关键词：
抗原表位预测（精选六篇）
抗原表位预测 篇1
1材料与方法
1.1 SLT-IIeB蛋白序列
检索Genbank查找SLT-IIeB蛋白的氨基酸序列, 检索号为M21534。检索结果:SLT-IIeB蛋白共包含87个氨基酸。
1.2 SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区预测
利用分析软件DNAStar中的Garnier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区域。1.3 SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位预测采用分析软件DNAStar, 按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准, 预测其亲水性;按Emini方案预测蛋白质的表面可能性;按Jameson-Wolf方案预测其抗原性指数, 然后综合评定SLT-IIeB的B细胞抗原表位所在。
2结果与分析
2.1 SLT-IIeB蛋白二级结构柔性区域预测结果
按GarnierRobson、Chou-Fasman、KarplusSchulz方法预测的结果分别见图1、图2、图3, 综合3种预测方法分析得出:SLT-IIeB蛋白的二级结构柔性区域可能位于N端第31-35、43-45、49-52区段和第75-78区段。
2.2 SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位预测
分别按KyteDoolittle、Emini、Jameson-Wolf方案对SLT-IIeB蛋白的氨基酸链的亲水性、表面可能性和抗原指数进行分析, 结果如图4、5、6所示。经过对抗原指数、亲水性指数和蛋白质表面可能性指数进行分析, 初步确定SLT-IIeB蛋白可能的B细胞抗原表位区域, 如果某区域内部或附近又具有柔性结构, 则该区域较有可能是B细胞表位。
综合分析以上预测结果, SLT-IIeB蛋白分子较有可能的B细胞表位区段位于N端第28-36区段和第43-53区段。
另外, 用BepiPred预测SLT-IIeB蛋白的B细胞表位的结果如表1所示。
综合以上两种分析软件的结果, 最终得出SLT-IIeB的B细胞表位优势区段为N端第31-36区段 (见表2) 。
3讨论
3.1猪水肿病由产类志贺毒素的大肠杆菌引起, 它主要产生F18ab菌毛和类志贺毒素II型变异体 (SLT-IIe) 两类毒力因子。SLT-IIe的保护性抗原SLT-IIeB蛋白具有很高的同源性, 可作为表位疫苗和基因工程疫苗的研制基础。然而, 目前国内外还没有利用SLT-IIeB蛋白研制表位疫苗和基因工程疫苗的报道。本实验对SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位进行预测, 目的就在于为今后研制猪水肿病表位疫苗和基因工程疫苗奠定基础。
3.2正确而详细地绘制蛋白质表位图谱对猪水肿病的诊断及预后判定, 疫苗分子设计及免疫干预治疗等至关重要。根据B细胞表位的特征, 先预测抗原表位, 再对合成的肽段进行实验确认, 是一种省时、省力和经济的方法。目前预测B细胞表位的软件有很多, 但没有一个软件的准确性能达到100%, 目前大多数研究者使用DNAStar, 利用DNAStar中Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini的蛋白质表面可能性方案、Jameson-Wolf的抗原指数方案, 辅以GarnierRobson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法, 取得了很多成功的结果。另外, 国内外也有部分研究者使用在线软件BepiPred进行B细胞表位预测, 并取得了成功。
3.3为了准确预测SLT-IIeB蛋白的B细胞表位, 本研究首先使用DNAStar软件进行预测, 得出SLT-IIeB蛋白的可能B细胞抗原表位, 同时利用在线软件BepiPred进行SLT-IIeB蛋白可能的B细胞抗原表位预测, 通过比较两种预测方法, 发现两种方法得出的结果具有相重合的区段, 那么这些区段很可能就是我们要找的优势抗原表位。经过分析汇总, 推测SLT-IIeB蛋白最有可能的B细胞表位位于N端第31-36区段内。但这个区域仅仅是SLT-IIeB蛋白中的B细胞表位优势区段, 而不包括所有的抗原表位, 我们推测在其它区域也可能存在B细胞表位。
抗原表位预测 篇2
甲型H1N1流感能不断引起流行是由于其抗原性不断发生漂移所致[4]，其中最重要是血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的变异[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白，它的裂解性、受体特异性和糖基化是决定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神经氨酸酶是病毒囊膜表面的另一种重要的糖蛋白，在决定病毒毒力和宿主特异性方面也具有重要作用，与HA共为流感病毒亚型分型的主要依据，NA同时也是抗流感病毒的重要作用靶点[6]。目前，国内虽然已经开发了H1N1流感疫苗并接种了2000多万人，但是，接种所致的不良反应事例的出现同样给健康的人们带来了灾难。有针对性地改造毒素的相应蛋白、获得更为安全有效的疫苗成为解决问题的关键，而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成为关键的突破口。
本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性变化的情况，并对其可能的抗原性表位进行了分析预测，为新型甲型流感疫苗的制备提供依据，以便更有效及时地控制甲型流感的传播。
1 材料与方法
1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列与氨基酸序列
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html)网站下载新近公布的新发甲型H1N1流感病毒的核酸序列与氨基酸序列。从不同国家和地区随机挑选28株新型甲型H1N1流感病毒株来进行接下来的序列比较和抗原性分析。
1.2 新型甲型H1N1流感病毒的细胞抗原表位预测
用Clustal X软件分别对28例HA、NA氨基酸序列进行多序列比较,然后使用MEGA 2.0的邻接法(neighbor-joining method,NJ)构建进化树,分析彼此之间序列的变异大小。对比序列比对分析结果,选取其中代表性的序列作为基准株,用Protean软件对基准序列的亲水性、表面可能性、抗原指数进行综合分析,分析各指数值得到B细胞抗原表位预测结果;使用NetMHCⅡ2.2在线表位预测服务器,选定服务器包含的所有MHC classⅡ等位基因,以9个连续氨基酸为测定单位,根据各序列与MHC classⅡ等位基因的亲和能力不同,预测出其可能的T细胞抗原表位。
