿病性高血压、慢性肾衰所致高血压。ACEI具有改善胰岛素抵抗和减少蛋白尿的作用, 特别适用于伴有心力衰竭、心肌梗死、糖耐量减低或糖尿病肾病的高血压患者[3]。ACEI用药后外周血管扩张, 总外周阻力降低, 血压下降, 在降压同时不减少心、脑、肾等重要器官的血流量, 不干扰交感神经反射功能, 不引起体位性低血压, 对高肾素及正常肾素高血压的降压效果显著, 对低肾素高血压也有降压效果。因疗效显著, 适用范围广, 现为高血压病治疗中的首选药物。

1.3 临床应用

该类药物均需从小剂量开始, 逐渐增加剂量至最佳有效量, 对存在肾动脉粥样硬化的老年患者更应如此, 以免降压过度。本类药物《国家基本药物目录》 (2012版) 收载了卡托普利和依那普利。卡托普利开始治疗量为12.5 mg, 2~3次/d, 按需要剂量可于1~2周增加到50 mg, 2~3次/d, 若疗效仍不满意, 应及时联用其他降压药物;依那普利开始应用量为5 mg, 1次/d, 若血压达不到正常, 可将剂量增至10 mg, 1次/d。在服药3周后才可增加剂量, 维持量一般为10 mg/d, 最大剂量为40 mg/d。单药治疗大约60%~70%高血压患者有效[4]。大多1 h内出现降压效应。

1.4 联合用药

该类药物的联合首选小剂量的利尿剂, 如噻嗪类利尿剂, 可起到协同作用, 减少ACEI引起的钠潴留;ACEI也抵消了噻嗪类的副作用, 如利尿剂加强组织中的肾素活性, 而ACEI对高肾素型患者效果更佳;此外利尿剂可使血液中AngⅡ增高, 而ACEI阻止AngⅡ生成;再次噻嗪类利尿剂所致的低血钾可被ACEI升高血钾的作用所对抗。以上联合降压效果仍不满意, 可再加用钙通道阻滞剂的三联用药;如效果仍差, 心率快者加用β-受体阻滞剂、心率慢者加用α-受体阻滞剂的四联疗法。

2 治疗慢性心力衰竭

2.1 作用机制

目前已公认ACEI为治疗CHF的基本药物, 其作用机制从以下几个方面阐明: (1) 抑制肾素血管紧张素系统 (RAS) , 除对循环RAS的抑制, 可达到扩张血管、抑制交感神经兴奋性的作用, 更重要的是对心脏组织中的RAS的抑制, 在改善和延缓心室重塑中起关键作用。 (2) 抑制缓激肽的降解, 可使具有血管扩张作用的前列腺素生成增多, 同时也可抗组织增生的作用。总之, ACEI除发挥扩血管作用改善心力衰竭时的血流动力学, 减轻淤血症状外, 更重要的是降低心力衰竭患者代偿性神经-体液的不利影响, 限制心肌、小血管的重塑, 以达到维护心肌的功能, 推迟心力衰竭的进展, 降低远期死亡率的目的[5]。

2.2 适应证

临床应用于各期及轻、中、重度心力衰竭[6]。近年来国外已有不少大规模临床试验均证明即使是重度心力衰竭应用ACEI可以明显改善远期预后降低死亡率。提早对心力衰竭进行治疗, 从心脏尚处于代偿期而无明显症状时, 即开始给予ACEI的干预治疗是心力衰竭方面的重要进展。

2.3 临床应用

与治疗高血压相似, 也应从小剂量开始, 对近期使用大剂量利尿剂, 处于低钠/低血容量, 血压正常或偏低的患者, 初始剂量减半。

2.4 联合用药

ACEI在治疗CHF时常用的联合方案有: (1) ACEI+利尿剂; (2) ACEI+β-受体阻滞剂; (3) ACEI+地高辛; (4) ACEI+地高辛+利尿剂。

3 防治冠心病

3.1 预防硝酸酯类药物的耐药性

现已证实, ACEI与硝酸酯类药物合用可以减轻或避免耐药性的发生, 有间接较长期抗心绞痛的作用。

3.2 预防心肌梗死后的左心室重构

急性心肌梗死 (AMI) 后左室壁变薄, 心腔扩张, 非梗死区心肌肥厚, 造成左室容积增大, 左室变形, 此变形处心肌纤维排列异常, 破坏了收缩功能而导致泵衰竭。这种进行性左室扩大及变形, 称为左室重构。ACEI能抑制肾素及AngⅡ的活性, 扩张血管, 降低梗死区室壁的张力和室壁膨胀的程度, 从而减轻重构过程中的心肌肥厚而改善血流动力学。若长期应用可减轻心室收缩期与舒张期的负荷, 预防左室舒张末期容积的扩大和收缩功能障碍。

