E2基因克隆（精选三篇）
E2基因克隆 篇1
猪瘟 (CSF) 是一种严重危害养猪业的烈性传染病, 被OIE列为A类传染病。由于CSFV不易培养, 效价低, 难以纯化, 存在着潜在散毒的危险, 致使生产的CSF抗原产量有限而成本较高, 难以满足国内CSF诊断和免疫检测的需要[3]。因此, 研究一种成本低廉、应用简便、安全不散毒、敏感性高而特异性好的检测猪瘟血清抗体水平的方法具有重要意义。与完整的病毒粒子相比, 病毒重组蛋白具有无感染性易于生产和纯化等优势[4]。
1 材料
1.1 质粒和宿主菌
包含模板的质粒p POcsfv DNA, 由成都军区病毒研究所李作生博士惠赠, 在云南农业大学微生物实验室保存;大肠杆菌DH5α、Rosetta菌株和p ET28a载体, 均由云南大学单克隆抗体中心马岚老师惠赠, 在云南农业大学微生物学实验室保存。
1.2 主要试剂
Two Step RNA PCR Kit、Premix Taq Kit、LA Taq、Ex TaqTM、EcoRⅠ及Bam HⅠ, 宝生物工程 (大连) 有限公司生产;小量质粒柱式提取试剂盒, 生工生物工程 (上海) 股份有限公司生产。
1.3 主要仪器
Sartorius电子天平 (型号为BS210S) , 北京科创百方科技公司生产;PCR仪, Thermo Hybaid公司生产;电泳槽 (型号为DYCP-31B) 、垂直板电泳槽 (型号为DYCZ-24D) 、稳压稳流电泳仪 (型号为DYY-2C) 、荧光-紫外分析仪 (型号为WD-9403A) , 北京六一仪器厂生产;凝胶成像系统 (型号为GEL-Doc XR) , 伯乐生命医学产品 (上海) 有限公司生产。
2 方法
2.1 基因的PCR扩增
对包含模板的质粒p POcsfv DNA进行PCR扩增, 反应体系为50μL, 采用热启动法。PCR反应条件:95℃热变性5 min;95℃变性50 s, 55℃退火50 s, 72℃延伸20 s, 共25个循环;72℃再延伸4 min;4℃保存, 备用。
2.2 质粒和PCR产物的酶切
用限制性内切酶Bam HⅠ及EcoRⅠ对E2基因的PCR产物和质粒p ET28a进行双酶切, 经胶回收后用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.3 重组质粒的转化和阳性菌落的筛选
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中, 然后对重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切鉴定及DNA测序。
2.4 重组质粒表达条件的优化
对筛选出的含重组质粒的培养物于37℃振荡培养, 当OD值达到0.4~0.6时加入不同浓度的IPTG, 37℃诱导5 h;然后取表达产物进行SDS-PAGE分析, 确定最佳IPTG诱导浓度;再向培养物中加入IPTG至最佳诱导浓度, 37℃振荡培养;取诱导不同时间 (1, 2, 3, 4, 5, 6 h) 的表达产物进行SDS-PAGE分析, 确定最佳诱导时间。
2.5 诱导表达产物的Western-blot检测
用最佳诱导条件对重组转化菌进行诱导表达, 然后按照《分子克隆实验指南》中的方法进行Westernblot检测。
3 结果与分析
3.1 E2基因的PCR扩增 (结果见图1)
由图1可知, 在1 000 bp附近扩增出E2基因片段, 与预计大小1 050 bp相符, 扩增具有良好的特异性和重复性。
3.2 重组质粒的PCR鉴定结果
对1#和2#重组质粒分别进行PCR扩增, 结果1#和2#重组质粒在1 000 bp附近扩增出1条明显的条带, 与预计大小1 050 bp相符, 结果见图2。
3.3 重组质粒的酶切鉴定结果
用限制性内切酶Bam HⅠ及EcoRⅠ对1#和2#重组质粒分别进行双酶切鉴定, 结果2#重组质粒酶切后得到1条大小约为1 000 bp的片段, 这与预计结果1 050 bp相符, 见图3。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.猪瘟病毒E2基因的PCR产物。
M.DL-2 000 Marker;1.1#重组质粒PCR产物;2.2#重组质粒PCR产物。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.重组质粒。
3.4 SDS-PAGE分析 (结果见图4)
由图4可知, 在还原变性胶条件下, 诱导样品在41.0 ku附近有1条明显的表达条带, 此蛋白分子质量与重组E2的理论分子质量相符。对照泳道无表达条带, 因此可初步确定这些条带为特异性表达蛋白质。