2 结果
2.1 新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸比较
用MEGA 2.0进行进化树分析,所得结果见图1、图2。从图1和2可以看出,28例HA以及NA氨基酸序列可以分为两个大的族群,通过对这两个族群的氨基酸序列进行分析发现,HA氨基酸序列按220位氨基酸为苏氨酸或者丝氨酸分为两个族群;NA氨基酸序列按106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰分成两个大的族群;分别选取两种蛋白的两个族群中较有代表性的HA氨基酸序列CY046475与CY044869和NA氨基酸序列CY046477与GQ149691为基准序列以便进行下一步的细胞抗原性表位预测。
2.2 Protean软件分析基准株HA、NA蛋白B细胞抗原性特征
用Plot-Kyte-Doolittle亲水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指数[9]三参数综合考虑预测方案进行B细胞表位预测,HA氨基酸序列CY046475与CY044869的B细胞表位预测结果并没有明显差别,同样,NA氨基酸序列CY046477与GQ149691的B细胞表位预测结果也没有明显差别,因此,只选取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的结果列出。对各个参数进行综合分析,发现在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各项指数均较高,提示可能是抗原性表位,见图3。综合各参数分析,发现在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各项指数均较高,提示为抗原性表位,见图4。
注:进化树后的名称为GeneBank的登录号
2.3 NetMHCⅡ2.2软件分析基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性特征
使用NetMHCⅡ2.2在线T细胞抗原表位预测服务器分析了基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性表位,发现HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸区段抗原值较高,见图5;NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸区域抗原值较高,见图6,可能为T细胞抗原性表位。
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC classⅡ等位基因的亲和力大小
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC classⅡ等位基因的亲和力大小
3 讨论
甲型（A）流感病毒（influenza virus A）基因组含有8个RNA片段[10]，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚合酶；第4个节段负责编码血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白；第5个节段负责编码核蛋白（nucleoprotein,NP）；第6个节段编码的是神经氨酸酶（neuraminidase,NA）；第7个节段编码基质蛋白（matrix protein,MP）；第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神经氨酸酶被认为是最重要的免疫原性位点[11]。
经过对选自世界各国不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列进行Clustal X分析，发现不同株之间氨基酸序列相对保守。HA蛋白最具特征性的变异为220位氨基酸的差别，28株中有15株为丝氨酸和13株为苏氨酸。对28例NA蛋白中有8例同时发生了106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰。总体上来看，HA蛋白的变异性相对于NA蛋白较大。
利用Protean软件对基准株的HA、NA抗原表位进行预测，联合使用Kyte-Doolittle的亲水性方案，Plot-Emini的蛋白质表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指数方案进行综合分析，发现HA蛋白有8段序列，NA蛋白有12段序列是可能的B细胞抗原表位。对220位氨基酸为苏氨酸的HA蛋白和106位氨基酸为缬氨酸、248位为天冬氨酰的NA蛋白与未发生相应变异的蛋白序列进行比较，发现变异位点并不影响HA、NA蛋白的B细胞表位特征。利用NetMHCⅡ2.2软件分析T细胞抗原表位也同样发现，上述变异位点并不影响HA、NA蛋白的T细胞表位特征。根据以上分析，提示新型甲型H1N1流感病毒关键蛋白HA、NA的一些区域抗原性相对比较稳定，可以作为检测以及疫苗研发的靶区域。
随着计算机技术的不断发展，细胞抗原性表位预测方法也得到了很大的进步与广泛的应用，如表位疫苗的设计、新的诊断试剂开发等。但是细胞抗原性表位预测仍然不够完善。目前，几乎所有的细胞抗原性表位预测的算法都是预测连续氨基酸组成的线性表位，而较少涉及构象性表位的研究。本研究仅是对新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的细胞抗原性表位进行初步筛选，预测结果需要进一步用实验结果来证实。
摘要：目的:比较新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸序列之间的差异,分析HA、NA蛋白可能的抗原性细胞表位。方法:从GenBank中选取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分离株并下载各株HA、NA的氨基酸序列;使用ClustalX和MEGA2.0软件对氨基酸序列的进行进化树分析;用Protean软件预测HA、NA蛋白的B细胞表位;用NetMHCⅡ2.2预测T细胞抗原表位。结果:世界范围的毒株之间氨基酸序列相对保守,HA及NA均只有少数位点的变异,HA蛋白氨基酸序列之间较NA蛋白氨基酸序列之间变异较大;预测HA蛋白具有8个B细胞表位和10个T细胞表位;NA蛋白有12个B细胞表位和7个T细胞表位。结论:HA、NA蛋白的少数区域抗原性相对比较稳定,可以作为检测以及疫苗研究的靶区域。