3.3 降低AMI的早期病死率

由于ACEI能阻抑AMI后左室的发生与发展, 减少室颤发生。AMI后患者的远期生存率, 是临床医生最关心的问题, AMI的二级预防是近20年来治疗方面的重大进展, 一些实施良好、大规模、协作性、随机化对照临床试验之后, ACEI已为临床普遍接受。目前ACEI已经是AMI (尤其是伴高危因素患者) 公认的急性期治疗和二级预防的重要措施之一。

3.4 预防动脉粥样硬化

ACEI通过改善血管内皮功能, 增加纤维蛋白溶解, 防止LDL-C的氧化修饰等作用机制在延缓动脉粥样硬化进展方面发挥着重要作用。开始卡托普利25 mg, 3次/d, 渐增至50 mg, 2次/d, 最大剂量450 mg/d[7];依那普利开始5~10 mg, 1次/d, 最大剂量40 mg/d。

4 治疗肾小球疾病

ACEI治疗肾小球疾病主要是减少蛋白尿和延缓肾损害的进展[8]。

4.1 减少蛋白尿的机制

(1) 改善肾小球内高压、高灌注及高滤过 (简称三高) [9]; (2) 改善肾小球滤过膜选择通透性。糖尿病高血压患者, 从尿白蛋白排泄率增高开始即应用ACEI, 蛋白尿较重时ACEI降尿蛋白的效果更好, 可减少尿蛋白30%~50%。

4.2 延缓肾损害进展的机制

(1) 改善肾小球三高; (2) 改善肾小球滤过膜选择通透性; (3) 减少肾脏细胞外基质蓄积 (减少产生, 促进降解) , 拮抗肾小球硬化及肾间质纤维化, 其疗效已被许多临床循证医学实验所验证。

4.3 使用中注意事项

为有效减少蛋白尿及延缓肾损害进展, 在应用ACEI时应做到: (1) ACEI常用较大剂量 (比降压药量大) ; (2) 应用ACEI时间要久 (常需数年) ; (3) 应限制食物中蛋白及食盐的摄入量。ACEI减少蛋白尿和延缓肾损害进展的治疗作用, 对有、无高血压的肾脏病患者同样适用。

4.4 ACEI的应用

使用ACEI越早, 用药时间越长, 疗效越明显。依那普利在无全身性高血压患者, 10 mg, 1次/d, 逐渐增加剂量至20 mg可能疗效会更好一些。在SCr>350μmol/L者, 应否使用仍有争论, 如使用, 则在治疗初期2个月内, 每2周观察SCr水平, 如较基础水平升高超过30%, 应停药。

5 ACEI副作用

常见的副作用有: (1) 咳嗽; (2) 血清肌酐 (SCr) 增高; (3) 血钾升高; (4) 过敏反应:血管神经性水肿、皮疹; (5) 血象异常:白细胞减少。

5.1 咳嗽

可能与激肽酶被抑制相关, 血中缓激肽及前列腺素浓度增高可引起咳嗽。严重者应停用ACEI, 改用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 (ARB) 。

5.2 SCr增高

(1) 用药头2个月SCr可轻度上升 (升幅<30%) , 为正常反应, 勿停药; (2) 如果用药过程中SCr上升过高 (升幅>30%~50%) 则为异常反应, 提示肾缺血, 此时应停用ACEI, 并努力寻找肾缺血病因设法解除; (3) 若肾缺血被纠正且SCr恢复至正常, 则可再用ACEI, 否则不宜再用。

5.3 血钾升高

(1) 与醛固酮被抑制相关, 肾功能不全时尤易发生; (2) 血钾过高应停服ACEI, 并按高血钾症处理原则及时治疗。

5.4 过敏反应

常见皮疹, 可能伴瘙痒和发热, 发生于治疗的4周内减量或停药, 或给抗组胺药后消失。

5.5 血象异常

白细胞与粒细胞减少, 与剂量相关, 治疗开始后3~12周出现, 以10~30 d最显著, 停药后持续2周。

综上所述, ACEI临床广泛应用抗高血压的治疗, 并能对心、脑、肾起到较好的保护作用, 使心血管事件的发生率、死亡率的危险性显著降低。近年来, 此类药物品种和临床应用等方面的发展都非常迅速, 在冠心病、慢性心衰及肾病 (尤其在糖尿病肾病方面) 等疾病的治疗中发挥重要作用。随着对ACEI的药理作用、临床应用的进一步研究和明确, 其必将应用于更多的领域。

参考文献

[1]王红勤, 杨剑弘, 李志鹏.抗高血压药物的研究进展[J].疾病监测与控制杂志, 2013, 7 (1) :35.

