关键词： 疫苗
疫苗佐剂（精选四篇）
疫苗佐剂 篇1
一、传统疫苗佐剂
氢氧化铝作为常用佐剂, 目前是国际卫生组织FDA唯一批准人用疫苗使用的一种。氢氧化铝佐剂是Al+的无机盐, 主要存在形式有Al (OH) 3、Al PO5。氢氧化铝胶佐剂常以类似胶体形式存在, 简称铝胶, 因而成为兽医生物制品生产中应用最广的一种佐剂, 低毒, 价廉, 而且效果比较稳定。铝佐剂的作用机制比较复杂, 普遍认为是形成抗原复合物, 形成稳定抗原结构, 存在于动物体内, 随着作用时间的延长抗原复合物逐渐解离, 并且解离释放速度取决于复合物形成速度。铝佐剂无T细胞免疫刺激性, 这一特性限制了该佐剂在细胞类免疫疫苗中的使用。在实际应用过程中发现铝佐剂引起注射部位局部炎症反应, 个别导致畜禽应激性反应严重, 还可能对动物体的神经系统造成伤害, 甚至死亡。虽然经过长时间的应用, 铝佐剂已经获得兽医和人医的推广应用, 但是它保存时不能使用低温, 否则使用后疫苗容易变性失效, 不能有效增强细胞免疫应答, 主要适用于免疫能力强和可大量生产的抗原, 具有一定的局限性。
二、中药成分作为疫苗佐剂的研究现状
中药作为疫苗佐剂的研究目前主要集中在中药单体成分研究 (皂苷、多糖等单体有效成分) 和中药复方制剂研究两方面。很多补益类中药提高免疫功能, 单味中药或其有效成分与疫苗起到协同作用, 对于机体免疫力提高效果明显, 作用比较显著。
(一) 中药皂苷类成分应用于疫苗佐剂。
来源于中药的皂苷类成分在疫苗佐剂中的应用比较多, 研究较深入。皂苷是广泛存在于植物、低等海洋动物和某些细菌中的一类甾体或三萜配糖类物质。许多皂苷类成分都具有佐剂活性, 且副作用较低。近年来以单体作为佐剂的研究也屡有报道, 最多的是人参提取物皂苷类, 根据水解后苷元结构主要分为四环三萜、五环三萜类和甾体皂苷, 补益类中药人参、远志、柴胡、黄芪等都含有此类成分。据报道人参皂苷Rb1和抗原混合物免疫动物后, 未见任何不良反应, 血清抗体滴度提高幅度显著, 滴度增加快, 效果明显优于对照组。人参皂苷Rb1与灭活PPV (猪细小病毒) 免疫豚鼠, 能够明显提高豚鼠血清抗体水平, 并且对禽流感油乳剂灭活苗有较强的免疫增强作用。孙建华报道人参皂苷Rg1诱导小鼠产生Th1和Th2类免疫应答的特异性抗体亚类和细胞因子, 在八种达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb1、Rd、Rc、Re、Rg1、Rg2和Rg3中, Re、Rgl、Rg2和Rg3具有较高的佐剂活性。SHu等应用人参浸提物及人参皂苷Rb1作为疫苗佐剂防治奶牛金黄色葡萄球菌, 免疫效果较好, 添加人参浸提物或Rb1能够显著增强免疫效果, 对抗体滴度的提高和免疫细胞的增殖都有显著提高。谢勇发现桔梗皂苷对于增强免疫效果具有协同作用, 作为新型疫苗佐剂有良好的发展前景。其它诸如远志皂苷、黄芪皂苷、牛膝皂苷研究发现均有开发成疫苗佐剂的可能。
(二) 中药多糖成分应用于疫苗佐剂。
多糖类物质作为中药有效成分之一, 含量丰富, 种类较多, 免疫活性较强, 能显著提高机体的细胞免疫和体液免疫功能, 具有较强的补益作用。马德慧比较中药佐剂疫苗和普通疫苗对雏鸡体液免疫功能和生产性能的影响, 实验表明, 中药佐剂组免疫效果和持续时间都明显要好, 刺激机体产生抗体速度要比普通油乳剂灭活苗组快。枸杞子多糖、女贞子多糖、香菇多糖、猪苓多糖、当归多糖、灵芝多糖、淫羊藿多糖等都具有明显增强机体免疫的功能, 能促进增殖免疫系统T细胞和B细胞的作用。中药多糖对IL-1、IL-2, 干扰素 (IFN) 、肿瘤坏死因子 (TNF) 等细胞因子有诱生作用。商陆酸性杂多糖、牛膝多糖、APS、人参多糖、柴胡多糖、刺五加多糖、银耳多糖、当归多糖等, 甘草多糖可单独诱生人全血细胞及单个核细胞IFN。冬虫夏草中含有的多糖脂质体可明显增强免疫作用, 作为中药类免疫佐剂具有进一步研究的前景。
(三) 中药复方应用于疫苗佐剂。