抗原表位预测 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 钉螺及实验动物
阳性钉螺购自湖南省血吸虫病防治研究所。日本大耳白兔购自武汉大学实验动物中心。
1.1.2 细菌及噬菌体文库
大肠杆菌ER2537株及噬菌体随机12肽库（滴度为1.5×1013 pfu/ml）均由中南大学湘雅医学院易新元教授惠赠。
1.1.3 试剂及仪器
聚乙二醇（PEG-8000）、HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG、96孔可拆分酶标板均购于武汉亚法生物技术拓展公司；HRP标记鼠抗M13单克隆抗体购自英国Amersham Pharmacia Biotech公司；TNT试剂（10 mmol/L Tris.Cl pH 8.0;150 mmol/L NaCl;0.05%Tween20）、1%TBST(50 mmol/L Tris-HCI,pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1%Tween20）、TBS(50 mmol/L Tris-HCI,pH 7.5;150 mmol/L NaCl）、洗脱液（0.2 mol/L Gly·HCI,pH 2.2）、PEG-NaCl(20%PEG-8000;2.5 mol/L NaCl）、0.5%PBST(pH 7.4,0.5%Tween20）均为自配。高速冷冻离心机为上海安亭科学仪器厂出品（TGL-16G-A型）；恒温振荡器为常州国华有限公司出品（CHA-5型）；Rayto酶标仪为RT-2100型。
1.2 方法
1.2.1 处理血清
首先制备大肠杆菌裂解液（大肠杆菌抗原），将其与兔混合血清（感染21 d）和TNT按1:5:5的比例进行混合以充分吸收血清中的抗ER2537抗体[2]。
1.2.2 免疫筛选血吸虫感染早期诊断抗原模拟表位
每轮筛选包括以下过程：（1）处理好的兔血清稀释包板；（2)3%脱脂奶粉37℃封闭；（3)TBST洗6次；（4）加肽库（二轮后为前一轮洗脱扩增液）稀释液；（5）洗涤，加洗脱液；（6）收集洗脱液，转化培养扩增[2]。
三轮筛选的条件不同，每一轮免疫筛选的回收率：噬菌体回收率（%）=（洗脱的噬菌体/加入的噬菌体）×100%[2]。
1.2.3 每轮筛选富集所得噬菌体与感染21 d兔血清的亲和反应
包括以下过程：（1）噬菌体包板（浓度：1×1014pfu/ml）；(2）封闭过夜，洗涤；（3）加一抗（感染21 d兔血清）；（4）加二抗（羊抗兔IgG），显色；（5）记录490 nm吸光度值（OD490nm）[2,3]。
1.2.4 ELISA鉴定阳性多克隆噬菌体抗原性
同上，噬菌体包板，封闭后，加入不同兔血清进行抗原抗体反应，记录不同兔血清发生反应最高稀释倍数[2,3]。
1.2.5 单克隆噬斑的挑取及纯化[2]
1.2.6 ELISA鉴定噬菌体单克隆抗原性
方法同1.2.4，酶标仪测定OD490nm值，cut off值≥2.1判为阳性，计算各组相对阳性率[2,3]。
2 结果
2.1 阳性噬菌体的筛选富集与亲和力鉴定
三轮筛选结果见表1。从表中可看出精三轮筛选，回收率逐步提高，呈数量级递增，最终回收率提高了二百多倍，说明阳性噬菌体得到有效筛选和富集。从表1中还可看出各轮噬菌体对感染21d兔血清的亲和力也同回收率一样呈对应性增强，其OD490nm分别为0.10、0.28、0.32。
2.2 阳性多克隆噬菌体抗原性鉴定
三轮筛选到的多克隆噬菌体与感染10、21、42 d兔血清发生抗原抗体反应的最高滴度分别为1:200,1:400和1:400。
2.3 阳性单克隆噬菌体抗原性鉴定
11个随机挑选的噬菌体单克隆分别与感染10 d,21 d和42 d兔血清反应结果见表2。其中A、E、H号3个单克隆噬菌体与感染21 d兔血清具有高亲和力。
3 讨论
噬菌体随机肽库技术是一种将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。将抗体作为受体暴露于肽库中，筛选并分析所得到的能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列，就可以得到抗原决定簇的信息，尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，Geysen将这种肽段称为“模拟表位”（Minotope）[4]。该技术实现了表型与基因型的统一，易进一步进行改造以满足不同的需要；且多肽易生产和分离，价廉，噬菌体稳定且保存时间长，为一种快速鉴定优势中和抗原决定簇的有效方法。随着该技术的进一步发展，使用范围不断扩展，其优越性被越来越多的科研工作者所认识，也使该技术得以不断的完善和发展。
本研究采用感染21 d兔血清对噬菌体随机12肽库进行了筛选，通过计算每一轮筛选噬菌体得率的变化和测定每一轮筛选得到的噬菌体对感染21 d兔血清的结合力，来检验该方法富集效果。初步实验结果表明，噬菌体得率随着筛选轮数的增加得以极大提高，与其他轮数相比，第二轮提高幅度较大，与此相应的是每一轮筛选所得噬菌体对感染21 d兔血清的结合力也均有提高，尤其在第二轮筛选出的噬菌体，其和21 d兔血清结合的OD490nm(ELISA法）比原库要高出5倍多，其与噬菌体第二轮得率变化是一致的。这2个试验结果说明：通过噬菌体随机肽库技术筛选，与感染21 d兔血清有一定结合力的噬菌体得到了有效富集，也说明该技术具有广泛的应用领域[5,6]。
与此同时，用ELISA法对阳性多克隆噬菌体抗原性进行鉴定，实验结果显示阳性多克隆噬菌体与感染21、42 d兔血清呈阳性反应且反应滴度较高，显示了较好的抗原性及一定的特异性。将第三轮筛选得到的噬菌体单克隆化后，随机挑选11株单克隆分别与感染10、21、42 d兔血清发生反应，采用ELISA方法分别计算各自阳性率。结果显示这11株单克隆与感染早期兔血清均有较高结合力，其中与感染21 d兔血清反应阳性率最高。初步研究结果说明经筛选的多克隆噬菌体中含有日本血吸虫感染早期诊断抗原模拟表位。
摘要：目的:利用噬菌体随机12肽库技术筛选日本血吸虫感染早期诊断抗原。方法:用日本血吸虫感染后21d兔血清从噬菌体12肽库中经3轮筛选,有效地富集与早期感染兔血清有亲和力的噬菌体克隆。随机挑取11个单克隆分别纯化、扩增,随后采用ELISA、DOT-ELISA等检测方法,挑选出与早期感染兔血清有高亲和力的噬菌体克隆。结果:挑选出3个与感染后21d兔血清具有高亲和力的噬菌体单克隆。结论:用感染后21d兔血清从噬菌体随机12肽库中能筛选到日本血吸虫童虫早期诊断抗原模拟表位。
关键词：日本血吸虫,童虫,早期诊断抗原,模拟表位,筛选
参考文献
[1]Smith G E.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science,1985,228(4705):1315-1317.
