基因转染

关键词： 大鼠

基因转染（精选八篇）

基因转染 篇1

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

p DC316-m CMV-EGFP-Cadherin11重组腺病毒由本实验室制备( Gen Bank序列号: NM_001797. 2) ; 优等胎牛血清( Hyclone公司) ; 高糖型DMEM培养基、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、胰蛋白酶、茜素红染液、氯化十六烷基吡啶( Sigma公司 ) ; BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、兔抗鼠原钙黏附蛋白11抗体( 北京博奥森生物技术有限公司) ; 波形丝蛋白、角蛋白单抗( 北京中山生物) 。Transwell小室( Corning, 美国) ; 倒置式生物显微镜、正置光学显微镜( Olympus公司,日本) ; 可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) 。

1.2方法

1. 2. 1大鼠牙髓细胞的分离培养及鉴定脱颈处死2月龄wistar大鼠,取出切牙牙髓,剪除根尖1 /3部分, 采用组织块法进行原代和传代培养。收集第3 ~ 5代牙髓细胞行波形丝蛋白、角蛋白单抗染色; 取第3 ~ 5代牙髓细胞进行后续实验。

1. 2. 2实验分组1经p DC316-m CMV-EGFP-Cad-herin11重组腺病毒感染的实验组; 2经空载体腺病毒感染的阴性对照组; 3未经腺病毒感染的正常细胞为空白对照组。

1. 2. 3免疫组织化学染色观察Cad-11蛋白表达转染病毒48 h后收集细胞样本,4% 多聚甲醛液固定48 h,常规石蜡包埋及切片,实验步骤按试剂盒说明书进行,Cad-11阳性染色为棕黄色[3,4]。

1. 2. 4迁移实验将病毒转染48 h后的各组细胞用无血清培养基制备成1. 5 × 106/ ml的牙髓细胞悬液。 8. 0 μm孔径的Transwell小室置24孔板中,上室分别加入200 μl各组牙髓细胞悬液,下室加入含10% 胎牛血清的培养液500 μl,标准条件下继续培养48 h。取出Transwell小室,用棉签轻轻擦去上室内的细胞,剪下基底膜,4% 甲醛固定10 min,苏木精染色,下室面朝上平铺于载玻片上,光镜下观察、照相。随机选取5个视野( 400 × ) 计数细胞个数,取其平均值,进行统计学分析。每组3孔,实验重复3次。

1. 2. 5茜素红矿化染色及定量3组细胞用条件培养液( 含50 mg /L抗坏血酸、10- 7mol / L地塞米松、10 mmol / L β-甘油磷酸钠、100 ml / L胎牛血清的高糖型DMEM培养液) 标准条件下培养21 d,进行茜素红染色,镜下采集图片。10% 氯化十六烷基吡啶孵育1 h, 释放已附着于矿化结节的茜素红,分光光度计测定562 nm波长的吸光度值。每组3孔,实验重复3次。

1. 2. 6 ALP染色取上述矿化诱导液培养14 d的各组细胞,按BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书进行ALP染色,倒置显微镜下拍照观察染色情况。 每组3孔,实验重复3次。采用Image-Pro Plus软件测定图像中的阳性染色面积,表示为阳性染色面积与总面积百分比,进行半定量分析。

1. 2. 7黏附实验检测Cad-11对牙髓细胞黏附的影响

以1 × 105/ ml,每孔0. 5 ml的牙髓细胞接种于24孔培养板中,每组3孔,标准条件下培养至细胞单层汇合不留空隙。倾去培养液,将预先准备的1 × 105/ ml 3组单细胞悬液以每孔1 ml加入24孔培养板内。分别静置30 min和60 min,小心吸取未结合的细胞悬液,在光镜下计数细胞,并计算黏附细胞数,黏附细胞数 = 总细胞数 - 未结合的细胞数。实验重复3次。

1.3统计学处理

数据以± s表示,采用SPSS 16. 0统计软件进行单因素方差分析,组间比较用LSD-t检验,显著性标准 α = 0. 05,以P < 0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2.1牙髓细胞鉴定结果

牙髓细胞波形丝蛋白染色阳性( 图1) ; 角蛋白染色阴性( 图2) ; 说明培养细胞为来源于中胚层的牙髓细胞。

图1 波形丝蛋白染色阳性 ( × 400) Fig 1 Positive staining of vimentin in rat dental pulp cells ( × 400)

图2 角蛋白染色阴性 ( × 400) Fig 2 Negative staining of keratin in rat dental pulp cells ( × 400)

2.2免疫组织化学染色观察Cad-11蛋白表达结果

Cad-11阳性染色为棕黄色,显微镜下见实验组中Cad-11蛋白阳性表达,广泛分布于细胞质和细胞膜, 而阴性对照组和空白对照组均呈阴性( 图3) 。提示Cad-11转染成功并高表达Cad-11蛋白。

2.3细胞迁移实验结果

牙髓细胞穿过迁移小室基底膜的细胞数实验组 ( 18. 20 ± 1. 61) 明显高于阴性对照组( 9. 87 ± 2. 10) 和空白对照组( 10. 93 ± 1. 94) ( 图4) ( P < 0. 05) ,后两者无明显差异。

2.4矿化染色和定量检测结果

各组镜下均可见大小不一、形态各异的红色钙化结节,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的矿化结节数目和面积明显增加 ( 图5) 。定量检测所得D562值,实验组( 0. 363 ± 0. 008) 明显高于阴性对照组 ( 0. 260 ± 0. 005) 及空白对照组( 0. 256 ± 0. 005) ( P < 0. 05) ,后两者无明显差异。

图4 各组大鼠牙髓细胞迁移细胞数的比较 ( × 400) Fig 4 Migrating of rat dental pulp cells in the groups ( × 400)

2.5ALP染色结果

镜下见阳性细胞胞质内有紫黑色沉淀,3组细胞着色程度深浅不一,实验组表现为强阳性,呈现紫黑色团块样( 图6) 。Image-Pro Plus软件测定阳性染色面积,实验组染色分布面积明显高于阴性对照组和空白对照组( P < 0. 01) ,后两者并无明显差异( 图7) 。

2.6黏附实验结果

在30 min和60 min时,实验组黏附细胞数均高于阴性对照组和空白对照组( 表1) ( P < 0. 05) ,后两者无明显差异。

3讨论

Cad-11是钙粘蛋白家族的一员,属Ⅱ型钙黏附蛋白家族,其实质为一种钙离子依赖性介导细胞 - 细胞间黏附的单链跨膜糖蛋白[5]。Cad-11在介导细胞黏附中发挥重要作用,在骨组织特别丰富,在骨组织分化早期高表达[6]。康夏等[7]通过抑制Cad-11的表达对间充质干细胞的成骨分化起负向调控的作用,表明其能调节间充质的成骨分化。Di Benedetto等[8]报道, Cad-11基因敲除后,小鼠颅骨骨密度降低,在新生鼠颅骨细胞体外培养中,Cad-11基因敲除突变细胞的钙化面积小于那些来自野生型细胞。这些研究均证实了Cad-11对成骨细胞的分化有调控作用,然而其在牙齿发育中的作用尚未有报道。黑伟红等[9]研究显示, Cad-11参与牙根的吸收过程,在根吸收过程中起调节作用。Wu等[2]研究显示,在大鼠牙髓组织基因芯片中,大鼠牙髓有Cad-11mRNA的表达,提示Cad-11可能参与大鼠牙齿的生长发育。本研究通过转染Cad-11进一步探讨其对大鼠牙髓细胞迁移能力及成牙本质分化能力等生理功能的调节作用,为Cad-11在牙髓再生中的研究提供一定的实验基础。

