心脏成纤维细胞

关键词：

心脏成纤维细胞（精选十篇）

心脏成纤维细胞 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

出生1～3 d的SD大鼠,由河北医科大学动物中心提供。醛固酮、螺内酯、胰蛋白酶、牛血清白蛋白(Sigma公司);DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco公司);TGF-β1多克隆抗体和纤维连接蛋白单克隆抗体(Santa Cruz公司)。PCR试剂盒(Ta Ka Ra公司);TGF-β1EIA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)。

1.2 心脏成纤维细胞的培养和鉴定[2]

在无菌条件下开胸剪取SD大鼠心室,用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得心脏成纤维细胞。实验采用已传2～4代的心脏成纤维细胞,SABC法免疫组织化学染色,纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的心脏成纤维细胞。

1.3 实验分组

待细胞生长至亚融合状态时,以1%牛血清白蛋白培养液培养预适应24 h后,根据实验分组要求换用加入各种处理因素的1%牛血清白蛋白培养液继续培养。实验分为两部分,第1部分分组为醛固酮(10-7 mol/L)0、1、2、4和8 h组;第2部分分组为正常对照组,醛固酮组(10-9、10-8和10-7 mol/L),醛固酮(10-7 mol/L)+螺内酯组(10-6 mol/L)和螺内酯组(10-6mol/L)。

1.4 细胞培养液中TGF-β1的水平

应用ELISA法,按照试剂盒说明书操作。

1.5 心脏成纤维细胞中TGF-β1的含量

裂解液裂解细胞后取上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,每孔上样50μg总蛋白。利用水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上,室温下封闭2 h后,加入1∶500的一抗稀释液,4℃过夜,用TPBS液洗3遍;再加入1∶6 500的HRP标记二抗稀释液,室温振摇1 h后用TPBS液洗3遍;DAB显色后用凝胶成像分析系统进行分析,以对照组电泳条带作为参照,结果以积分吸光度的比值表示。

1.6 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达

TGF-β1引物(上游5'-AATACGTCAGACATT CGGGAAGCA-3',下游5'-GTCAATGTACAGCTCCG TACACA-3')扩增片段498 bp,GAPDH引物(上游5'-AATGCATCCTGCACCAA-3',下游5'-GTAGC-CATATTCATTGTCATA-3')扩增片段515 bp。PCR反应条件:TGF-β1:94℃变性45 s,48℃退火45 s,72℃延伸90 s;GAPDH:94℃变性45 s,48℃退火45s,72℃延伸90 s,32个循环。PCR产物于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳,用BIO-PROFIF凝胶图像分析系统进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。

1.7 统计学处理

数据以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行数据分析处理,多个样本均数间的比较用方差分析,多个样本均数间的两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平的变化

与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用心脏成纤维细胞48 h,培养液中TGF-β1的水平明显增加,且呈剂量依赖性(P>0.05、P<0.01和P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用48 h后,培养液中TGF-β1的水平与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变培养液中TGF-β1的水平,见附表。

注:1)与对照组比较,P<0.01;2)与醛固酮(10-7 mol/L)组比较,P<0.01

2.2 心脏成纤维细胞中TGF-β1含量的变化

与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用24 h,心脏成纤维细胞中TGF-β1的含量明显增加,且呈剂量依赖性(P>0.05、P<0.01和P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用24 h后,心脏成纤维细胞中TGF-β1表达与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变TGF-β1的表达,见附表、图1。

1:对照组;2:醛固酮(10-9 mol/L)组;3:醛固酮(10-8 mol/L)组;4:醛固酮(10-7 mol/L)组;5:醛固酮+螺内酯组;6:螺内酯组

2.3 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的时间效应

在1%牛血清白蛋白心脏成纤维细胞培养液中加入醛固酮(10-7 mol/L)后0、1、2、4和8 h,分别测定TGF-β1m RNA表达水平。结果显示:在4 h时TGF-β1m RNA表达明显增加(P<0.01),8 h达高峰(P<0.01),见图2。