[2]胡艺兰,何立,蒋明森,等.用日本血吸虫感染新模型兔血清筛选噬菌体随机肽库的初步研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2004,16(2):115-117.
[3]吴栋才,刘湘,何立,等.筛选日本血吸虫童虫早期诊断抗原的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2006,18(2):83-87.
[4]GeysenHM,RoddaSJ,MasonTJ,etal.Thedelineationofpeptidesableto mimicassembleepitopes[J].JMolImmunol,1986,23(11):709-715.
[5]Sibille P,Strosberg A D.A FIV epitope defined by a phage peptide library screened with a monoclonal anti-FIV antibody[J].Immunology Letters,1997,59(11):133-137.
抗原表位预测 篇4
FMDV属微RNA病毒科口蹄疫病毒属,完整的病毒颗粒外形呈二十面体、无囊膜,由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成。VP1是诱导机体产生特异性免疫反应的主要抗原蛋白,其中21 ~ 40 aa肽段是重要的T细胞抗原表位[3]; 141 ~ 160、200 ~ 213 aa肽段免疫动物机体后能够保护动物抵抗病毒攻击[4],是重要的B细胞抗原表位。因此, 以上抗原表位是研究FMDV基因工程疫苗的首选抗原分子。目前,通常采用串联表达VP1中T、B细胞抗原表位的方式来获得重组多肽,经鉴定都具有生物学活性,能刺激机体产生特异性的免疫应答[5 -6]。
本研究的目的在于把O型FMDV VP1 21 ~40 aa和129 ~169 aa串联后的基因( 以下简称TB60) 克隆入分泌型表达载体pGAPZαA,然后采用电穿孔法转入毕赤酵母( P. pastoris) X33菌中,通过重组将含有目的基因的表达框整合到酵母染色体上,用于稳定地表达多肽TB60。经鉴定该多肽具有良好的免疫原性,为研制新型的O型口蹄疫疫苗奠定了一定的基础。
1材料与方法
1. 1菌株、质粒和毒株
毕赤酵母受体菌X33、表达载体pGAPZαA,购自Invitrogen公司; 大肠杆菌DH5α,由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。
1. 2主要试剂及试验动物
LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、Bln Ⅰ,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 超低分子质量蛋白MakerⅡ( 3. 5 ~ 26. 6 ku) ,购自中科瑞泰( 北京) 生物科技有限公司; 一抗为猪O型口蹄疫多克隆阳性血清,由温氏集团研究院惠赠; HRP标记的山羊抗小鼠IgG,购自广州美津生物技术有限公司; 双色荧光染色标记的兔抗猪IgG二抗,购自Sigma公司; 猪O型FMDV ELISA抗体检测试剂盒,购自PRIONICS公司; 合成肽疫苗,购自申联生物医药( 上海) 有限公司。6周龄SPF级昆明鼠,购自南方医科大学实验动物中心。
1. 3多肽TB60基因的合成与引物设计
参照GenBank上发表的O型FMDV VP1基因序列( 登录号HM055510. 1) ,选用毕赤酵母偏嗜性密码子,设计含有T细胞表位( 21 ~40 aa) 和B细胞表位( 129 ~169 aa) 的多抗原表位多肽基因TB60,另外设计引物P1、P2用于TB60基因的扩增与检测,TB60基因及其引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 引物序列如下: P1 5' - GAATTCGTTTACAACGGTA- ACTGP - 3',P2 5' - GCGGCCGCTAAAACGAATCT- G - 3'。
1. 4目的基因TB60的获得及重组酵母表达载体的构建
用已合成的pUC57 - TB60质粒为模板,P1、P2为引物,PCR扩增出TB60基因,经琼脂糖凝胶电泳检测后,采用PCR产物回收试剂盒回收后,将目的基因进行EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切,与同样酶切过的酵母表达载体pGAPZαA连接,构建重组酵母表达载体pGAPZαA - TB60,经过PCR鉴定,阳性的重组质粒送上海英俊生物技术有限公司测序。
1. 5重组载体电击转化毕赤酵母X33及阳性转化子的鉴定与筛选
设定电转化参数电压为305 V、电容为25 μF、电阻为200 Ω、电击时间为15 ms; 取80 μL感受态毕赤酵母细胞X33与10 μg Bln Ⅰ线性化的重组质粒pGAPZαA - TB60轻轻混匀,转移至预冷的电转杯中,电转化后立即加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇, 轻轻混匀后转入5 mL的离心管中,30 ℃温箱中静置培养1 ~2 h; 再加入1 mL YPD液体培养基( 自制) , 30 ℃ 、200 r / min振荡培养1 h; 离心收集菌体并铺于新鲜制备的YPDS培养基[含100 μg/mL的博莱霉素( Zeocin) ]上,将平板倒置,于30 ℃ 温箱中培养3 ~ 5 d; 采用煮- 冻- 煮法制备PCR模板分析毕赤酵母转化子,以P1、P2为引物能扩增出203 bp的克隆为阳性转化子,再经不同浓度Zeocin的YPD培养基挑选高拷贝克隆,用于高效表达目的蛋白。