牙髓组织对于牙齿内环境的稳定有着决定性作用,同时也是牙齿长期保留必不可少的因素。牙髓组织也像其他结缔组织一样有着自我修复能力,牙髓组织中存在具有自我更新和多向分化潜能的牙髓干细胞[10],牙髓干细胞具有向成牙本质细胞分化以及形成牙本质的能力[11]。在受到伤害性刺激以后,这些间充质细胞迁移到相应的病变部位,发生增殖,并分化为成牙本质细胞从而形成修复性牙本质,参与牙髓组织修复再生过程[12]。本研究采用Transwell小室法研究Cad-11对体外培养大鼠牙髓细胞迁移活性的影响,结果表明Cad-11可有效诱导牙髓细胞迁移( P < 0. 05) 。

图5 各组大鼠牙髓细胞茜素红染色结果 ( A: × 100) Fig 5 Alizarin red staining of rat dental pulp cells in the groups ( A: × 100)

图6 各组大鼠牙髓细胞 ALP 染色结果 ( × 100) Fig 6 Alkali phosphatase staining of rat dental pulp cells in the groups ( × 100)

图7 ALP 阳性染色区域所占面积百分比( * P < 0. 01) Fig 7 Percentage of ALP-positive staining area( * P < 0. 01)

( ± s)(  s)(

注: 1 与阴性对照组和空白对照组相比,P < 0. 05

ALP是反映牙髓细胞生物学特性的关键酶,在牙的矿化过程中起着重要的作用,ALP活性增强,被认为是牙髓细胞向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志[13]。本实验选择了ALP活性这一指标来研究Cad-11转染对牙髓细胞生物学特征的影响,结果显示,转染Cad-11后,大鼠牙髓细胞ALP染色强度和染色面积明显高于对照组( P < 0. 01) ; 同时矿化诱导21 d后茜素红钙结节染色可见实验组比阴性对照组和空白对照组明显高阳性表达( P < 0. 05) 。提示大鼠牙髓细胞经Cad-11基因转染后,ALP表达量增加,细胞外基质发生钙化,说明Cad-11促进了大鼠牙髓细胞向成牙本质细胞分化。细胞间黏附在形态发生方面起着重要的作用,细胞间黏附是启动间充质细胞分化、细胞外基质沉积的重要程序[14]。本研究通过细胞与细胞间黏附实验显示,Cad-11可促进大鼠牙髓细胞向成牙本质分化过程中的黏附作用。

综上所述,Cad-11促进了大鼠牙髓细胞的迁移和成牙本质分化,但牙髓细胞的迁移和成牙本质细胞分化是一个复杂的过程,需要多种生长因子、细胞外基质以及细胞本身特性的综合作用。Cad-11在这个复杂的调控网中究竟起多大作用,具体机制如何,还有待继续深入研究。

摘要：目的:探讨腺病毒载体介导的Cadherin-11(Cad-11)基因转染对大鼠牙髓细胞迁移能力和成牙本质分化能力的影响。方法:原代培养大鼠牙髓细胞,并用pD C316-mC MV-EGFP-Cadherin11重组腺病毒进行转染。通过免疫组化法检测Cad-11蛋白表达,用ALP染色和茜素红钙结节染色及定量检测其成牙本质分化情况。黏附实验和迁移实验分别检测Cad-11对牙髓细胞黏附和迁移的影响。结果:免疫组化染色示Cad-11转染成功并高表达Cad-11蛋白。Cad-11在矿化诱导14 d时可增强大鼠牙髓细胞ALP表达,诱导21 d,形成钙化结节量增加(P<0.05),同时增加细胞的黏附性和迁移能力(P<0.05)。结论:Cad-11能促进大鼠牙髓细胞成牙本质分化能力,同时提高其迁移活性。

基因转染 篇2

目的:探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR4基因转染的`猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为心肌样细胞的可行性.方法:按照Nance方法培养BMSCs,转染带荧光的CXCR4基因,流式细胞仪检测转染后BMSCs的细胞周期,用5-氮胞苷(5-aza)诱导,并行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化鉴定.对照组为未转染CXCR4基因的BMSCs.结果:体外培养的原代BMSCs 10～14d达到融合,CXCR4基因转染后的BMSCs能成功表达CXCR4,转染前后细胞周期无明显改变.与对照组相同,经5-aza刺激后,部分BMSCs成梭形,结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化染色均为阳性.结论:CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,有分化成心肌样细胞的潜能.

作 者：陈中璞 李拥军 姚玉宇 蒋益波 钱琪 潘啸东 CHEN Zhong-pu LI Yong-jun YAO Yu-yu JIANG Yi-bo QIAN Qi PAN Xiao-dong 作者单位：陈中璞,蒋益波,钱琪,潘啸东,CHEN Zhong-pu,JIANG Yi-bo,QIAN Qi,PAN Xiao-dong(东南大学医学院,江苏,南京,210009)

李拥军,姚玉宇,LI Yong-jun,YAO Yu-yu(东南大学附属中大医院,心内科,江苏,南京,210009)

基因转染 篇3

RNA干扰 ( RNA interference,RNAi) 是一种使mRNA发生降解,导致基因表达沉默的新型基因阻断技术。运用RNAi技术抑制病毒增殖和感染已成为当前抗病毒研究领域的热点之一[1,2,3,4]。转染是实现RNAi的重要手段,转染载体在体内表达短发卡RNA (short hair RNA,shRNA) 能持久发挥其干扰作用。采用阳离子脂质体介导的质粒表达载体的转染,会因质粒和脂质体比例、转染时间等的条件不同而有所差异。因此,有必要对表达载体的转染条件进行优化,获得理想的干扰效果,以便客观真实地分析RNAi的作用。

前治疗生殖器疱疹主要使用广谱抗病毒药物,治疗的目的主要是缓解症状,缩短病程,减轻疼痛及防止继发感染等[7,8]。因此,利用RNAi手段研制新型的抗HSV - 2药物已成为当前的研究热点。UL27基因编码的包膜糖蛋白B (glycoprotein B,g B),是在感染细胞中含量最多的粘附性糖蛋白,对病毒穿入细胞、病毒复制以及在细胞间传播来说是必需的[9]。因此,以UL27靶基因构建的p GPU6 / GFP / Neo - shRNA为观察对象,研究优化质粒表达载体p GPU6 / GFP / Neo - UL27shRNA转染HEK293细胞的条件,可为进一步研究RNA干扰在HSV -2中治疗作用奠定基础。

Ⅱ型单纯疱疹病毒 (Herpes simplex virus type 2,HSV - 2)是生殖器疱疹 (Genitial Herpes,GH) 的主要病原体[5,6]。目

1 材料与方法

1. 1 主要试剂和材料

HEK293细胞由遵义医学院珠海校区实验室提供; 重组质粒p GPU6 /GFP/Neo - shRNA由本课题 组构建; 转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。

1. 2 HEK293 细胞的培养

HEK293细胞 ( Human Embryonic Kidney cells ) 采用含10% 小牛血清的DMEM完全培养液进行细胞培养,置于37℃ ,5% CO2培养箱培养,每2 ~ 3 d更换细胞培养液一次。