中药复方是在中医理论的指导下, 以君、臣、佐、使的组方原则, 通过方内诸药配伍调节药物之间的关系来调整组合药力, 很多研究报道中药复方也可作为佐剂, 有增强疫苗免疫的效果, 例如当归补血汤、四君子汤、玉屏风散、小柴胡汤等。玉屏风散、四君子汤、金鸡散、黄连解毒汤等复合佐剂与疫苗配合使用, 动物机体红细胞中超氧化物歧化酶活性显著提高, 抗体滴度提高。复方中药对动物疫苗具有协同作用, 有研究表明中药佐剂复方在多个时间点的抗体效价显著高于无佐剂组, 显示中药复方具有较好的佐剂作用, 作为疫苗佐剂具有一定发展潜力。
三、中药及其组分应用于疫苗佐剂的前景
中药应用于疫苗佐剂具有研究潜力, 特别是补益类中药材, 比如人参、党参、黄芪、红景天等, 能提高机体免疫力, 促进新血管生成, 与疫苗起协同作用。我国天然药物资源丰富, 应用历史悠久, 有着独特的中医药学理论, 中药是我们的宝贵资源, 充分认识和合理利用中药资源是我们科学工作者的责任和光荣使命。相信随着现代生物科学的发展, 对免疫反应机理的进一步认识, 以及多学科的交叉, 具有安全、稳定、高效的理想中药疫苗佐剂将被不断开发出来。
参考文献
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佐剂在弓形虫疫苗中的应用 篇2
1 佐剂的作用
佐剂用于增强机体对抗原的免疫反应已有70多年的历史。佐剂发挥的机制至今还不清楚，其效应可以： (1) 提高弱抗原免疫原性； (2) 提高免疫反应的速度，延长免疫反应的时间； (3) 影响抗体的亲和性，特异性类和亚类分化； (4) 刺激细胞免疫反应； (5) 增强粘膜免疫反应； (6) 提高未成熟或衰老个体的免疫应答； (7) 降低抗原用量和疫苗费用； (8) 在使用联合疫苗时有助于克服抗原之间的竞争[1]。
2 目前弓形虫疫苗中应用的佐剂
2.1 福氏佐剂
福氏佐剂包括福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA），是科研中最常用的佐剂。FCA含灭活的分枝杆菌，既能刺激体液免疫又能刺激细胞免疫；FIA则仅能刺激体液免疫。福氏佐剂在使用中引起慢性肉芽肿和经久不愈的溃疡，造成严重的组织损伤，只能用于动物实验。尽管如此，福氏佐剂的强免疫刺激作用使之在科研仍被广泛使用。目前动物实验中福氏佐剂潜在的副作用受到了关注。黄炳成等[2]报道福氏佐剂能增强弓形虫P30/35亚单位疫苗刺激肌体产生免疫应答和保护性免疫力的效果。
2.2 霍乱毒素（CT)
是由霍乱弧菌产生的一种分子量为84ku的肠毒素，由1个A亚单位（CT-A）和5个B亚单位（CT-B）形成的共价连结五聚体。CT及其CT-B均具有较强的免疫佐剂作用。由于CT有肠毒性，限制了其作为免疫佐剂的作用，因此研究的重点转向了无毒性的CT-B。研究发现[3]，CT-B用作口服抗原，能刺激粘膜和胃的淋巴细胞以及粘膜1gA抗体反应，可和为胃肠道寄生虫疫苗的免疫佐剂，进一步研究表明，当CT-B经化学方法或基因融合技术与不相前抗原形成偶联蛋白或者融合蛋白时，免疫活性大大高于单独使用CT-B。HuangY[4]应用无毒性的霍乱毒素A2/B (CTXA2/B）亚基作为免疫佐剂，能有效增强P30蛋白的免疫原性，可以增强免疫作用，打破免疫耐受，是研制高效的弓形虫疫苗的理想佐剂。马广源[5]等用STAg联合CpG ODN和/或CT鼻内免疫小鼠可有效诱导机体免疫反应, 两种佐剂联合免疫的效果优于单一抗原或抗原联合单一佐剂。
2.3 脂质体（Iiposome)
是单层磷脂或由数层可溶性物质隔开的呈同心圆状排列的连续多层磷脂所组成的脂质小囊，内含水相空间。它既是抗原载体，也是免疫佐剂[6]。脂质体的结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质体并破坏其膜结构，释放抗原并形成免疫复合物，有利于维持长时期的高效价抗体及产生免疫记忆，脂质体在宿主体内可以生物降解，降低抗原的毒性，无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果更佳，陈晓光等[7]报道适当比例的编码弓形虫主要表面抗原的质粒DNA：脂质体混合能显著增强弓形虫DNA疫苗的免疫效果。目前，脂质体和免疫刺激复合物被认为是制备亚单位疫苗的理想载体和免疫佐剂。