[2]赖智慧.以肾素-血管紧张素系统为靶标的抗高血压药物研究进展[J].赣南医学院学报, 2013, 33 (4) :642.

[3]刘树民, 董爱青.糖尿病患者的合理用药[J].中国医学创新, 2010, 7 (28) :139.

[4]朱明燕, 柳景景, 石雷.血管紧张素转换酶抑制剂研究进展与临床应用[J].中国医药导报, 2011, 8 (1) :9.

[5]叶任高, 陆再英.内科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社, 2006:171.

[6]彭晓红.药物治疗慢性心力衰竭[J].中国伤残医学, 2013, 21 (10) :444.

[7]陈新谦, 金有豫, 汤光.新编药物学[M].第17版.北京:人民卫生出版社, 2011:406.

[8]陈灏珠, 林果为.实用内科学[M].第13版.北京:人民卫生出版社, 2009:1538.

美找出新的丝氨酸水解酶抑制剂篇7

以前的研究已证实, 阻止丝氨酸水解酶的化学物可“化身为”药物治疗肥胖、糖尿病以及阿茨海默病, 并正在测试这种药物在治疗疼痛、焦虑和抑郁方面的效果。人体细胞中有200多种丝氨酸水解酶, 其中一些丝氨酸水解酶还没有找到抑制其活动的抑制剂, 新研究扩展了可使用的抑制剂范围。

斯克利普斯研究所化学生理学系主任本杰明·卡拉瓦特领导的研究团队, 在以前研究的基础上调查了一群名为尿素塑料、能抑制丝氨酸水解酶活动的分子。实验刚开始, 他们使用最新技术测量了这种分子抑制丝氨酸水解酶的强度和专一性, 结果发现, 1, 2, 3-三唑尿素塑料能强力地抑制很多丝氨酸水解酶的活动, 同时也不会影响其他酶的活动。

卡拉瓦特团队接着合成出了1, 2, 3-三唑尿素塑料的基本结构, 结果发现, 与现有抑制剂相比, 该基本结构能抑制更多丝氨酸水解酶的活动。科学家们通过简单的“点击化学” (斯克利普斯研究所的化学家巴里·夏普莱斯于2001年引入的一个合成概念, 通过小单元的拼接来快速可靠地合成出形形色色的分子) 制造出了20种化合物, 他们发现, 其中3种化合物对很多丝氨酸水解酶具有强大的抑制效果。随后, 科学家们通过两个化学步骤对该基本结构进行了修改, 让其只抑制特定的丝氨酸水解酶。其中一种抑制剂AA74-1能有效地抑制酰基缩氨酸水解酶 (APEH) 的活动, 而不会明显地影响其他酶。科学家还借用抑制剂AA74-1, 研究了APEH对蛋白质的化学修饰作用, 实验结果显示, 当APEH被抑制时, 超过20种蛋白质的浓度会显著下降。

卡拉瓦特实验室现正在使用他们制造出的抑制剂来研究丝氨酸水解酶是否具有以前不知道或不确定的生物功能。卡拉瓦特表示, 我们正使用这项技术系统化地生成很多这类抑制剂化合物, 作为厘清丝氨酸水解酶在健康和疾病方面作用的基本工具, 研制出更多有用的药物。

环氧酶抑制剂篇8

1 HMG-Co A还原酶抑制剂 (他汀类药物) 的分类

常用的他汀类药物有:第1代由霉菌合成或转化, 从培养液中分离提取, 包括美伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等;第2代是由人工合成, 结构中有含氮杂环和氟苯环的, 包括阿托伐他汀、氟伐他汀和西立伐他汀等[3]。

2 HMG-Co A还原酶抑制剂 (他汀类药物) 的结构

他汀类药物的化学结构包含三部分: (1) 药效团3, 5-二羟基羧酸, 该基团与HMG-Co A还原酶底物HMG-Co A类似, 在辛伐他汀和洛伐他汀结构中, 3, 5-二羟基羧酸的5位羟基有时会与羧基形成内脂, 体外无HMG-Co A还原酶抑制作用, 给药后通过在体内发生开环反应转化为有效的羟基酸才表现出活性。普伐他汀是在洛伐他汀基础上将内脂环开环成3, 5-二羟基戊酸与钠成盐。 (2) 疏水性环状结构, 该结构与药效团以共价键相连接的, 它在抑制剂与还原酶的结合中起着重要作用;三是取代基, 该基团连接在疏水性环状结构上, 取代基决定药动学性质和抑制剂的水溶性[3]。氟伐他汀用吲哚环代替洛伐他汀分子中的双环, 阿托伐他汀用吡咯环代替洛伐他汀分子中的双环, 与第1代他丁类相比, 第2代具有水溶性大、脂溶性低、血浆半衰期短、口服吸收迅速完全等特点[4]。