1. 3 质粒 DNA 的制备

真核质粒表达载体p GPU6 /GFP/Neo - shRNA已由本实验室构建。通过质 粒扩增、细菌 培养,采用碱裂 解法提取p GPU6 / GFP / Neo - shRNA表达载体。分光光度法测定质粒的纯度和浓度后,于 - 80℃保存备用。

1. 4 转染时间的优化

采用脂质体转染法将p GPU6 /GFP/Neo - shRNA表达载体导入HEK293细胞。选取对数生长期的HEK293细胞,转染前一天,在24孔细胞培养板里接种500μL的HEK293细胞 (1×105个细胞/m L),37℃ ,5% CO2培养箱中培养至单层细胞汇合度70% ~ 80% 。使用LipofectamineTM2000进行转染: 将0. 8μg质粒DNA和2. 0μL脂质体分别用50μL DMEM培养液稀释于两个1. 5 m L的EP管中,分别轻柔混合,室温静置10 min;将稀释好的质粒和脂质体轻轻混合后,于室温静置20 min; 转染前将细胞培养液更换为不含血清和双抗的DMEM,将DNA -脂质体复合物逐滴加入细胞孔中,边加边摇匀,37℃孵育8 h,更换成含10% 胎牛血清的培养液,转染后24 h、48 h和72 h,收集细胞,进行检测转染效率。

1. 5 转染效率的检测

根据荧光显微镜观察结果收集细胞,PBS冲洗细胞2次后,用PBS重悬。细胞计数,调整细胞至同一密度,在激发波长488 nm,发射波长525 nm的流式细胞仪上进行检测。检测到绿色荧光蛋白阳性细胞占总细胞的百分率,即为转染效率。转染效率 = 荧光细胞数量/细胞总数×100% 。

1. 6 质粒与脂质体比例的优化

取4个EP管中分别加入0. 2μg、0. 4μg、0. 8μg、1. 6μg的质粒,另外4个EP管中分别加入1μL、2μL、4μL、8μLLipofectamin2000试剂, 将各组质 粒分别与 不同浓度 的Lipofectamin2000试剂混合, 室温静置20 min, 形成质粒 /Lipofectamin2000复合物。弃去24孔细胞培养板内的培养基,用PBS洗一遍,将100μL质粒/Lipofectamin2000复合物加入细胞培养板中,细胞在37℃ ,5% CO2培养箱中温育8 h后,吸弃转染液,更换为含10% 小牛血清DMEM培养液,继续培养48 h后,收集细胞进行检测。

1. 7 转染复合物细胞毒性的测定

按1. 6中的步骤转染后,每孔加入100μL 5 mg/m L MTT溶液,37℃孵育4 h,终止培养,吸弃孔内培养上清液。每孔加1 m L DMSO,振荡10 min,让结晶物充分融解。每个孔溶液分成4份( 每份200μL) 加入96孔板,设复孔4个,同时设4个阴性对照孔和空白对照孔(正常细胞)。用空白对照孔调零,选择波长为490 nm,在酶联免疫检测仪上测定光吸收值(A)并记录。所有的转染实验均重复三次。细胞存活率计算公式如下:

细胞存活率(% ) = (A实验组- A空白组) /(A对照组- A空白组) ×100%

1. 8 统计学分析

SPSS 13. 0软件进行统计分析,所有数据采用均数±标准差(x±S)表示,多组间比较采用方差分析,两两组间比较采用LSD - t检验。

2 结 果

2. 1 最佳转染时间

结果显示: p GPU6/GFP/Neo - shRNA表达载体转染HEK293细胞转染48 h后,GFP的表达达到高峰。流式细胞仪测得转染后12 h、24 h、48 h含有荧光的细胞占细胞数的百分比分别为22. 5% 、37. 5% 、80% (见图1),可见转染48 h后,转染效率最好。

2. 2 最佳质粒与脂质体比例

用不同比例的质粒p GPU6 /GFP/Neo - shRNA与转染试剂Lipofetamine2000复合物转染HEK293细胞,流式细胞仪测得转染48 h后转染效率(图2),倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞情况(图3)。

由表1可看出: 当p GPU6 /GFP/Neo - shRNA量为0. 8μg,时,细胞存活率是95. 4% ±1. 6% ,符合实验的要求。因此,Lipofectamine2000的量为2μL时转染效率最高,含有荧光的细我们选择p GPU6 /GFP/Neo - shRNA量为0. 8μg、Lipofetamine胞占细胞数的百分比分别为80. 8% 。 (1) 当p GPU6 /GFP/Neo2000的量为2μL,作为下一步实验的最佳配比选择。

- shRNA量为0. 2μg、0. 4μg、1. 6μg时,转染效率最高分别

胞的转[J染]. 效Nu率cle比ic ApcG idPsU R6e /sG,F20P0/8N,e3o6 (-1 s4h)R: Ne8A6.为0. 2μg时提高,[但2]是当WaLngip QofZe,taLmvinYeH20,0D0 ia的o Y量, 为et a8l. μTLhe时 de,sigpn G oPfU v6e c/tGorFsP f/orNeRoNA-ishRNAde量live为ry 1sy. s6te mμ[gJ ]的. 转Cu染rr效Ph率arm(7D0es. ,62%0 0)8 比,1质4(粒13量): 103. 287μ- g1 3转40染.[效3]率 (H7a7f.n 9er% M ), 低L。and说tha明ler当L ,LiBpuorfgeetar mMin,e2e0t 0a0l . 的T量ran一scri定pto时me, -转wi染de效率并id不ent总ific是ati随on着of质RN粒A量- b的ind增ing加p而rote提in高an。d microRNA binding sites by

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3 讨 论

将siRNA表达载体导入哺乳动物细胞中是诱导RNAi发生的关键,有许多转染试剂可供选择,本实验中转染试剂选择外源基因载体的阳离子脂质体[10],主要原因有: (1) 实验使用的是HEK293细胞,脂质体容易被细胞膜利用而且制备比较简单; (2) 本实验构建的质粒大小为5117 bp,脂质体可可以运载质粒DNA及大小不同的基因片段,并可延缓基因的降解,抑制核酸酶作用; (3) 脂质体转染条件相对稳定,结果重复性比较高,操作时间短并且简单,尤其适用于体外转染。因此我们选用脂质体来介导p GPU6 /GFP/Neo - shRNA的真核表达载体转染293细胞。

在利用脂质体进行细胞转染的实验过程中,很多因素可能影响到转染的效率: 细胞的状态及密度、细胞的培养液、DNA质量、脂质体量和DNA量的比例等[11]。转染效率可通过测定细胞的密度,转染的时间和siRNA与转染试剂的比例来评价。在本实验中,采用p GPU6 /GFP/Neo - shRNA与脂质体转染试剂Lipofectamine2000的不同比例的复合物转染正常的293细胞,按照转染试剂Lipofectamine2000的说明书进行严格的条件控制,摸索出最高转染效率。