2.4 拟菌颗粒
是一种用特殊工艺去除了长型双歧杆菌Bif6°-1表面抗原成分而保留了细胞壁骨架结构、细菌DNA核酸等有效成分的佐剂。双歧杆菌是无毒性的人体益生菌，含丰富的LTA、肽聚糖以及高比例、高度重复的非甲基化CpG为核心的免疫刺激序列（ISS），故能够吸附抗原，增强疫苗蛋白的抗原性，并可以激活MΦ、NK细胞以及其他多种免疫效应细胞使之产生一定的IL-2、IFN-r、TNFa、GMP等，从而提高疫苗抗原的免疫效果[8]。拟菌颗粒能协助P30/35抗原产生细胞免疫和体液免疫均较理想[2]且无毒副作用，可用于弓形虫亚单位疫苗的研制。
2.5 蜂胶
研究证明，蜂胶具有广谱的生物学活性，是一种天然免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫系统和增强丙种球蛋白活性，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。但黄炳成等[2]报道蜂胶佐剂较拟菌颗粒，脂磷壁酸佐剂，作用较弱，不能较好的增强弓形虫P30/35抗原刺激机体，产生细胞免疫和体液免疫。
2.6 细胞因子
用细胞因子和疫苗或抗原同时注射机体，可使该疫苗或抗原低应答或无应答者产生有效免疫应答。动物实验表明，细胞因子的佐剂效应对胸腺依赖性抗原和非依赖性抗原都是有效的。1种细胞因子能促进多种不同抗原诱生免疫应答。IL-12是一种具有多种生物学活性的免疫效应细胞刺激因子，近年来深受关注，被认为是最有希望成为佐剂进入临床试验的细胞因子之一，它能诱导活化T细胞和NK细胞增殖，并促其产生IFN-r等细胞因子；其活性在需要ThI型免疫应答的疾病中是有重要意义[9]，在寄生虫（特别是细胞内寄生虫）感染中，IL-12具有强大的免疫保护作用。已经在利什曼原虫、疟原虫、弓形虫和血吸虫感染的试验中获得一定的效果。用作佐剂的细胞因子还有干扰素（IFN），肿瘤坏死因子（TNF），集落刺激因子（CSF）及转移生长因子（TCF）等，殷国荣等[10]研究TSO联合IFN-r鼻内免疫小鼠诱导的弓形虫IgA抗体特异性免疫应答优于TSO或IFN-r单独免疫，产生高水平的弓形虫特异性IgA抗体发挥抗弓形虫使用。
2.7 核酸佐剂CpGDNA
CpGDNA是含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸DNA。CpG基序是具有较强免疫活性的以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为5′-purpur-CG-pyrpyr-3，也称为免疫刺激序列。GpGDNA能在动物体内诱生强烈的免疫反应，主要包括激活NK细胞和巨噬细胞；刺激B淋巴细胞增殖、分化及产生免疫球蛋白，诱导分泌IL-6、IL-12、IFN-r等多种细胞因子，诱导抗体诱生的细胞凋亡。人工合成的CpG寡核苷酸精炼了细菌DNA的有效成分，只有增强细胞免疫和体液免疫的双重效果。国外Spencer JA等[11]报道使用CpG作为佐剂可以增强弓形虫疫苗的免疫效果。国内石荣等[12]研究用CpG ODN作为STAg的佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱异黏膜部位产生高水平IgA抗体, 且可持续较长时间。
2.8 基因佐剂
郭虹等[13]构建IFN-r基因真核表达重组质粒作为基因佐剂观察其与pcDNA3-ROP1 (pc-ROP1) 重组质粒DNA共同免疫小鼠所诱导抗弓形虫免疫应答，证明IFN-r基因佐剂具有协同pcROP1 DNA免疫的作用，可增强免疫鼠细胞免疫应答，IFN-r、IL-2细胞因子及NO的产生。陈观今等[14]报道SAGI和IL-2基因佐剂混合免疫诱导鼠体内产生lgG 2a水平升高和IFN-r的产生。周永安等[15]将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100?g的剂量感染小鼠证明SAG3表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显上升，IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平的升高和IFN-7的产生，提高了其分泌IL-2的水平，但对IL-4的水平产生轻微的影响。