3 HMG-Co A还原酶抑制剂 (他汀类药物) 降脂作用机制

抑制HMG-Co A还原酶, 胆固醇合成降低, 进而反馈性增强细胞表面低密度脂蛋白 (LDL) 受体的表达, 增加细胞LDL受体数目与活性, 降低血液中极低密度脂蛋白 (VLDL) 、中密度脂蛋白 (IDL) 和LDL的含量。此外, 它还可抑制肝内VLDL的合成, 可明显降低总胆固醇 (TC) , 同时也可升高高密度脂蛋白 (HDL) 和降低三酰甘油 (TG) 。

4 HMG-Co A还原酶抑制剂 (他汀类药物) 的多效性研究

他汀类药具有强大的降血脂作用, 一般可使低密度脂蛋白减少35%~45%, 血浆总胆固醇减少30%~40%, 三酰甘油中等程度下降, 还可以增加高密度脂蛋白的作用[5,6]。他汀类药物的多效性除了降脂作用外还有稳定粥样斑块、抑制血小板聚集和血栓形成、抗炎抗氧化、改善内皮功能、免疫调节、神经保护、降低痴呆风险和骨折的发生率等作用。

4.1 延缓动脉粥样硬化过程

动脉粥样硬化形成的主要原因是胆固醇含量增高, 他汀类药物治疗不仅降低血液中胆固醇含量, 也改变了动脉粥样硬化斑块中脂质的成分和含量。他汀类药物可以改善血管内皮细胞功能来阻断斑块形成的起始环节, 他汀类可通过调节平滑肌细胞增殖和凋亡的方式抑制动脉粥样硬化的发展、维持粥样斑块的稳定性, 减少冠脉事件的发生。

4.2 抗高血压

他汀类药物对血压正常者降压作用则不明显, 对高血压患者具有轻度的降压作用;降压药物与他汀类有协同作用, 在降低胆固醇的同时能改善周围动脉的血液流动, 具扩张血管的作用, 从而降低动脉收缩压及脉压差[1、8]。

4.3 对肾脏的保护作用

他汀类药物对糖尿病肾病 (DN) 和非DN患者均有保护肾脏得作用。DN患者血清TC及LDLC含量的增高, 常伴有脂代谢异常。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂可以降低糖尿病肾病患者的血脂含量, 减慢肾小球滤过率的下降, 推迟肾功能不全的发展[9]。另外, 他汀类药物还可通过改善内皮功能, 进而影响尿蛋白的代谢。

4.4 在防治痴呆中的作用

HMG-Co A还原酶抑制剂具有降低阿尔茨海默病 (AD) 及其他痴呆症风险系数的功效。通过抑制甲羟戊酸的合成减少了Apo E的分泌, 从而阻止老年斑形成, 改善患者的认知功能。

4.5 对肿瘤疾病的作用

他汀类药物对多种肿瘤细胞有诱导分化或凋亡、降低侵袭转移能力、抑制增殖、抑制血管增生等作用。有研究者提出, 抗肿瘤治疗中他汀类药物与环氧化酶-2抑制剂有协同作用, 同时降低不良反应的发生率[11]。研究显示, 他汀类药物可减少结肠癌的发病率50%, 乳腺癌等恶性肿瘤的发病率也被明显的降低[12]。

另外, 他汀类药物同样具有激活成骨细胞, 促进骨合成代谢作用, 并且不同浓度剂量对骨合成代谢作用也不同。

5 他汀类药物不良反应[13]

5.1 一般不良反应

他汀类药物耐受性好, 一般不良反应消化系统反应如恶心、腹泻或便秘等, 神经系统症状如头昏等, 皮肤反应皮疹等。这些反应一般并不严重, 随着用药时间的延长可能减轻或消失, 个别需要对症治疗或调整药物。

5.2 肌毒性

肌毒性是他汀类药物引起的最显著最普遍的不良反应。通常包括横纹肌溶解、肌痛、肌炎。横纹肌溶解症是最罕见最严重的肌病, 大概106他汀类药物服用者中有1.5人出现这种情况[13]。

5.3 神经毒性

长期使用他汀类药物可能会引发一系列神经类症状:认知能力障碍, 健忘, 记忆丧失, 自杀冲动, 多动神经症以及攻击行为。在临床出现上述症状时, 应立即停药。这些症状是可逆的, 若再次使用他汀类药物就会复发, 这可能与他汀类药物导致的认知能力下降有关[14]。