脂质体是目前比较常用的一种转染试剂,在实验中,在保证的转染效率比较高的同时又要保证细胞的存活率,这样才能保证目的基因的表达水平。另外,几乎所有的阳离子脂质体都[会6]对细M胞aka产rov生a一KS定,G的ris毒hin性N,V,在Sh高ab浓alin度a S时A,毒e性t a更l. 加A p明uta显tiv。e R因NA此 -,我们采in用terf eMreTnTce法- 对ba不sed同i比mm例un的e质sys粒tem p GinP Upr6o k/GarFyoPte/sN: eoc o-m psuhtRatNioAna/l脂质体an复aly合sis物of的the细p胞red毒icte性d进enz行ym初ati步c m的ac检hin测ery。fu同nc时tion我al们ana也log用ies这w个ith方法评eu价ka病ryo毒tic 感RN染Ai细,胞and后 h的ypo病the变tic效al 应me,ch常ani用sms的 o光f a学cti显on 微[J镜]. 观B察iolCPE的Di方rec法t,,20主06,观1性6(太1)强:7.,而且需要一定的经验,用MTT法检

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时,细胞存活率是95. 4% ±1. 6% ,符合实验的要求。因此,我们选择p GPU6 /GFP/Neo - shRNA量为0. 8μg、Lipofetamine2000的量为2μL,作为下一步实验的最佳配比选择。

摘要：旨在优化Lipofectamine2000试剂介导UL27基因重组质粒p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染HEK293细胞的条件,为研究UL27基因重组质粒对HSV-2的干扰作用奠定基础。用Lipofectamine2000试剂介导p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA重组质粒转染293细胞,采用流式细胞仪检测不同的转染时间下的转染效率,同时荧光显微镜和流式细胞仪检测不同比例条件下的转染效率,MTT法检测细胞的存活率。在质粒与转染试剂复合物的配比为0.8μg∶2μL,转染48 h,转染效率最高并且对细胞毒性最小。优化p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染293细胞的条件,提高了转染效率。

基因转染 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

h DAF基因重组质粒(以h DAFc DNA表示)由天津市泌尿外科研究所构建完成[6],抽提纯化后加入内切酶SacⅠ使其线性化,末端为黏性末端,工作液浓度为100mg/L;PAMAM-D(G5)由南开大学生物活性材料教育部重点实验室孔德领教授惠赠;SFM和SFM/BSA液的制备见参考文献[2](试剂均为Sigma公司产品);猪精液采自天津天泰公司猪场种猪,采精所用的公猪为1.0~1.5岁的长白杂交种,利用手握法采集含精子丰富的精液部分,距离实验时间不超过3 h,精液按照1︰10的比例稀释于37℃预热的SFM/BSA液中,保存于17℃;精子质量检测工作站为南京华贝电子医疗设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PAMAM-D/DNA复合物的制备

100μL SFM液中分别加入线状h DAF c DNA 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg,每组c DNA再按照氮磷比10︰1、20︰1及40︰1分别加入相应剂量PAMAM-D,轻轻混合后室温下孵育30 min,形成的各组复合物以G5/h DAF表示。

1.2.2 猪精子细胞对外源性DNA的摄取

检测猪精液密度与活力后,室温下离心(3 500 r/min,10min,下同),弃上清。加入SFM/BSA液轻微振荡悬浮。重复洗涤精液1次后,再用SFM液洗涤1次,获得精子细胞,调整细胞浓度为107个/m L。取100μL精子细胞悬液置于离心管中,分别加入上述各组G5/h DAF,吹打混匀后,在17℃孵育2 h,对照组只加入相应剂量的h DAF c DNA。每管设3个重复。离心精子细胞,弃上清,沉淀用PBS清洗3次后,保留约100μL液体,吹打混匀。精子悬液中加入DNaseⅠ至终质量浓度100 mg/L,37℃下作用30 min。离心,弃上清,沉淀PBS重悬,洗涤3次。保留约100μL液体。

1.2.3 PAMAM-D对猪精子细胞活力和畸形率的影响

取少量新鲜猪精液,充分洗涤后,SFM液调整细胞浓度为107个/m L。分别吸取100μL精子细胞置于离心管中,每管中分别加入50、100、200及400μg PAMAM-D,吹打混匀后,17℃孵育2 h。每管设3个重复。各吸取50μL未处理前、充分洗涤后和与各组PAMAM-D共孵育的猪精子细胞悬液置于载玻片上,在精子质量检测工作站下分别检测精子活力和精子畸形率。其中,精子活力是指样本中直线向前运动精子的百分比,精子畸形率是指畸形精子在样本中的比率。检测时精子的局部温度保持在37℃左右。

1.2.4 PAMAM-D/DNA复合物对猪精子活力和精子畸形率的影响

取未处理的猪精子细胞、与G5/h DAF共孵育后的各组猪精子细胞悬液各50μL,置于载玻片上,在精子质量检测工作站下分别检测精子活力和精子畸形率。

1.3 统计学分析

各组数据均用均数±标准差表示,SPSS11.5先行方差齐性检验,再进行方差分析,P<0.05代表差异有显著性。

2 结果

2.1 PAMAM-D对猪精子细胞活力和畸形率的影响

未处理前和充分洗涤后的猪精子细胞活力分别为(83.9±1.1)%和(83.6±0.9)%,猪精子细胞畸形率分别为(10.9±0.9)%和(11.9±1.2)%。经2 h孵育后,各处理组中大部分猪精子细胞呈前向运动,形态正常。各处理组与未处理前比较,其精子活力和精子畸形率差异均无显著性,见表1。

2.2 PAMAM-D/DNA复合物对猪精子细胞活力和畸形率的影响

未处理前和充分洗涤后的猪精子细胞活力分别为(82.8±1.5)%和(82.6±1.4)%,猪精子细胞畸形率分别为(9.9±0.6)%和(10.3±1.0)%。经2h孵育后,各处理组中大部分猪精子细胞呈前向运动,形态正常。各处理组与未处理前比较,其精子活力和精子畸形率差异均无统计学意义,表2、3。

注:各组间比较,P>0.05

注:各组间比较,P>0.05

3 讨论

精子载体法制备转基因动物的关键步骤是精子细胞摄取外源基因,只有精子细胞高效稳定地摄取外源基因,才能通过受精过程使外源基因成为胚胎细胞染色体的组成部分,从而培育出转基因动物。成熟的动物精子在结构与功能上具有结合外源DNA并使其核内化的能力,但外源基因与精子的结合是随机的,稳定性差。为此,出现了多种试图促进外源DNA与精子结合的改进技术,包括电穿孔法、病毒介导和脂质体法等[7]。然而,这些改进方法因存在种种缺点如对精子产生毒害作用、受精率下降及应用的局限性等,使精子载体法存在的问题仍然难以得到根本改观。目前,纳米材料PAMAM-D在基因治疗方面的研究取得了较好的效果,但采用以PAMAM-D介导的精子载体法只见于培育鱼类转基因动物的研究[8]。笔者将之应用于哺乳动物的转基因操作上,是一种新的尝试。PAMAM-D是一种人工合成的新型纳米材料,具有成辐射状对称的刚性球体结构。与普通高分子聚合物不同,它具有低黏度、高溶解性、可混合性以及高反应性等特点。因此,PAMAM-D成为基因转移的一个新载体,较传统载体有明显优势。