3 佐剂研究发展趋势
牛磺酸作为乙肝疫苗佐剂的效果评价 篇3
1 对象和方法
1.1 对象
2009年5月,选择幼儿园2~5岁完成3针基础乙肝疫苗接种后抗-HBs滴度<10 IU/L的学龄前儿童403名,并随机将儿童分为A、B两组分别进行接种。
1.2 材料
牛磺酸由深圳海王制药公司生产,安慰剂为白色葡萄糖粉末,两者均采用双盲法服用。乙肝疫苗由深圳康泰生物制品股份有限公司生产的重组酵母乙肝疫苗,每支剂量为10μg,均在有效期内使用。
1.3 接种方案
A组(191人)为疫苗+安慰剂组,即于检测后次日和30天后分别接种乙肝疫苗各1针,并于免疫的前一天和当天分别给予口服安慰剂,每天12 g分3次服(每次4 g);B组(212人)为疫苗+牛磺酸组,即于检测后次日和30天后分别接种乙肝疫苗各1针,并于免疫的前一天和当天分别给予口服佐剂牛磺酸,每天12 g分3次服(每次4 g)。两组乙肝疫苗接种剂量均为10μg/针,接种部位均在上臂三角肌内。
1.4 检测及判定标准
每个对象接种完成30天后采集静脉血2 ml,分离血清,于-20℃冻存,应用放射免疫法进行检测。判定标准:抗-HBs滴度<10 IU/L为无应答,抗-HBs滴度≥10 IU/L为有效应答。接种成功的判定标准:免疫前抗-HBs滴度为<10 IU/L,而免疫后抗-HBs滴度为≥10 IU/L。
1.5 统计分析
原始数据核对后经Epi Data 3.0录入数据库,采用SPSS13.0软件进行统计分析,率的比较用χ2检验,均数比较应用t检验。
2 结果
2.1 两组免疫成功率比较
检测结果显示,A组研究对象接种乙肝疫苗30天后,血清抗-HBs滴度≥10 IU/L的有169人,接种成功率为88.5%;而B组研究对象接种30天后,有203人血清抗-HBs滴度≥10 IU/L,接种成功率为95.8%,高于前者,两者差异有统计学意义(χ2=4.83,P<0.05)。
2.2 两组血清抗体滴度比较
两组受试者接种后均在一定程度上产生了免疫反应,其中:A组血清抗-HBs滴度最小值为0.93 IU/L,最大值为692.51 IU/L,平均数为132.47 IU/L(Sd=23.73);而B组血清抗-HBs滴度最小值为1.01 IU/L,最大值为753.83 IU/L,平均数为173.47 IU/L(Sd=24.84),高于A组血清抗-HBs滴度平均水平,两者差异有统计学意义(t=2.93,P<0.05)。
2.3 接种后副反应情况
全程接种均在我们有效的监控之下,监控发现:A组有1名儿童在第二针接种后接种部位出现直径<2 cm的红肿硬结,无其他严重接种反应,副反应发生率为0.5%;B组无人出现红肿、呕吐等副反应情况,副反应发生率为0,两组差异无统计学意义(χ2=0.00,P>0.05)。
3 讨论
乙型肝炎因其传染性强、难以治愈等特点而成为严重危害人类健康的三大顽症之一,给人类带来了巨大的危害。尽管人类使用乙肝疫苗对抗乙型肝炎病毒已经很多年了,但是,依然发现有部分人对乙肝疫苗存在不应答或者低应答的现象,这可能与受种者自身的遗传特性、免疫状况和乙肝病毒隐性感染有关[5],也使得乙肝疫苗的接种遇到了新的问题。免疫佐剂以其有效性和安全性在对抗乙型肝炎感染、提高乙肝疫苗免疫原性中发挥着重要的作用,越来越受到人们的青睐。近年来关于乙肝疫苗佐剂的研究进展迅速,也取得了很大的进展[6]。现在世界上最广泛使用的佐剂为铝佐剂,研究表明[7,8],它在注射部位形成储库,缓慢释放抗原,通过激活补体进而刺激免疫功能细胞,诱导红细胞和巨噬细胞的激活,诱发机体产生TH2型的体液免疫应答等。虽然铝佐剂能不同程度地提高乙肝疫苗的免疫原性,也相对安全,但是它对早期细胞免疫、阻断病毒婴儿传播并不能发挥有效作用[9],且易出现一些副反应[10]:红斑、肉芽肿及接触性超敏等。因此,研究新型的乙肝疫苗佐剂以代替目前使用较广的铝佐剂显得尤为必要。