1. 6重组酵母表达上清液的Western - blot检测
多肽TB60的分子质量约为8. 0 ku,故采用Tricine - SDS - PAGE,以提高小肽的分辨率,降低带型的弥散程度。将重组酵母菌发酵上清液变性,经Tricine - SDS - PAGE分离蛋白质后,电转移至PVDF膜上,进行Western - blot鉴定,采用Odyssey双色红外激光成像系统进行结果检测。其中一抗为猪O型口蹄疫多克隆阳性血清( 1∶50) ,二抗为双色荧光染色标记的兔抗猪IgG( 1∶200) 。
1. 7表达上清液中目的蛋白浓度的测定
用Gene RAY UV - Photometer核酸蛋白质分光光度计测出重组酵母在72,96,120小时的表达上清液总蛋白浓度。同时对表达产物上清液进行Tricine - SDS - PAGE蛋白电泳,置于光密度扫描仪进行薄层灰度扫描,通过Lab work软件系统来分析, 利用空载体重组酵母菌表达上清液作阴性对照,计算总蛋白中多肽TB60的含量。
1. 8小鼠免疫试验
取6周龄SPF级昆明鼠30只,随机分为5组,每组6只。A组为多肽进口佐剂组,注射纯化后的多肽TB60( 50 μg / mL) 与EMULSIGEN水包油佐剂( 以4∶1混合均匀) ; B组为多肽组,只注射多肽TB60 ( 50 μg/mL) ,无佐剂; C组为合成肽组( 阳性对照组) , 注射合成肽疫苗( 按说明书20 μL/只) ; D、E组为阴性对照组,分别注射毕赤酵母空载体表达上清液及PBS。 每组小鼠均为后肢股内侧肌注100 μL /只·次,间隔14 d,免疫3次。每次免疫后的第10天,分别取小鼠断尾采血,离心分离血清检测抗体水平的变化,检测方法参照PRIONICS公司的猪O型FMDV ELISA抗体检测试剂盒说明书( 以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗) 。
1. 9不同多肽TB60浓度的小鼠免疫试验
用无菌PBS将浓缩后的多肽TB60配成不同的浓度,均配以EMULSIGEN水包油佐剂,A、B、C、D组分别以25,50,100,200 μg/mL对小鼠进行免疫, 以PBS为对照( E组) ,免疫方案及检测方法同1. 8。
2结果
2. 1基因的设计与合成结果
设计合成的多肽TB60基因的碱基序列见图1。
TB60基因全长为203 bp,包括T、B细胞表位的60个氨基酸的编码序列、两表位间的Pro - Gly接头、 1个终止密码子、两端的EcoR Ⅰ和Not Ⅰ识别序列及其保护性碱基。
2. 2重组酵母表达载体的构建及鉴定结果
TB60基因定向克隆到酵母表达载体,获得重组酵母表达载体pGAPZαA - TB60。用P1和P2引物进行PCR鉴定,扩增产物经1. 0% 琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为200 bp的单一条带( 见图2) ,最后对重组质粒进行测序,结果表明,TB60基因成功插入表达载体。
2. 3表达上清液的Tricine - SDS - PAGE分析结果
收集阳性重组酵母的表达上清液,然后进行Tricine - SDS - PAGE分析,结果表明,阳性菌株表达产物在蛋白分子质量约为8. 0 ku处出现1条明显的特异性蛋白条带,而阴性对照组无此条带( 见图3) 。 说明目的多肽TB60在毕赤酵母X33中成功获得分泌表达。
M. DL - 2 000 Marker; 1，2. 重组质粒的 PCR 扩增产物;3. pGAPZαA 空质粒的 PCR 扩增产物。
M.超低低分子质量蛋白MarkerⅡ(3.5~26.6 ku);1.重组酵母pGAPZαA-X33;2,3,4.重组酵母pGAPZαA-TB60-X33。
2. 4表达上清液产物的Western - blot检测结果
将阳性重组酵母的表达上清液经Tricine - SDS - PAGE分析后,进行Western - blot检测,结果表明,阳性菌株表达产物在蛋白分子质量约为8. 0 ku处出现了1条特异性的条带,而在阴性对照相应的位置无此条带( 见图4) ,说明表达产物与猪O型FMDV阳性血清发生了特异性的抗原抗体反应,表达产物具有良好的反应原性。
2. 5表达上清液中多肽TB60浓度的测定结果
用Gene RAY UV - Photometer核酸蛋白质分光光度计测得不同时间表达上清液的总蛋白浓度,其中表达时间为96小时时重组酵母菌表达上清液总蛋白的浓度最高,达到180 mg/L。通过光密度扫描仪分析蛋白胶后,计算得TB60浓度达70 mg/L。
2. 6小鼠免疫试验抗体的检测结果
通过ELISA检测试剂盒检测各组每次免疫后的第10天血清中特异性抗体的含量,初步确认多肽TB60具有生物学活性,结果见图5。
在一免后的第10天,A( 多肽进口佐剂) 组、B( 多肽) 组及C( 合成肽) 组均产生了一定水平的抗O型FMDV抗体,二免、三免后抗体水平进一步提高。 A( 多肽进口佐剂) 组的抗体水平高于B( 多肽) 组,说明EMULSIGEN水包油佐剂具有较好免疫增强作用,但这两组的抗体水平都明显低于C( 合成肽) 组。 2. 7不同多肽TB60浓度的小鼠免疫试验抗体的检测结果
M. 超低分子质量蛋白 MarkerⅡ( 3. 5 ～ 26. 6 ku) ; 1，2. 重组酵母pGAPZαA - TB60 - X33; 3. 重组酵母 pGAPZαA - X33 。
各组小鼠于每次免疫后的第10天采集血清进行抗体的检测,结果见图6。
由图6可以看出: 首免后的第10天,含有不同多肽TB60浓度的疫苗免疫小鼠后均产生了不同水平的特异性抗体,二免、三免后抗体水平逐步提高,显著高于E( PBS对照) 组( P <0. 05) ; 并且抗体水平跟多肽TB60浓度呈正相关,随着抗原多肽TB60浓度的提高,免疫后也产生更高水平的抗体。
3讨论