PAMAM-D本身对精子细胞是否有毒性,是联合PAMAM-D的改良精子载体法建立转基因动物的关键问题之一。因此,监测应用PAMAM-D后精子的功能状态是非常必要的。在客观评价精子的功能状态时,评价指标[9]主要包括精子核状态、运动能力、形态特征、质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性、获能以及与卵子的结合能力等。评价方法主要是利用光学显微镜、荧光显微镜及流式细胞记数仪等仪器,应用常规染色或荧光染色技术以及精卵受精能力分析来检测精子的功能状态。不过除专门的检测机构外,这些检查手段很难广泛应用。因此,在实际评价精子质量时,精子活率和精子的外形是精子质量评定的主要方法,一般要求精子活率在70%以上,如果正常形态精子的百分数小于70%,应认为是劣质精液。本组采用精子质量检测工作站,可以迅速检测出精子活率和精子畸形率,减少了光镜下检测精子活率和形态的人为误差,从而准确评估精子的质量,增强了该法的实用性。

现有PAMAM-D对细胞毒性的研究表明,PA-MAM-D表现出浓度及大小依赖的毒性,其分子代数和浓度越高,细胞毒性越强[10]。此外,它的细胞毒性大小与作用细胞的种类有关[10]。目前,对于PA-MAM-D毒性机制主要有2种代表性的观点[11],其一认为纳米材料所带的正离子与细胞膜相互作用造成细胞产生损伤或引起细胞凝聚,另一种看法则认为,纳米材料进入细胞后激活细胞内信号转导系统导致细胞毒性。另外,PAMAM-D分子还可以诱发细胞凋亡[12]。不过,上述研究并未涉及精子细胞。本实验结果提示,PAMAM-D(G5)在能有效介导DNA转染的浓度水平时未显示出细胞毒性作用,即使笔者将其剂量增加到400μg,达到所需最大剂量的近15倍时,仍未发现其对猪精子细胞的质量有明显影响。此结果表明,在一定范围内PAMAM-D及其复合物对猪精子细胞没有明显毒性,应用PAMAM-D制备异种移植用转基因猪是一种安全的方法。

摘要：目的 研究应用PAMAM-D对异种移植用外源基因hDAF转染猪精子细胞的安全性。方法 制备PAMAM-D/hDAFcDNA复合物,将PAMAM-D及复合物与处理后猪精子细胞共孵育,经精子质量检测工作站检测孵育后的精子活力和精子畸形率。结果 经精子质量检测工作站检测,PAMAM-D和PAMAM-D/DNA复合物对猪精子细胞活力和精子细胞畸形率没有明显影响。结论 PAMAM-D及其复合物对猪精子细胞没有明显毒性,应用PAMAM-D制备异种移植用转基因动物是一种安全的方法。

关键词：精子载体,PAMAM-D,异种移植,安全性,人衰变加速因子基因

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基因转染 篇5

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1 (南京鼓楼医院耳鼻咽喉科) ;C57/B6 小鼠 (南京大学模式动物研究所) ;胰酶 (BBI) ;DMEM (SH30022-01, hyclone) ;培养液 (DMEM+10%FBS+ 青霉素链霉素双抗) ;Hath1免疫荧光的I抗为小鼠抗Hath1 (DSHB) , Ⅱ抗为FITC- 山羊抗小鼠 (南京大学模式动物研究所) ;荧光显微镜 (E800, Nikon) 。

1.2 试验方法

1.2.1重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1的构建、鉴定、扩增、纯化及滴度测定

本文作者[1]已成功构建并鉴定了重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1, 经扩增和纯化后, 再用空斑测定法进行感染效率 (空斑形成单位, PFU) 测定。

1.2.2新生小鼠耳蜗成纤维细胞的培养

取新生1~5 d的C57/B6小鼠, 75%乙醇浸泡消毒, 眼科剪断头, 剪开颅骨, 去除脑组织, 剪下颞骨部分, 移入PBS培养液, 去除多余组织及骨质, 打开听泡, 剥去蜗壳, 用游丝镊沿蜗轴环行分离螺旋韧带, 取下整个耳蜗基底膜组织;将耳蜗基底膜组织用0.25 g/L胰蛋白酶, 于37℃消化40 min, 吹打分散, 加入培养液终止消化;将分离的细胞通过100目筛网过滤, 收集滤液, 以1 000 r/min离心10 min, 弃上清, 沉淀中加培养液重新悬浮, 移入6孔培养板, 放于37℃二氧化碳培养箱中培养, 以后隔日换培养液。

1.2.3重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞

新生小鼠耳蜗成纤维细胞培养48 h后见生长良好, 将其分为三组:Ad-Ds Red2-Hath1组、Ad-Ds Red2组和空白组, Ad-Ds Red2-Hath1组、Ad-Ds Red2组各加相应病毒5μL进行转染, 空白组不加病毒。放回37℃二氧化碳培养箱中继续培养。

1.2.4新生小鼠耳蜗成纤维细胞转染情况的观察

转染24 h后, 在荧光显微镜下观察新生小鼠成纤维细胞上的红色荧光, 以了解转染情况。

1.2.5转染细胞目的基因Hath1表达的检测

转染24 h后, 4%PFA固定细胞爬片, 经0.3%Triton X-100破膜和5%BSA封闭后, 加稀释过的Ⅰ抗:小鼠抗Hath1 (1∶800稀释) , 放于湿盒, 4℃过夜, 经PBS清洗后, 加稀释过的II抗:FITC-山羊抗小鼠 (1∶500稀释) , 放于湿盒, 避光, 室温2 h, 经PBS清洗后, 封片, 荧光显微镜观察目的基因Hath1的表达情况。

2 结果

2.1 重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1 的滴度测定

利用空斑测定法进行重组腺病毒的滴度测定。Ad-Ds Red2-Hath1 的结果为:6.0 ×1010pfu/m L;Ad-Ds Red2 的结果为:5.4×1010pfu/m L, 达到本实验所需要的滴度。

2.2 新生小鼠耳蜗成纤维细胞的培养

新生小鼠耳蜗成纤维细胞培养24~48 h后, 在倒置相差显微镜下观察, 可见成纤维细胞贴壁生长良好, 单层排列, 长梭形或多突起不规则形, 胞体透明, 胞浆均质, 分散生长, 细胞群无明显边界, 呈网织状分布 (见图1) 。

2.3 重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1 对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况

重组腺病毒Ad-Ds Red2-Hath1 转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞24 h后, 光镜下未见新生小鼠耳蜗成纤维细胞的形态和生长状态有明显的变化。荧光显微镜下可见Ad-Ds Red2-Hath1 能高效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞, 表现为被转染的成纤维细胞呈红色荧光, 细胞形态完好 (见图2) 。

荧光显微镜下可见被转染的成纤维细胞呈红色荧光

2.4 转染细胞目的基因Hath1 表达的检测

Hath1 的免疫荧光检测显示, 转染Ad-Ds Red2-Hath1 的成纤维细胞的胞浆呈绿色荧光 (见图3) , 而Ad-Ds Red2 组和空白组细胞呈阴性, 表明Hath1 基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中得到表达。