牛磺酸作为人类和哺乳动物体内重要的氨基酸也能对机体的免疫应答产生一定的作用,国外研究表明,牛磺酸可使对HBsAg无反应的小鼠出现免疫应答。曹志然[11]也发现,牛磺酸能显著刺激小鼠脾内B淋巴细胞的增殖,增强其B淋巴细胞的溶血素抗体的分泌,调节实验动物的免疫功能。除了动物实验外,我国朱启等[12]人发现,使用牛磺酸可提高人体抗-HBs的应答能力。基于此,本研究在2007年的基础上进一步对2~5岁学龄前儿童进行了调查研究,发现牛磺酸能提高机体乙肝疫苗接种成功率,与国内外研究一致。此外,我们通过比较两组儿童接种后体内抗体水平还发现,服用牛磺酸佐剂组的儿童体内能产生更高水平的抗体,从而从抗体滴度的水平更好地阐述了牛磺酸对提高乙肝疫苗免疫原性的作用。
因此,在婴幼儿和儿童乙肝疫苗接种中,牛磺酸作为乙肝疫苗佐剂,不仅可以提高疫苗的效应,减少接种次数,还因其口感好、价格实惠和副反应低等因素能增加患者的顺应性,可大大提高全程接种覆盖率,是一种具有潜在优势和发展前景的乙肝疫苗佐剂。
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副猪嗜血杆菌灭活疫苗佐剂的筛选 篇4
关键词：副猪嗜血杆菌,灭活疫苗,佐剂
副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病,是由副猪嗜血杆菌引起的猪多发性浆膜炎和关节炎,主要感染4~8周龄的断奶仔猪,发病率一般10%~15%,严重时死亡率可达50%。由于药物滥用导致该菌的耐药性越来越普遍,采用疫苗免疫成为预防副猪嗜血杆菌病经济而有效的途径。在副猪嗜血杆菌灭活苗的研制中,选用能显著提高体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力起着重要作用。兽用疫苗使用的常规佐剂主要有铝胶佐剂、白油佐剂和蜂胶佐剂等。由于各个佐剂自身的性质不同,其刺激机体产生抗体及通过缓释作用延长抗体维持时间的机制亦不尽相同,所以选择不同佐剂制成的疫苗,其免疫效果势必会有差别。本试验将铝胶、白油和蜂胶3种佐剂分别与副猪嗜血杆菌血清5型菌株(H.parasuis Nagasaki strain)制备的抗原配合,制成灭活疫苗免疫家兔,再通过测定抗体消长水平来筛选出免疫增强效果较好的佐剂。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株、培养基及试验动物
副猪嗜血杆菌(HPS)血清5型菌株(H.parasuis Nagasaki strain)由澳大利亚昆士兰州动物研究所惠赠。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购于上海夏盟基因生物技术有限公司,新生小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购于杭州天和微生物试剂有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购于青岛海博生物技术有限公司。成年雄性家兔12只,购于四川省实验动物专委会养殖场。
1.1.2 佐剂及其制备
白油(Marcol52)购自Exxon Mobil公司;司本80(span-80)、吐温80(Tween-80)购自Crode Singapore公司。白油佐剂的制备:白油94%、Span-80 6%、硬脂酸铝2%、Tween-80 2%,按比例将白油和Span-80混合,再按比例加入2%硬脂酸铝加热熔化混匀,116℃高压灭菌30 min备用。
铝胶佐剂购自中牧集团成都药械厂,Al(OH)3含量约为2%。蜂胶购自四川省养蜂站,蜂胶佐剂的制备:取蜂胶1份粉碎、过筛,按1∶4(w/v)加入95%乙醇,18~25℃浸泡24~48 h,冷却,过滤或离心取上清,即得透明粟色纯净蜂胶浸液,以干物质计算配成30 mg/m L溶液,4℃保存备用。
1.1.3 ELISA检测方法主要试剂及制备