FMDV共有O、A、C和SAT1、SAT2、SAT3 ( 即南非1、2、3型) 以及Aisa1( 亚洲1型) 7个血清型,65个以上的亚型,并且在自然选择和免疫压力下,FM- DV通过外壳蛋白抗原表位的漂移变异来逃避宿主免疫系统的监视,随着这些变异的积累,FMDV新的亚型不断产生,各型之间彼此几乎没有交叉免疫力[1],给防治工作带来了很大的困难。目前,疫苗免疫在我国是最主要的也是最经济的手段,然而传统疫苗存在的缺陷促使人们去研究安全有效的新型口蹄疫疫苗,生物合成多肽疫苗便是研究的热点之一[7]。 通过基因工程技术将具有抗原活性的蛋白采用原核表达系统或者真核表达系统如酵母菌来获得而不是简单的化学合成。因为毕赤酵母表达系统有独特的优势,现有人白介素22 、乙肝表面抗原等200多种外源基因在该系统中表达[8],不乏每升克级以上的表达。本实验室也已成功表达了多种抗菌肽[9 -10]。
本试验选用毕赤酵母表达系统设计的多抗原表位基因含有当前FMDV流行毒株VP1上的T细胞表位( 21 ~40 aa) 和B细胞表位( 129 ~169 aa) ,以期获得免疫原性最佳的多肽。本试验结果表明,表达的多肽TB60成功分泌到培养上清液中,并且具有生物学活性,能刺激小鼠产生特异性的免疫应答。为了提高表达效率,试验采取了如下措施: 根据毕赤酵母密码子偏嗜性设计改造目的基因的核苷酸序列; 采用组成型的分泌表达载体pGAPZαA,无需甲醇诱导,避免了甲醇对酵母生长的影响; 再经过含不同浓度Zeocin抗性YPD培养基初筛及PCR复筛后,最终获得1株能耐受200 μg/mL Zeocin抗性的高拷贝克隆阳性重组酵母菌。通过以上措施,本试验中表达的目的多肽TB60约占培养上清液中可溶蛋白的39% ,达到70 mg / L,明显高于鲁会军等[6]的结果( 16%) 和胡博等[11]的结果( 21%) 。
抗原表位预测 篇5
预防羊痘主要依靠接种弱毒疫苗, 虽然其对控制羊痘的流行发挥了重大作用, 但其缺点和不足也逐渐显露。我国目前还没有诊断和监测羊痘的商品化试剂。近几年, 我国许多地方羊痘频频发生, 如何快速诊断并有效控制该病的发生和发展也日益成为各方面关注的热点[3,4,5]。近年来, 通过生物信息学及序列分析软件的预测可获得蛋白质的基因和氨基酸中蕴含的重要信息, 如抗原表位或与抗原表位相关的信息[6]。研究在对4株不同绵羊痘病毒毒株的ORF121基因序列对比分析的基础上, 根据ORF121糖蛋白肽链的亲水性、柔韧性、抗原指数及蛋白表面可及性等参数, 辅以ORF121糖蛋白二级结构分析, 综合预测了ORF121糖蛋白的B 细胞表位, 为羊痘新型疫苗的设计、诊断试剂的研制和单克隆抗体的筛选等方面奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 序列分析软件
DNASTAR软件由美国DNAS-TAR公司研制。
1.1.2 绵羊痘毒株ORF121基因序列
4株不同绵羊痘病毒毒株ORF121基因选自GenBank 核酸数据库, 登录号分别是EU310438、AY077832、AY077833、AY077834, 其中EU310438为绵羊痘甘肃景泰分离株。
1.2 方法
1.2.1 ORF121基因序列比对分析
应用DNASTAR软件的MegAlign程序对4株不同绵羊痘病毒毒株ORF121基因序列进行比对分析。
1.2.2 ORF121肽链亲水性、柔韧性、抗原性与表面可及性预测
以DNASTAR软件包中的EditSeq 程序将绵羊痘病毒的ORF121基因序列翻译成氨基酸序列, 然后用Protein 程序进行氨基酸序列分析, 并分别用Kyte-Doolttle方案预测ORF121 氨基酸的亲水性, 用Karplus-Schulz方案预测柔韧性, 用Jameson-Wolff方案预测抗原指数, 用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。各方案参数的意义见参考文献[7,8,9] 。
1.2.3 ORF121蛋白的二级结构预测
利用DNASTAR分析软件中的Protein 程序, 按Chou-Fasman和Gamier-Robson方案分析ORF121蛋白二级结构中的螺旋、折叠、转角及无规卷曲易形成区。各方案参数的意义见参考文献[10,11] 。
1.2.4 ORF121的B细胞表位综合预测
根据ORF121糖蛋白肽链的亲水性、柔韧性、抗原指数及蛋白表面可及性等参数, 辅以ORF121糖蛋白二级结构分析, 综合预测ORF121糖蛋白的B 细胞表位。
2 结果
2.1 ORF121基因序列比对分析
利用DNASTAR软件对4株不同绵羊痘病毒毒株 (包含1株甘肃景泰流行毒株) 进行序列比较分析, 结果表明, 4株绵羊痘病毒的核苷酸序列同源性达99%。鉴于ORF121基因的高度保守性, 选取登录号为EU310438的绵羊痘病毒甘肃景泰分离株的ORF121基因推导的氨基酸序列进行B细胞表位预测分析。
2.2 ORF121肽链亲水性、柔韧性、抗原性及表面可及性预测
通过DNASTAR软件Protean 程序中的Kyte-Doolittle方案分析和预测, 发现EU310438株ORF121的肽链中除0～24区段为疏水性区段外, 其余24～170区段均具有较强的亲水性, 其中35～46、76～82、160～167区段的亲水性最强, 见图1。
经Protein 程序中Karplus - Schulz 方案预测, 发现EU310438株ORF121有7个柔韧性区段, 其中35～45、54～83、90～124、130～139、144～158 和160～167区段的柔韧性较强, 易发生扭曲和折叠, 形成B细胞表位的机率相对较高。通过Jameson-Wolf方案分析, EU310438株ORF121肽链抗原指数较高的区域较多, 其中112～116、129～137和143～167区段的抗原指数最高, 37～45和143～167区段所跨区域最大, 提示这两个区段含有潜在的B细胞表位优势。经Emini方案预测, EU310438株ORF121肽链的33～45、78～83和159～167区段的表面可及性较高。见图2。