荧光显微镜下可见转染Ad-Ds Red2-Hath1的成纤维细胞的胞浆呈绿色荧光

3 讨论

哺乳动物内耳中的毛细胞是能够转换声音和运动信号的机械感觉接受器, 但由于年老、噪声、细菌病毒感染、耳毒药物以及自身免疫等原因, 可引起内耳毛细胞的丧失, 从而引起各种耳聋和前庭疾病。虽然出生后或成熟的鸟类和低等脊椎动物的毛细胞可再生[2,3,4]。但哺乳动物的毛细胞一旦缺失就不能自发再生[5]。为了恢复耳蜗和前庭功能, 就必须设法促使新的有功能的毛细胞产生。人的Hath1 基因是果蝇atonal基因的同源基因, 在进化过程中高度保守, 果蝇是Atoh1、鼠是Math1、人是Hath1, 它们编码b HLH (Basic helix-loop-helix) 转录因子, 这些转录因子调节许多系统的发育[6,7,8], 其中对耳蜗毛细胞的发育至关重要, 是毛细胞分化的正调节因子[8,9], Math1 基因的表达对毛细胞的产生非常重要, 敲除Math1 基因的小鼠, 前体细胞不能分化为毛细胞, 而支持细胞等其他细胞发育正常[9,10]。由此可见, Math1基因对内耳毛细胞的形成是必需的。近年来, 有关实验表明atonal同源基因的过度表达能导致哺乳动物耳蜗毛细胞的再生[11,12,13,14], 这些新生的毛细胞能吸引神经轴突向之生长[15], 而且能改善致聋豚鼠的听功能[16]。所以在耳蜗中转染atonal同源基因为毛细胞缺失引起的感音性聋或前庭疾病的治疗开辟了新的思路。

在耳蜗中过表达atonal同源基因需要借助于含有atonal同源基因的重组真核表达病毒或质粒载体。质粒载体转染耳蜗需要脂质体介导, 虽然其炎症反应及细胞毒性小但转染效率却很低, 陈杰[17]等报道通过脂质体介导质粒在新生小鼠离体耳蜗基底膜一转的范围内仅转染进17 个细胞;在病毒载体中, 腺相关病毒载体存在携带外源基因能力有限、病毒滴度低及制备繁琐等缺点, 单纯疱疹病毒载体尽管有嗜神经性, 但细胞毒性大, 在活体试验中有严重的免疫反应。而本实验所选择的腺病毒载体凭借其安全性好、感染效率高及病毒滴度高等特点, 成为研究非增殖细胞基因表达的最佳系统, 是神经系统疾病基因治疗的常用载体。

基因转染 篇6

关键词：基因转染,易损斑块,养心颗粒,白细胞介素-18

动脉粥样硬化(atherosclerotic,AS)是一个多种致病因素导致血管壁发生级联反应的慢性炎症过程,动脉内皮损伤引起的炎症反应是引起斑块不稳定的主要因素,减轻或消除炎症反应是稳定AS易损斑块的关键。养心颗粒具有益气养心安神的功效,其具有调脂、扩血管、改善血管内皮功能的作用。本课题拟观察养心颗粒对易损斑块家兔血清白细胞介素-18(IL-18)的影响,探讨其稳定易损斑块的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

家兔24只,雄性,体重2.3 kg～2.6 kg,4月～5月龄,均购自于黑龙江中医药大学实验动物中心,批号SCXK:(HEI)2007003,在通风、湿度、温度适宜的动物室内单笼饲养。

1.2 药物

养心颗粒按古方养心汤药物组成,由黑龙江中医药大学制剂室制备成养心颗粒;辛伐他汀片(浙江京新药业股份有限公司,批号:0908221)。

1.3 仪器与试剂

CR21型低温高速离心机(日本日立公司);2.5 mm×15 mm PTCA球囊(日本TERUMO公司);手推式压力器(爱尔兰MERITMEDICAL公司);6F鞘管(日本TERUMO公司);穿刺针(日本TERUMO公司);5F导管(日本TERUMO公司);彩色多普勒超声心动图仪(美国GE公司);兔IL-18试剂盒(美国R&D生物技术公司);中国斑点蝰蛇毒(Chinese Russell’s viper Venom,CRVV,广州蛇毒研究所);组胺(上海卓康生物科技有限公司,批号:070902)。重组人p53腺病毒注射液(Recombinant Human Ad-p53 injection,深圳市赛百诺基因技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备

应用球囊损伤颈总动脉结合高脂饮食喂养8周。8周末运用体表彩色超声方法证实颈总动脉粥样斑块形成,利用p53基因腺病毒注射液局部转染斑块处制备易损斑块模型[1],10周末药物触发以促使斑块发生实验性破裂,触发后处死。

球囊损伤:动物麻醉后手术暴露左侧颈总动脉及颈内、颈外分叉,将2.5 mm×15 mm的球囊导管经颈外动脉送入颈总动脉约3 cm,4个大气压充盈球囊后回拉至颈内、颈外分叉,反复回拉3次以造成内膜损伤。

p53转染:麻醉动物,暴露颈总动脉,经注射器分别向转染部位的管腔中注入10 μL滴度为1.5×1010 pfu/mL的重组人p53腺病毒注射液,注射前结扎转染部位上下两端的血管10 min,然后恢复血供,在结扎部位做缝线标记。静脉给予抗生素预防感染。

药物触发:参考Constantinide等[2]方法进行药物触发,10周末于各组动物模型按CRVV0.15 mg/kg腹膜下注射,30 min后耳缘静脉注射组胺0.02 mg/kg,于处死动物前24 h和48 h给予两次药物触发。

1.4.2 分组及给药方法

家兔18只作为模型组给予造模。8周末,将p53基因转染造模成功家兔随机分为3组,模型对照组、养心颗粒组、辛伐他汀组,每组6只;另取6只正常同龄同种系家兔作为空白对照组。

按人兔给药剂量体表面积折算公式计算给药量。各治疗组于第9周开始给予药物灌胃,养心颗粒组按0.643 g/kg粉末给药,辛伐他汀按2.5 mg/kg给药,每日灌服1次,连续灌服2周,空白对照组及模型对照组灌服同体积蒸馏水。

1.4.3 样本采集

各组于实验第8周末、第10周末分别抽取家兔耳缘静脉血 3 mL,4 000 r/min离心8 min,分离血清,-20 ℃保存,按试剂盒方法测定血清IL-18含量。

1.4.4 统计学处理

采用SPSS 17.0分析软件,数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。多组比较采用F检验,两两比较采用q检验,同组前后比较采用配对t检验。

2 结 果

与空白对照组相比,各模型组在8周末IL-18含量明显升高(P<0.01);10周末,与模型对照组相比,各治疗组IL-18含量降低(P<0.01);养心颗粒组IL-18含量低于辛伐他汀(P<0.01)。养心颗粒可明显降低模型动物血中IL-18的含量,且优于辛伐他汀组。详见表1。

3 讨 论

易损斑块是软斑块或非钙化斑块,具有薄纤维帽、大脂质池、炎症细胞浸润且易发生破裂。炎症反应引起的斑块表面内皮脱落、覆盖血栓、斑块钙化小结突出是易损斑块导致血栓事件发生的重要因素[3]。IL-18是近年来新发现的一种具有多向性效应的促炎症因子,它在炎症反应链中起着关键性的作用。IL-18主要位于斑块巨噬细胞胞质内,IL-18 表达量随着动脉粥样硬化斑块的进展而增多,它不仅可以通过干扰素-γ(IFN-γ)和黏附分子在血管细胞上的表达抑制平滑肌细胞胶原合成,还可诱导至少两种基质降解酶的表达,其中包括间质胶原酶,该酶被认为是支撑斑块纤维帽中胶原纤维降解的决定因素[4]。IL-18还可以直接控制斑块内单核细胞聚集和细胞死亡,此为斑块破裂和血栓形成的决定因子[5]。