副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5抗原:根据副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5基因设计特异性引物后,对该基因进行克隆及原核表达,并对表达产物进行定量及纯化;兔抗H.parasuis阳性高免血清的制备:制备副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5弗氏完全佐剂疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗,使蛋白终浓度为1 mg/m L。按一定程序免疫制备。兔抗H.parasuis阴性血清为未免疫抗原的空白对照。
包被缓冲液(p H 9.6,0.05M碳酸盐缓冲液):Na2CO31.59 g,Na HCO32.93 g加蒸馏水至1 000 m L;洗涤缓冲液(PBST):KH2PO40.1 g,Na2HPO4·12H2O 1.45 g,Na Cl4.0 g,KCl 0.1 g,Tween-20(0.05%)0.25 m L,蒸馏水500 m L;底物缓冲液配制:0.2 M Na HPO4·12H2O(71.6 g/L)25.7 m L,0.1 M柠檬酸(21 g/L)24.3 m L,蒸馏水50 m L;抗体稀释液(p H 7.4)配制:BSA 0.1g,PBST 100 m L;封闭液配制:10%脱脂奶粉10 g,洗涤缓冲液100 m L;底物显色液(联苯二胺液)配制:底物缓冲液50 m L,联苯二胺20mg,双蒸水50m L,30%H2O20.15m L;终止液(0.2 mol/L H2SO4)配制:蒸馏水178.3 m L,逐滴加入浓度为98%的浓硫酸21.7 m L。
HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白购自北京中杉金桥生物有限公司。
1.2 方法
1.2.1 抗原的制备
将副猪嗜血杆菌血清5型参考菌株在添加了5%小牛血清及2%NAD的TSA平板上复苏,24h后挑取单个菌落,接入TSB培养基中,37℃、5%CO2、180 r/min振荡培养12~16 h。再将此菌液按1%比例加入新配制的TSB液体培养基中,于相同条件下培养24 h后收集菌液。按TSB液体培养基总体积加入0.3%甲醛灭活,置37℃振荡培养箱中灭活11~13 h。灭活后,将抗原浓度调整至5×109 CFU/m L。
1.2.2 副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备
白油佐剂灭活苗的制备:按抗原体积加入终浓度为4%的灭菌吐温80,边加边搅拌,至完全溶解,制成灭活疫苗水相。水相与白油佐剂的比例为1∶1。将白油佐剂在高速搅拌器中缓慢搅拌乳化3~5 min,然后再取相同体积的水相缓慢加入,开动电机乳化,直至乳化完全。疫苗制备完成后进行疫苗的黏度及稳定性测试,无菌检验。
铝胶灭活苗的制备:将铝胶佐剂与抗原等体积混合即可制备成副猪嗜血杆菌铝胶灭活疫苗,并进行无菌检验。
蜂胶灭活苗的制备:将蜂胶佐剂与抗原等体积混合就可制备成副猪嗜血杆菌蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验。
1.2.3 免疫方法及血样采集
将雄性家兔12只随机分为4组,每组3只。第1~3组分别为白油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂试验组,第4组为无佐剂的抗原对照组。试验组与对照组均进行背部皮下多点注射(1 m L/只),对照组每只注射与试验组等量的抗原。各组在首免后15 d后进行第2次免疫,二免后15 d进行第3次免疫。第2、3次免疫的剂量及注射方法与首免相同。各试验组在第2、3次免疫前及第3次免疫15 d后进行耳缘静脉采血,5 000 r/min分离血清后作抗体效价检测。
1.3 ELISA检测副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5抗体效价