2.3 ORF121蛋白二级结构分析
通过Protein程序中Chou-Fasman和Gamier-Robson方案预测, 发现EU310438株ORF121肽链可形成α-螺旋区、β-折叠区、转角区或无规卷曲区, 其中在30～57、151～170区段可形成一定的空间构象, 形成B细胞表位优势区的可能性较大, 见图3。
A. α-螺旋区; B.β-螺旋区;T.转角区;C.无规卷曲区。
2.4 ORF121蛋白B细胞表位综合预测
将上述各种方案预测结果汇集, 见表1。经分析发现, 不同方案预测得到能形成B细胞表位优势区的数量及其所跨区域有所不同, 但对35～45区段和160～167区段, 各种方案的预测结果基本一致。由此认为, 35～45区段和160～167区段形成B细胞表位优势区的可能性最大。
3 讨论
SPPV ORF121为EEV糖蛋白, 其编码基因位于SPPV基因组的中间区域115～116 kb处, 其功能主要与病毒的转录、修饰RNA、病毒DNA的复制以及在胞内组装成熟、在胞外由蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子有关。序列比较分析结果表明, ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守, 可作为鉴别诊断绵羊痘病毒和山羊痘病毒的分子标记。
国内外有关羊痘诊断和疫苗的研究主要集中在P32蛋白上, 但现有的一些研究已证实, P32重组蛋白在大肠杆菌中的表达量很低, 用它作为疫苗或诊断抗原存在缺陷。因此, 寻找更好的抗原基因研制安全有效的基因工程疫苗、克服羊痘弱毒或灭活疫苗存在的不足迫在眉睫。本研究在前期对SPPV ORF121基因克隆的基础上, 进一步通过生物信息学及序列分析软件对其B细胞表位进行预测, 预测结果表明, 该蛋白肽链的35～45、160～167区段可能存在B细胞表位优势区, 推测该蛋白可能与病毒的抗原性有重要关系, 具有潜在的疫苗价值, 为下一步进行该基因的表达和免疫学研究奠定了基础。
研究采用多参数综合预测的方案在一定程度上提高了预测的准确性, 但由于表位特别是构象表位主要通过三维结构来体现其抗原性, 而生物信息学分析软件则是根据氨基酸序列及其二级结构进行预测。因此, 本试验的预测结果只能作为鉴定绵羊痘病毒ORF121蛋白潜在表位的参考, 预测结果正确与否还有待进一步试验证实。
参考文献
[1]BATTA MK, KATOCHR C, SHARMA M T, et al.Epidemiological observation on goatpoxin Himachal Pradesh[J].Indian Vet J, 1999, 76 (8) :683-684.
[2]WOLD EMESKEL M, ASHENAFI H.Study on skin diseases in sheep fromnorthen Ethiopia[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr, 2003, 110 (1) :20-22.
[3]BALINSKY C A, DELHON G, AFONSO C L, et al.Sheeppox virus kelch-like gene SPPV-019affects virus virulence[J].J Virol, 2007, 81 (20) :11392-11401.
[4]周碧君, 虞娟, 徐春志, 等.贵州省山羊痘病例的病原学鉴定与病理学观察[J].中国兽医科学, 2007, 37 (5) :382-385.
[5]BOWDENTR, BABIUKS L, PARKYNG R, et al.Capripoxvirustis-sue tropism and shedding:A quantitative study in experimentauy in fected sheep and goats[J].Virology, 2008, 371 (2) :380-393.
[6]SETTE A, FIFESY J.Epitope-based vaccine:an update on epitope identification, vaccine design and delivery[J].Curr Opin Immunol, 2003, 15:461-470.
[7]KYTE J, DOOLITTLE R F.Asimple method for displaying the hy-dropathiccharacter of a protein[J].J Mol Biol, 1982, 157:105-132.
[8]KARPLUS P A, SCHULTZ G.Prediction of chain flexibility in pro-teins[J].Naturwissenschaften, 1985, 72:212-213.
[9]JAMESON B A, WOLF H.The antigenic index:a novel algorithmfor prediction antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci, 1988, 4:181-186.
[10]CHOUP Y, FASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amimo acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1978, 47:45-48.