养心颗粒是以养心汤为主方进行加减而研制成的,主要成分有黄芪、茯神、半夏、当归等,其中人参、黄芪大补元气,以扶心气,茯神、远志健脾和胃,补心安神;柏子仁、酸枣仁、五味子养心安神而敛心气,当归、川芍、半夏行气活血,化痰祛疲;肉桂与甘草辛甘养阳;五味子、酸枣仁酸甘化阴,补气活血药与养心安神药共同组方。本研究结果显示,养心颗粒能明显降低易损斑块家兔血清IL-18的含量,与模型对照组相比,差异有统计学意义。且养心颗粒组IL-18含量低于辛伐他汀组,这可能与养心颗粒能够延缓动脉硬化斑块进展,缓解因内皮损伤引起的炎症反应,进而稳定易损斑块的作用机制有关。

参考文献

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基因转染 篇7

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠C6胶质瘤细胞和导入IL18基因的C6/IL18细胞系,河北医科大学细胞生物教研室制备并保存[2]。顺铂(齐鲁制药有限公司),RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(天津灏洋生物公司),四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(美国Sigma公司),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(美国Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(美国Invitrogen公司),小鼠抗大鼠βactin、Mdr1、TopoⅡα,以及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗均来自美国Santa Cruz公司。

1.2 试验方法

1.2.1 MTT检测不同浓度顺铂对肿瘤细胞的抑制率

取对数生长期C6和C6/IL18细胞,接种于96孔培养板,24 h后根据不同药物浓度组:2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0μg/ml加入药物,对照组加入等量的生理盐水,每组均做3个复孔,实验重复3次(n=9)。药物与细胞共培养24 h后加入MTT,孵育4 h后终止反应。酶标仪(BIO-TEK ELX800,美国)在490 nm波长下测吸光值(A值)。根据公式计算细胞抑制率:对照孔A值-用药孔A值/对照孔A值×100%。由细胞抑制率与药物浓度的对数值作线性回归,求出顺铂对每种细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.2 流式细胞术检测顺铂作用后的细胞凋亡率

取对数生长期C6和C6/IL18细胞,接种于培养瓶中,24 h后加入终浓度为30.0μg/ml(C6/IL18细胞的IC50)的顺铂作用24 h,胰酶消化,冷PBS洗2次,Binding Buffer重悬细胞,设置阴性对照组(不加染料)、同型对照组(分别只加Annexin V-FITC和PI)以及药物处理组(混合Annexin V-FITC和PI),室温避光反应10 min上流式细胞仪(BD FACS Calibur,美国)检测,调节电压和补偿,收集10 000个事件,统计门内细胞的凋亡比例。实验重复3次。

1.2.3 反转录PCR检测m RNA的表达

Trizol法提取细胞总RNA,并进行反转录反应,反转录产物进行PCR反应,Mdr1、TopoⅡα、βactin和IL18的退火温度分别为51、55、53及59℃。引物见表1。

1.2.4 蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测蛋白的表达

提取细胞总蛋白,使用BCA法测定蛋白浓度,25μg/ml孔上样,蛋白经SDS-PAGE电泳分离后,转至NC膜上。NC膜用一抗4℃过夜孵育(Mdr1、TopoⅡα、βactin一抗均1∶1 000稀释),TBS洗膜,37℃二抗孵育1 h(1∶2 000稀释),洗膜后,滴加ECL化学发光液,采用凝胶成像系统(BIO-RAD Chemi Doc XRS,美国)记录图像。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示,作非配对t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对C6/IL18和C6细胞抑制率的比较

顺铂对细胞的抑制率随浓度升高而增大(见图1),除0.5μg/ml外,其他浓度2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0μg/ml,对C6/IL18细胞的抑制率均高于C6细胞(见表2),P<0.05,n=9。经计算,顺铂对C6/IL18细胞的半数抑制浓度(IC50)为29.66μg/ml,明显低于其对C6细胞的IC5055.49μg/ml,P<0.05。

2.2 顺铂对C6/IL18和C6细胞凋亡率的比较

C6/IL18和C6细胞经顺铂作用24 h后,C6/IL18细胞凋亡率[(22.63±2.85)%,n=3]明显高于C6细胞凋亡率[(10.57±1.93)%,n=3,P=0.012,F=1.16]。

2.3转染IL18基因对C6细胞Mdr1和TopoⅡα基因表达的影响

反转录PCR和Western blot结果显示(见图2、3),相对于C6细胞,C6/IL18细胞的Mdr1 m RNA和蛋白表达水平均明显减少(见表3、4),TopoⅡα变化不明显。

+P<0.05,n=9

注:+P<0.05

左侧孔为C6细胞,右侧孔为C6/IL18细胞

注:+P<0.05

注:+P<0.05

3 讨论

神经胶质瘤是成人中枢神经系统中最常见的原发肿瘤,占颅内肿瘤的70%,预后差,死亡率高。胶质瘤治疗采用手术、放化疗结合的手段,然而患者生存时间并没有大幅度提升和改善。主要原因是胶质瘤呈浸润性生长,手术不能完全切除;另一方面由于其内在的耐药性,化疗药物很难有效地杀伤肿瘤细胞,从而导致化疗失败。

化疗过程中,患者在接触化疗药物一段时间后,多数会发生耐药,并且对其他在结构和机制上完全不同的药物表现出交叉耐药,这种现象称多药耐药(multidrug resistance,MDR)。恶性肿瘤细胞产生多药耐药的机制尚未完全阐明,其中已知的最重要的形成机制是P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp)过度表达[4],该蛋白是跨膜转运蛋白,定位在细胞膜和高尔基体上,可以将药物分子泵出胞外,减少药物的胞内累积,不仅如此,Pgp对底物要求不严格,可将不同类型的药物泵出,从而形成多药耐药。Pgp过度表达,与肿瘤耐药、复发和预后密切相关[5,6,7,8]。周荣福[9]等的临床研究发现,人脑星形细胞瘤Pgp表达先天存在,对化疗药物有先天耐受性,当药物刺激后Pgp阳性表达能产生继发耐药或增强先天耐药。人类编码这一蛋白的基因为Mdr1,定位在7号染色体长臂2区1带,含28个外显子。Mdr1基因启动子及其邻近区域,可与多条信号通路的转录因子结合,调节Mdr1的转录[4,10,11,12]。另一条介导多药耐药的途径是DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)的数量或活性减少[13]。真核细胞中TopoⅡ的主要作用是调节DNA空间结构,参与DNA修复、复制和转录。以TopoⅡ为靶点的抗肿瘤药物通过形成药物-酶-DNA复合物抑制DNA的复制与转录。研究发现[14,15],TopoⅡ的含量或活性下调,引起药物失去效靶,形成细胞耐药。这类耐药没有Mdr1基因过表达,主要表现为TopoⅡ基因突变或缺失;TopoⅡ酶水平减少或磷酸化水平提高。