1.3.1 包被及封闭
用0.05 mol/L p H 9.6的碳酸盐缓冲液将外膜蛋白抗原稀释至15μg/m L,包被酶标板,每孔100μL,4℃吸附过夜,次日用洗涤缓冲液洗涤3次,每次3 min,甩干后用10%脱脂奶粉封闭,每孔100μL,37℃2 h,用洗涤缓冲液洗涤5次。
1.3.2 加样
将待检抗体稀释至10倍、100倍、1 000倍、2 000倍、4 000倍、8 000倍、16 000倍、32 000倍、64 000倍、128 000倍,分别加入已封闭好的96孔酶标板,每孔100μL,同时设立兔抗H.parasuis高免血清阳性对照及阴性对照孔,37℃作用1 h。洗板3次,拍干;然后加入1∶2 400稀释的HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白,每孔100μL,37℃作用1 h,洗板3次。
1.3.3 显色
加入新鲜配制的OPD-H2O2底物显色液,每孔100μL,避光显色20 min;加入终止液,每孔50μL,终止反应。
1.3.4 测OD值
用酶标测定仪测定各孔450 nm的OD值,计算P/N值。P/N≥1.5为阳性,阳性孔所对应的稀释倍数即为待检家兔血清的效价。
2 结果
2.1 疫苗的物理性状及无菌检验
白油佐剂疫苗属油包水剂型,为乳白色液体。铝胶佐剂属混悬佐剂,疫苗呈白色凝胶状态。蜂胶佐剂与抗原混合后呈乳浊状。这3种佐剂配制成的疫苗,其稳定性、黏稠度、物理外观、无菌检验等指标均符合要求。
2.2 白油、铝胶、蜂胶佐剂灭活疫苗的安全性
3种佐剂组的家兔在每次免疫后精神及采食情况良好,无不良反应。白油组及铝胶组的家兔在每次免疫后注射部位出现硬块,但随试验动物的生长而消失。蜂胶佐剂组在免疫期间注射部位未出现红肿、硬块等现象。
2.3 抗体监测
3个试验组在注射疫苗15 d后都产生抗体;无佐剂对照组此时也产生了低滴度的抗体。免疫后30 d(即二次免疫后),白油组平均抗体水平显著上升,并在免疫后45 d,即三免后达到最高,平均抗体效价为1:4 000;铝胶组的抗体水平在免疫后30 d开始上升,于三免后达到1∶700;蜂胶和无佐剂对照组在整个免疫期间,抗体水平无明显差别。详见图1。
3 讨论
3.1 不同佐剂免疫注射的局部反应
经试验观察,注射白油佐剂的试验组家兔在免疫后注射部位肌肉会出现硬块,铝胶佐剂组家兔注射部位出现的硬块体积小于白油佐剂组,但都随家兔生长而消退。蜂胶佐剂组家兔在整个免疫过程中,注射部位未出现红肿、硬块等反应。可见用这3种佐剂制备的副猪嗜血杆菌疫苗无明显的副反应。这可能与白油及铝胶佐剂的物理性质有关,白油和铝胶佐剂能够在注射部位形成肿块,使得抗原在注射部位形成暂时的储存体,从而缓慢释放抗原,起到持续刺激机体产生抗体的作用。但另一方面,白油佐剂和铝胶佐剂也因为本身的这一特点,在疫苗注射过程中易出现黏度大、注射困难、毒副反应较强(过敏)、注射部位红肿、化脓等现象。从本试验可以看出,蜂胶佐剂在体内安全无毒,便于吸收,是一种安全的佐剂。
3.2 不同佐剂加强免疫效果的差异
油佐剂是目前兽用灭活疫苗中应用最为广泛、效果最为可靠的佐剂之一,在注射部位形成抗原储存体并缓慢释放抗原,从而连续刺激机体产生高滴度的抗体。铝胶佐剂也可在注射部位形成抗原储存体,但是其释放抗原物质的效应较弱,因而佐剂活性较低。蜂胶佐剂含有多种生物活性物质,配合抗原注射到体内时,其某些成分也可以起到佐剂的作用。但是蜂胶佐剂的剂型较多,不同工艺指标的蜂胶佐剂对免疫作用的影响程度也不一样。
从本试验结果可见,对副猪嗜血杆菌灭活苗的免疫增强效果最好的是白油佐剂,铝胶次之,蜂胶最差,这一试验结果与3种佐剂的特性基本相符。目前,虽然也有用蜂胶佐剂配合副猪嗜血杆菌灭活苗制备成功的报道,但是本试验中蜂胶佐剂的免疫促进作用并不明显,推测可能是由于试验用蜂胶杂质含量多且复杂,其有效成分含量难以标准化,以及蜂胶产地不同造成其有效成分含量也不同所致。
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