与对照组(0 h)比较,P<0.01

2.4 心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的变化

与正常对照组相比,醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)作用8 h,TGF-β1m RNA表达明显增加,且呈剂量依赖性(P<0.01);以螺内酯(10-6 mol/L)预处理2 h后,再加入醛固酮(10-7 mol/L)作用8 h后,TGF-β1m RNA表达与醛固酮(10-7 mol/L)组相比显著降低,而与对照组相比无明显差异;同时,单独使用螺内酯(10-6 mol/L)并不改变TGF-β1m RNA的表达,见附表、图3。

1:对照组;2:醛固酮(10-9 mol/L)组;3:醛固酮(10-8 mol/L)组;4:醛固酮(10-7 mol/L)组;5:醛固酮+螺内酯组;6:螺内酯组

3 讨论

慢性心力衰竭患者醛固酮水平升高,并且高水平的醛固酮是其死亡率增加的独立预测因子,表明醛固酮在心力衰竭的损伤中起重要作用[3,4]。心脏成纤维细胞占心脏容积的25%和心脏细胞总数的70%,越来越多的证据显示心脏成纤维细胞是醛固酮的主要效应细胞。一些在体研究发现醛固酮促胶原合成的作用不是即刻的,而需要数周的时间,提示醛固酮促心肌纤维化作用可能是间接的,ROM-BOUTS等通过心脏成纤维细胞体外培养实验,进一步证实了这一假设[5]。研究显示醛固酮拮抗剂螺内酯可抑制心脏成纤维细胞增殖[6],改善心肌梗死后心室重建大鼠的左室收缩和舒张功能,并伴有心肌TGF-β1基因表达水平显著下调[7]。醛固酮拮抗剂依普利酮可减轻扩张型心肌病大鼠,血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠和鸟苷酰环化酶-A基因编码缺陷小鼠心肌纤维化,减少心肌胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的合成,这一效应与其降低心肌中高表达的TGF-β1基因和蛋白质水平密切相关[8,9,10]。同时,CHUN等人[11]的实验表明TGF-β1中和抗体能够抑制醛固酮的促心肌纤维化作用。这些研究提示醛固酮诱导的心肌纤维化可能与TGF-β1过度表达密切相关。本实验发现醛固酮能剂量依赖性地诱导心脏成纤维细胞TGF-β1m RNA表达以及TGF-β1的合成和分泌。鉴于TGF-β1过度表达在促心肌纤维化中的重要作用,本实验进一步支持TGF-β1是醛固酮促心肌纤维化作用的潜在介导因子。本实验还发现醛固酮的上述作用可被MR的拮抗剂螺内酯所阻断,而单纯给予螺内酯对心脏成纤维细胞无明显影响,表明醛固酮的这种作用可能是通过其特异性受体盐皮质激素受体介导的。

盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯可减少慢性心力衰竭患者心肌细胞外基质含量,降低主要心脏事件的发生率[12,13]。本实验结果从细胞、m RNA和蛋白水平观察到醛固酮通过盐皮质激素受体调控心脏成纤维细胞TGF-β1m RNA的表达,以及TGF-β1的合成和分泌,并呈剂量依赖性增加,为临床应用盐皮质激素受体拮抗剂治疗慢性心力衰竭提供了一定的实验依据。

摘要：目的探讨醛固酮对心脏成纤维细胞转化生长因子β(1TGF-β1)的影响。方法采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取新生大鼠心脏成纤维细胞,应用ELISA、Western-Blot、RT-PCR的方法分别测定不同条件下心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平和心脏成纤维细胞中的TGF-β1含量,以及TGF-β1mRNA的表达。结果醛固酮(10-9、10-8和10-7mol/L)可剂量依赖性地促进心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达以及TGF-β1的合成和分泌,同时醛固酮(10-7mol/L)以时间依赖的方式促进TGF-β1mRNA的表达,在作用4h后表达开始增加,8h达高峰。提前给予螺内酯(10-6mol/L)能抑制醛固酮(10-7mol/L)的上述作用。结论醛固酮能促使心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达以及TGF-β1的合成和分泌,且此作用可能是通过盐皮质激素受体介导的。

心脏成纤维细胞 篇2

2008-06-19 00:00 来源：丁香园

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知识总结

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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials 注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

网友crepi 的观点：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友baichangming的观点：

MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

心脏成纤维细胞 篇3

【关键词】 关节炎，类风湿；成纤维样滑膜细胞；潜在性治疗手段；综述

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.10.018

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性、系统性、炎症性及自身免疫功能障碍性疾病，主要表现为进行性、对称性、多发性关节炎，部分患者伴有不同程度的全身症状。在我国发生率约为0.32%～0.36%，世界范围内高达0.5%～1.0%[1]。RA主要病理表现为滑膜细胞增生，衬里层增厚，炎性细胞浸润（T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞等），形成血管翳，大量的滑膜细胞和破骨细胞侵入相邻关节的软骨和软骨下骨造成关节破坏[2]。RA成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte，RA-FLS）是滑膜细胞的主要组成部分，被越来越多的学者作为研究RA的主要靶向细胞，本文着重对近年来国内外相关研究报告及文献进行综述。

1 炎性因子对RA-FLS的影响

近些年研究发现，一些炎性因子通过核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信号通路，刺激FLS的侵袭[3]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一种具有多种生物活性的炎性介质，在RA发病机理中居于重要地位。RA患者关节液中TNF-α水平与关节炎的严重程度呈正相关，TNF-α可使RA-FLS凋亡障碍，并产生多种炎症细胞因子[如白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8]以及刺激基质金属蛋白酶（matrixmetall oproteinases，MMPs）的高表达，是RA病变持续存在、迁延进展的关键因素[4]。

NF-κB信号途径参与调节多种炎性因子和细胞粘附因子的表达，在RA发病中起到重要作用，如在RA-FLS中过表达IκBa，能抑制NF-κB的活性，进而下调促炎因子的表达水平[5]。罗心静等[6]

在实验中证实，RA-FLS受TNF-α刺激后能诱导细胞中转录因子NF-κB的核移位，导致NF-κB信号通路活化。由此可见，通过抑制TNF-α不仅能减少IL和MMPs的分泌，还对信号通路产生一定的影响，最终极大地延缓RA的进程。Lin等[7]研究发现，在RA-FLS中分别给予药物环格列酮和15D-PGJ2的情况下，能分别抑制TNF-α诱导的MMP-13水平上升（113.1±5.1）%和（95.5±4.5）%；它们可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）和p38-MAPK的调节进而衰减NF-κB信号途径的活化，被认定是治疗RA的一种潜在性手段。

IL-1和TNF-α是一对“姐妹因子”，共同影响FLS的增殖、存活及其他炎性因子产生，促进破骨细胞的活化和合成，在RA的发病机制中同样扮演重要的角色。因此，如何降低RA患者IL-1的水平，进而减缓其对软骨的破坏，也是目前研究的热点。尤欣等[8]以腺病毒为载体，将p53基因用于治疗IL-1β诱导增殖的RA-FLS，TUNEL染色虽未明确检测到细胞凋亡，但组织学分析显示大量浸润的炎症细胞消失。IL-6被认为是TNF-α生物效应的放大因子，能促进类风湿因子的表达，并介导前列腺素（PGs）的生成。IL-8、IL-17也是RA发病的重要炎症介质，具有强大趋化作用，能加速血管翳的形成、增强炎性细胞的浸润、调节淋巴细胞粘附分子的表达。因此抑制RA-FLS的促炎细胞因子IL-6、IL-8的产生也是防治RA的重要策略。研究发现，昆母汤醇提取物对TNF-α诱导的RA-FLS增殖中IL-6、IL-8表达有一定的抑制作用[9]。IL-17可通过诱导RA-FLS产生富半胱氨酸蛋白61（Cysteine-rich，Cyr61）从而促使RA-FLS增生[10]，因此Cyr61也是作为RA治疗的一个潜在靶点。越来越多人认为，IL-33对RA的发展也起到了重要作用[11]。Palmer等[12]通过实验证实，IL-33在RA患者的滑膜组织中高表达；IL-33的miRNA和蛋白也被发现在RA-FLS中有一定的表达，但其水平可能与IL-1β、TNF-α的诱导有关。实验表明，IL-33作用于缺乏ST2蛋白的小鼠模型中，不仅被证实可延缓胶原诱导关节炎的发展，还能减弱其他炎性细胞因子（IL-17、TNF-α和IFN-γ）的产生[13]。这些研究结果表明，特异性阻断IL-33/ST2通路可能是治疗RA的一种有效的手段。