3.5 Western-blot检测 (结果见图5)
由图5可知, 与对照泳道比较, 诱导样品中有1条明显的杂交条带, 而在对照泳道中没有, 确定这些条带为特异性表达蛋白质。
4 讨论
经过长期的研究, 人类对大肠杆菌的特性和遗传背景了解最清楚。大肠杆菌表达系统与酵母、昆虫、植物、哺乳动物表达系统相比, 具有明显的优越性:大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉, 因此易于进行工业化批量生产。目前, 大肠杆菌表达系统中较为成熟的表达系统有Lac、Tac、PL、PR和T7表达系统。在本试验中, 由于考虑到靶基因是病毒的一个基因, 其自身的复制、转录和翻译都受原核复制和表达的调控, 因此作者选用了大肠杆菌表达系统中T7表达系统, 并选用原核表达载体中p ET系列的p ET28a作为表达载体。
M.蛋白质Marker;1.转化重组质粒的大肠杆菌Rosetta菌株于37℃诱导4 h表达的E2蛋白;2.转化重组质粒的大肠杆菌Rosetta菌株于37℃诱导5 h表达的E2蛋白;3.对照。
M.蛋白质Marker;1.重组质粒p ET28a-E2;2.对照。
本试验选用的表达宿主菌为大肠杆菌Rosetta菌株, 其可以促进这些菌株胞质中二硫键的形成, 进而影响目的蛋白的可溶性及活性。如果目的蛋白中含有二硫键, 其目的基因还同时包含稀有密码子, Rosetta菌株是最佳的选择。
本试验通过对CSFV糖蛋白E2基因主要抗原区进行克隆, 扩增出大小约为1 050 bp的目的基因片段, 将其与表达载体连接进行原核表达, 所获结果与预期一致, 这为E2基因表达的进一步研究提供了依据。由于E2基因的可变性和相对保守性及其在致病性、病毒复制和转录过程中的作用, 可通过其在体外大量表达作为诊断抗原, 亦可用其制备抗血清及单克隆抗体进行疾病诊断;此外, E2基因的克隆与大量表达, 为进一步研究该病毒的亚单位疫苗奠定了基础。
参考文献
[1]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社, 1997.
[2]HULST M M, HIMES G, NEWBIGIN E, et al.Glycoprotein E2 of classical swine fever virus:expression in insect cells and identification as a ribonuclease[J].Virology, 1994, 200 (2) :558-565.
[3]苏小运, 缪德年, 许立华, 等.猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化及其应用[J].中国病毒学, 2003, 18 (2) :164-168.
我国率先克隆出水稻功能基因等 篇2
前不久，我国在水稻分蘖分子遗传学机制研究和功能基因克隆技术方面取得重要突破。中国水稻研究所青年科学家钱前博士领导的课题组，与其他科学家合作，分离鉴定出水稻分蘖控制基因ＭＯＣＩ，它能调节水稻分蘖芽的形成及正常生长发育。（浙江）
中国黄牛生下世界顶尖良种奶牛后代
５月３１日上午９时５分，一头世界顶尖良种高产奶牛经过剖腹产诞生在中国农科城杨凌金坤生物工程股份有限公司（邮码：７１２１００，电话：０２９－７０９８６２１）。这头种牛的胚胎是美国胚胎移植协会援赠给我国的７５枚冷冻胚胎中，最早被培育生产出来的小宝贝。（陕西齐永茂）
油菜新品种产量创新高
陕西省咸阳市农科所（邮码：７１２０３４，电话：０９１０－３１１８２４２）华德钊研究员育成的秦优双低９８０２油菜新品种，前不久通过陕西省品种审定，并创造出双低油菜６６７平方米（１亩）产量达２８５．４公斤的国内最高记录。
该品种的芥酸、硫甙含量，均优于国内和国际双低油菜籽质量标准，还具有抗油菜菌核病和病毒病的优势。（陕西毛苹）
四川甘薯育种获突破性进展
四川省南充市农科所（邮码：６３７０００，电话：０８１７－２８０２７２８）选育的甘薯新品种“南薯９９”，前不久通过了国家甘薯品种鉴定。
专家认为，南薯９９综合性状优良，属兼用型甘薯新品种，具有高产、抗黑斑病、耐储藏等突出优点。（四川叶伟达）
让老鼠“计划生育”的疫苗问世
一种可以使老鼠“计划生育”的疫苗，经过新疆大学生命科学与技术学院（邮码：８３００４６，电话：０９９１－８５８３２５９）张富春教授等人三年攻关，前不久宣告试验成功。
注射该疫苗后，在活动正常的情况下，一胎能产下１０只小鼠的高产“妈妈”，现在只能产３～４只。与传统的化学毒杀方法相比，这种方法不会产生二次中毒，不会伤害有益或无害生物。（新疆王慧敏）
湖北选育出桑树新品种