白细胞介素18是一种多功能细胞因子,能够增强体内抗肿瘤免疫反应[1],是基因治疗的候选基因。研究表明[16],IL18基因单独转染,或与其他细胞因子联合转染,如IL12、IFN、FASL等,表现出显著地抑制肿瘤生长的特性。XU[16]等应用慢病毒转染的方法,将IL18和IFNβ基因导入骨髓基质干细胞,发现这些转基因细胞能显著抑制胶质瘤细胞生长,促进其凋亡;大鼠模型显示,这些转基因细胞还能增强其他抗肿瘤因子的分泌,以及CD4+和CD8+T细胞对瘤组织的浸润,延长荷瘤大鼠生存期。虽然转染IL18基因能显著地抑制肿瘤生长,但是这些研究中的肿瘤细胞并不能全部清除。转染IL18基因能否增强化疗效果尚未有深入研究。本研究首先观察C6/IL18和C6两种细胞,在不同浓度顺铂下的生长抑制情况,发现顺铂对C6/IL18细胞的生长抑制明显增强。之后,进一步检测这两种细胞的Pgp和TopoⅡα的m RNA和蛋白水平的变化,发现C6/IL-18细胞中Pgp表达量明显减少,这与顺铂对其有较高抑制率的结果相对应,推测转染IL18基因通过下调多药耐药基因Mdr1的表达,增强药物对C6细胞的毒作用。

Mdr1基因表达可被多条信号通路调节,其中ERK/MAPK和PI3K/AKT最密切相关。MUNOZ[17]等人的研究发现,胶质瘤细胞系对替莫唑胺耐药的过程包含两个阶段:早期阶段,胞浆内的Pgp转运到胞膜,伴随构象激活性改变;晚期阶段,肿瘤细胞自分泌EGF,与自身的EGFR受体结合,激活ERK1/2-JNK-AP-1信号通路,增强Mdr1基因转录。大量研究表明[18,19,20,21],药物作用肿瘤细胞会引起PI3K/AKT信号活化,进而上调Mdr1表达,应用小RNA干扰或抑制PI3K-AKT活性能下调Mdr1。而PI3K/AKT下游的哪个或哪些靶基因作用Mdr1,不同课题组得出的结果不尽相同。一些研究发现抑制耐药细胞的PI3K-AKT活性后,通过NF-κB途径调节Mdr1[19]。而其他研究发现,药物可通过Akt-m TOR信号通路增加Mdr1表达[20],阻断m TOR通路能抑制膜转运蛋白ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达,逆转细胞的耐药性[21]。这些研究使用的药物以及肿瘤细胞类型不同,肿瘤基因组异质性较强,可能存在多个途径影响Mdr1表达。之前的研究报道C6细胞中转染IL18基因能够显著性上调P21的表达,下调周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的表达,引起细胞周期阻滞[3]。而AKT活化介导的下游信号与这一作用相反,通过抑制P21的活性,稳定cyclin-CDK复合物,促进细胞周期进展。因此,转染IL18基因可能通过对抗PI3K-AKT信号,调节Mdr1基因表达。

基因转染 篇8

1 材料和方法

1. 1 实验动物

清洁SD大鼠由佳木斯大学动物实验中心提供。

1. 2 主要试剂

胎牛血清、Aβ1 - 40、神经干细胞基础培养基、神经干细胞完全培养基、神经小球分散试剂盒等均购于美国Sigma公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 动物模型的建立[4]

选左侧海马CAI区为注射区: 根据Pellegrino和Cusmhna的大鼠脑立体定位图谱, 确定本研究中的注射坐标为前囱后3. 3mm, 中线左侧2. 2mm, 硬脑膜下2. 8mm。用微量加样器缓慢注射Aβ - 40 溶液1μL, 之后缓慢撤针, 充分消毒, 缝合皮肤。术后常规饲养, 待两周后做细胞移植。

1. 3. 2 分组和细胞移植

30 只AD大鼠在随机分为3 组, 每组各10 只:AD模型组、移植神经干细胞组 ( NSCs组) 和移植NEP基因转染神经干细胞组 ( NEP - NSCs组) 。选左侧海马CAI区在3 组AD大鼠分别微量植入6μL细胞培养液、NSC悬液及NEP - NSC悬液 ( 浓度约为1 × 105个细胞/μL) , 注射完毕后, 全层缝合头皮, 腹腔注射青霉素, 术后放置于温暖安静处至清醒。每组大鼠术后第8 周进行实验。

1. 3. 3 隐蔽平台实验[5]

实验期限为6d。实验前让大鼠自由游泳1 分。在水迷宫象限的中央固定隐蔽平台的位置, 将每只大鼠头朝外壁在任何一个象限内的随机位置放入水中, 大鼠爬到平台上或到达60 秒时, 实验立即停止。大鼠自己爬到平台或操作人员引导使其爬上平台后停留10 秒。每天训练4 次, 每次间隔30min。通过影像系统记录大鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。此实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力。

1. 3. 4 空间探索实验

第7 天在水迷宫中撤除平台, 将动物在任意一个入水点将放入水中, 检测60 秒时间内, 大鼠出现在目标象限 ( target quadrant, TQ) 的百分比。此实验用来检测动物保持记忆能力。

1. 4 统计学方法

采用SPSS 11. 3 软件分析, 各组间统计分析应用t检验。实验数据以表示。

2 结果

2. 1 行为学测试

与AD模型组相比, NEP - NSCs组和NSCs组的AD大鼠在第4、5、6 天的平均潜伏期均明显缩短 ( P < 0. 05) , 以NEP - NSCs组尤为明显, 且NEP -NSCs组的AD大鼠在第4、5、6 天的平均潜伏期亦明显比NSCs组缩短 ( P < 0. 05) 。

2. 2 空间探索实验

与AD模型组相比, NSCs组和NEP - NSCs组AD大鼠在目标象限探索时间的百分比有所增加, 以NEP - NSCs组明显, 但无统计学差异 ( P > 0. 05) 。

3 讨论

本实验中Aβ 海马CAI区微量注射制备AD大鼠模型, 将NEP基因转染的神经干细胞移植到AD模型大鼠侧脑室区, 通过隐蔽平台获得实验和空间搜索实验评价NEP基因转染对AD大鼠学习记忆的影响。实验结果显示: 隐蔽平台获得实验中, 与AD模型组相比, NEP - NSCs组和NSCs组在第4、5、6 天的平均潜伏期均明显缩短 ( P < 0. 05) ; 与NSCs组相比, NEP - NSCs组第4、5、6 天的平均潜伏期亦明显缩短 ( P < 0. 05) 。这表明NEP - NSCs组和NSCs组均能显著改善AD大鼠的学习和记忆功能。空间探索实验中, 与AD模型组相比, NEP -NSCs组和NSCs组在TQ象限搜索时间的百分比有所增加, 但无统计学意义。水迷宫实验表明, 海马移植了转染NEP基因的神经干细胞后, 可以明显改善AD大鼠的学习和记忆功能, 原因是由于海马移植了转染NEP基因的的神经干细胞后, 可以高表达NEP蛋白, NEP蛋白是Aβ 降解酶, 因此可以减少Aβ 在皮层及海马区的沉积, 降低了Aβ 对神经系统的毒性作用。从而改善和提高了AD大鼠的学习和记忆功能。

关键词：NEP基因,神经干细胞,AD大鼠

参考文献

[1]Debora D, Jean-Paul N.Proteomic analysis of cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients[J].Proteomics, 2004, 4:2117-2124

[2]Wasinger V C, Cordwell S J, Cerpa-Poljak A, et al.Progresswith gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma gen-italium[J].Electrophoresis, 1995, 16 (7) :1090-1094

[3]张维烨, 李艳君, 陈立强.神经干细胞分化研究进展[J].黑龙江医药科学, 2005, 28 (3) :89-90

[4]朱飞奇, 马英, 钱采韵.大鼠海马立体定向注射Aβ1-40建立阿尔茨海默病动物模型[J].郧阳医学院学报, 2008, 28 (2) :106-108