抗原表位预测 篇6
关键词：人IL-38,二级结构,B细胞表位
0 引言
白细胞介素(interleukin,IL)-38在皮肤、扁桃体、心脏、胎盘、胎儿肝、脾、胸腺等组织中都存在表达，但其在人心脏和胎盘等无免疫功能的组织中呈现低表达[1]。IL-38属于IL-1家族(IL-1 family,IL-1F)细胞因子的新成员，即为IL-1F10，也曾被称IL-1HY2[2]。人IL-38的基因位于2号染色体上，与IL-1家族其他成员相接近，且其基因序列与IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)、IL-36Ra有较高的同源性[1]。它是IL-36R的部分受体拮抗剂，与牛皮癣、关节炎、强直性脊柱炎等多种炎症性疾病的发病机制有密切关联[3,4,5,6,7,8,9,10,11]。目前，国内外对IL-38的研究较少，关于其具体的生物学特征及功能等都欠缺了解。本研究将从基因库中人IL-38的基因序列出发，推导其氨基酸序列，再利用多种分子生物学软件对其蛋白进行生物信息学分析，以便从分子水平了解IL-38蛋白的生物学特征及功能，并对其B细胞抗原表位进行分析与预测，从而为以后对IL-38基因及其表达产物进行深入研究奠定基础，并将为制备IL-38的单克隆抗体提供重要理论依据。
1 材料与方法
1.1 序列来源
人IL-38基因序列来源于Gen Bank(序列号AY029413.1)。
1.2 生物信息学分析
从NCBI提供的蛋白数据库中获得人IL-38蛋白的一级氨基酸序列(Protein ID:ENSP00000376893)。组成及理化特性应用Prot Param tool程序(http://web.expasy.org/protparam/)进行预测[12,13]。应用SOPMA网上在线程序(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=npsasopma.html)对IL-38的二级结构进行预测[14]。应用Prot Scale程序预测IL-38的亲水性、柔韧性(http://web.expasy.org/protscale/)Swiss Prot:Q8WWZ1。应用Emini程序对IL-38的可及性的进行分析(www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred)[15]。抗原位点按Kolaskar方案进行分析(http://www.imtech.res.in/cgibin/bcepred/bcepred.pl)。最后，对各个分析方案的结果进行综合评估，取其重叠的肽段区域，这些公共的重叠区域即为潜在的B细胞优势抗原表位。
2 结果与分析
2.1 人IL-38基因及其编码产物序列
人IL-38基因序列长459 bp。其编码产物约为152个氨基酸，序列如下:
2.2 IL-38的组成及理化特性分析
应用Prot Param tool程序进行编码产物氨基酸的组成分析，结果如图1。分析发现，编码产物由19种氨基酸组成，含量最多的为A(丙氨酸)、E(谷氨酸)、L(亮氨酸)，且比例均达到了9.2%。其次为G(甘氨酸)，所占比例为7.9%。而P(脯氨酸)和S(丝氨酸)的含量也都达到了6.6%。但该编码产物无H(组氨酸)。同时，软件预测此表达产物的分子量约为16.9 k Da，半衰期约为30 h，理论等电点约为5.0，分子简式为C757H1164N198O226S9。
2.3 IL-38的二级结构分析
应用SOPMA在线程序对IL-38的二级结构进行分析，结果显示，IL-38蛋白质分子的二级结构主要由无规则卷曲(44.08%)、β-折叠(39.47%)、β-转角(9.21%)和α-螺旋(7.24%)组成(图2)。其中β-转角和无规卷曲在序列中主要位于1-7、14-17、23-25、30-36、45-55、62-65、72-78、92-98、104-109、115-119、124-131、136-143和150-152位氨基酸区域，无规则卷曲和β-折叠的分布则较为均匀。
c:无规则卷曲;e:β-折叠;t:β-转角;h:α-螺旋。
c:Random coil;e:Extended strand;t:β-turn;h:α-helix.
2.4 IL-38亲水性、柔韧性、可及性等单参数的预测
2.4.1 亲水性
根据Hopp&Woods方案，按照其氨基酸的亲水性分析标准，我们对人IL-38蛋白质分子的亲水性进行分析，结果显示，亲水性较高的区域主要集中于15-29、32-52、68-98、106-112、126-147等氨基酸区段(图3)。
2.4.2 柔韧性
根据Average flexibility的氨基酸柔韧性标准，分析IL-38的柔韧性，结果如图4。其中12-34、45-69、74-98、105-116和126-145等肽段为柔韧性较高的区域。
2.4.3 可及性
按Emini可及性标准，获取IL-38的可及性，结果如图5。可及性较高的区域为6-25、49-55、74-101和126-149肽段。
2.5 B细胞表位的预测
按Kolaskar方案进行分析显示，B细胞抗原表位可能为26-33、40-48、53-61、78-84和128-135等位点。在对抗原表位进行选择时需满足以下几个条件[16]:第一，最理想的抗原性识别区域一般应具备亲水性、且位于蛋白表面和结构上具备易变形性等特点;第二，抗原要连续;第三，应具有β-转角二级结构;第四，序列的长度建议在13～20个氨基酸残基之间为宜。各参数分析的结果汇总如表1。
虽然根据不同参数预测的可能作为潜在B细胞表位的肽段区域在位置上并不完全一致，但根据以上条件综合分析得到了26-36、45-55、78-98和124-143等基本符合条件的四个肽段，这些肽段具有较高的亲水性，同时都位于(或富含)β-转角和无规则卷曲的二级结构区段，并且与具较高柔韧性、可及性的肽段也有重叠。因此，IL-38的B细胞表位可能为上述四个肽段。
3 讨论
B细胞抗原表位的预测基于对B细胞表位结构的研究，是通过对蛋白质的理化性质和二级结构的分析，利用其理化性质或二级结构与B细胞表位的相关性，进行综合分析而达到预测目的方法[17]。30多年前Michael Sela的经典实验[18]证实:蛋白质的B细胞表位通常位于空间构象上能够被相应抗体及B细胞(BcR)所触及的蛋白质表面。蛋白质的二级结构很大程度上决定了蛋白质表位的分布。α-螺旋、β-折叠通常处于蛋白质内部，空间上不易被接触。β-转角、无规则卷曲多位于蛋白质表面，为突出结构，结构上易变形性强，利于与抗体及BcR嵌合，因此它们所处肽段为抗原表位的可能性较大。目前为止，在预测蛋白质分子B细胞表位中最常用和最有效的方法是先对蛋白质分子的亲水性和可及性进行分析，然后进行综合评估。蛋白质的亲水性和可及性区域是形成抗原表位的前提，也是作为B细胞表位判定的首要条件。
抗原表位的形成是一个在多因素共同作用下而产生的复杂结果，所以仅凭某个相关单参数进行的预测结果，其准确率往往较低。因此，本研究应用Pro Scal等服务器上的相应软件和SOPMA软件，通过对二级结构与亲水性、柔韧性和可及性等多参数的综合分析来预测IL-38的B细胞表位，克服了单参数预测的局限性，提高了预测的准确性和可靠性[19]。经过结合上述多参数分析等结果和抗原表位选择的基本条件的综合考虑，人IL-38的B细胞表位可能位于26-36、45-55、78-98和124-143这四个肽段区域内或其附近。