湖北省农科院果茶蚕桑研究所（邮码：４３００６４，电话：０２７－８７３８９４３６）邓文教授选育的桑树新品种“鄂育１号”，前不久通过湖北省品种审定。
“鄂育１号”树型直立，发条数较多，枝条长而直，是早生早熟品种，发芽率９５％以上，叶片数春为４０５～４２９片，秋为２０４～２４０片。（湖北董梁）
杜鹃花新品在昆明诞生
中国科学院昆明植物研究所（邮码：６５０２０４，电话：０８７１－５２２３６３０）张长芹研究员主持的“杜鹃花的抗性育种及新品种选育研究”，前不久获得了云南省２００２年科技发明三等奖。
猪瘟病毒E2基因研究进展 篇3
1 CSFV的基本特征
CSFV属黄病毒科瘟病毒属, 呈球形, 核衣壳为12 面体对称, 有囊膜, 为不规则形状的纤突。是一种单股正链RNA病毒, 基因组大小为12.3 kb[1,2,3], 整个基因分为3 个部分, 两头为5′-UTR和3′UTR端非编码区, 中间编码区含有1 个大的开放阅读框 (ORF) 能编码3 898 个基因, 编码了8 种非结构蛋白, 4 种结构蛋白。CSFV不耐热, 温度对CSF病毒粒子的存活时间有很大的影响, 低温度存活时间长。在p H值5.0~10.0 的环境中稳定存活, 过酸或过碱都能迅速失活。对乙醚和氯仿等敏感, 快速失去传染性。CSFV能增殖在多种哺乳动物的细胞中, 但是产生不了肉眼可见的病变, 常用的增殖培养细胞为PK-15 细胞、PK-2a、ST细胞和猪睾丸细胞。CSFV相对其他病毒抗原性比较保守, 但是毒力变化大, 且具有不确定性。
2 E2 基因和E2 蛋白结构的特征
E2 基因是CSFV的主要免疫原性结构基因, 基因序列的变异率在3%~25%[4], 是CSFV基因中变异较大的之一。E2基因编码的E2 蛋白 (也称gp 55) 是一种结构蛋白, 含有5个N-糖基化位点, 由于糖基化的程度不同, 分子量范围51~58 k Da。蛋白的有无糖基化对CSFV的毒力和免疫原性有很重要的影响。E2 蛋白含有4 个抗原结构, A区、B区、C区和D区[5,6], 是CSFV一种主要的抗原结构蛋白[7], 存在于病毒粒子的表面, 保守相对较低, 相对容易变异。能诱导机体产生中和抗体, 抵御强毒CSFV的攻击。因此, E2 基因是研究猪瘟新型疫苗的首选, 其编码的E2 蛋白也是建立血清检测方法的首选。
3 CSFV E2 基因的基因分型研究进展
通过对病毒基因序列的分析比较, 进行遗传分型, 分析不同毒株之间的关系, 还可以评估CSFV的流行和传播。对分离于一系列CSF流行暴发区域的毒株, 分析比较其遗传相关性, 并确定其变异速度, 是对基因分析最好的理解。还能追踪病毒传播的类型, 找出防控工作中的漏洞。CSFV的E2 基因是国际分型常用区, 是监测和分析CSFV传播的有效方法。CSFV只有一个血清型, 分为3 个基因型 (Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型) , 11 个亚群 (Ⅰ型为1.1~1.4;Ⅱ型为2.1~2.3;Ⅲ型为3.1~3.4) [8,9]。王博杨等[10]收集了我国12 个省107 份猪瘟组织样品, 通过E2 基因序列测定分析, 48 株为基因Ⅰ型中的1.1 亚群, 59 株为基因Ⅱ型中的2.1b和2.1c亚群。谭颖翌[11]通过对1986—2011 年间广西的77 株猪瘟E2 基因的比较分析, 发现全部为基因Ⅰ型和Ⅱ型, 未发现Ⅲ型, 说明广西的猪瘟流行毒株主要为Ⅰ型和Ⅱ型。姚敬明等[12]研究分析了山西省5 株CSFV毒株的E2 基因, 结果表明:4 株为基因Ⅱ型, 1 株为基因Ⅰ型。在基因分型的基础上建立遗传系统进化树, 可以了解各个毒株之间的关系, 并且还可以了解其分布区域和传播的地点。CSFV还可以进一步分为亚群, 增加对CSFV流行和演化的了解, 更好地掌握CSFV的分子生物学特性。
彭志成等[13]研究分析了广东省16 株CSFV流行毒株的E2 基因序列, 15 株为2.1 亚群, 另外1 株为1.1 亚群。2.1 亚群中尚未发现2.1a亚亚群, 是首次报道2.1b和2.1c亚亚群在该地区流行。王启宇[14]分型鉴定6 株山东CSF流行毒株的E2 基因, 结果表明:此6 株山东流行毒株属于基因Ⅱ型, 与Guang XI株有一定的亲缘关系, 同属一个基因2.2 亚群。Lin T[15]通过对103 份猪瘟组织样品E2 基因序列测定分析, 大部分为1.1 亚群和2.1 亚群, 仅有3 株为2.2 亚群。根据分析的基因型或基因亚群, 能了解某地区CSFV的流行毒株情况, 有针对性地监测某地区流行基因型或基因亚群, 对CSF防控具有重要的作用。
4 CSFV E2 基因遗传变异研究进展