2 MMPs对RA-FLS的影响

RA患者关节的进行性破坏主要由过度增殖的FLS分泌MMPs造成[14]。MMPs在体内主要降解细胞外基质（extracellular matrx，ECM），是调节ECM产生与消除的动态平衡中最重要的酶系，但其分泌异常则会造成关节的破坏。根据其作用底物的不同，MMPs主要分为胶原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13），基质溶解素（MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11），明胶酶（MMP-2、MMP-9）等5大亚型。研究证实，炎性因子介导RA-FLS的MMPs表达中涉及MAPK通路的活化[15]，TNF-α和IL-1β可通过活化转录激活因子-1（transcription activator-1，AP-1），使MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13高表达；同时MMPs基因启动子区均含有NF-κB的结合位点，所以NF-κB也参与了RA中MMPs的表达[16]，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）活化其受体可使其下游分子Smads复合物入核而结合MMP-1、MMP-3、MMP-13的启动子区来调控转录；此外，基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）作为MMPs的抑制物也能改变MMPs的分泌[17]。所以下调MMPs水平是用于治疗RA的合理靶标。由于MMP-1和MMP-3在骨破坏中起到更为重要的作用，它们也是实验研究中的关键。有学者发现，在IL-1β刺激RA-FLS后，金合欢素可以通过抑制p38、c-Jun氨基端激酶，影响NF-κB活动来降低MMP-1、MMP-3和MMP-13的基因和蛋白表达，从而达到预防关节破坏的目的[18]。

nlc202309011042

3 MicroRNAs对RA-FLS的影响

miRNA在免疫系统中发挥了重要的调节作用，能调控多种免疫过程，包括粒细胞发育、T和B细胞的成熟分化、抗原递呈过程以及细胞因子的产生等[19]。实验表明，miRNA在RA滑膜组织中表达异常，可通过影响炎性细胞因子进而造成或加重FLS病变。目前研究最多的miR-146a已被证实在RA发展过程中能激活先天免疫应答系统，并有效抑制破骨细胞形成[20]，成为当前研究RA中最关键的miRNA。此外还有很多miRNA也被证明在RA的进程中能起到十分重要的作用[21]，例如miR-155、miR-132、miR-16和miR-146a有类似功能，能调节TNF-α的产生；miR-203可通过活化MMPs，加重关节的损坏，与其相反，miR-155则能抑制MMPs的产生，两者之间相互拮抗；miR-124a可阻碍周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的产生并抑制RA-FLS的增殖，有望未来成为治疗RA的新靶点；miR-346通过间接调控IL-18的产生，减少对FLS的刺激。越来越多的miRNA表达改变与RA-FLS的异常增生密切相关，其必将成为以后RA科研的主攻方向之一。

4 诱导RA-FLS凋亡

鉴于FLS在RA发病发展过程中所起到的关键作用，诱导RA-FLS凋亡则成为治疗RA的一个有效策略，且在实验及临床中都得到了验证。细胞凋亡主要有2个途径：外源性途径通过配体结合细胞死亡的受体触发细胞凋亡；而另一条则是由遗传物质引发的内在线粒体途径。目前国内外鉴于如何诱导细胞凋亡也有许多文献报道。有学者观察运用丹参酮ⅡA诱导RA-FLS凋亡，实验结果显示，Bcl-2表达水平明显下降，线粒体细胞色素C、半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-9表达显著上升；同时凋亡酶激活因子-1、胞浆细胞色素C、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9水平表达的改变可证明丹参酮ⅡA诱导RA-FLS凋亡；并在流式细胞仪下检测药物干预RA-FLS在细胞周期G2/M期发生凋亡[22]。Lattuada等[23]运用抗肿瘤药物Smac066作用于RA-FLS 18 h后，细胞凋亡抑制蛋白1，2（CIAP1，2）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）显著下调，进而证实Smac066通过抑制激活蛋白酶途径有效地诱导RA-FLS凋亡。此外，许多药物同样被证明可有效干预RA-FLS细胞的凋亡，进而达到治疗RA的效果。

5 讨 论

鉴于RA-FLS在RA发病过程中所起的重要作用，抑制RA-FLS增殖并诱导其凋亡已经成为目前防治RA的主要研究方面。本文主要通过阐释炎性因子、MMPs、Micro-RNA与RA-FLS之间的关系及相互影响，并介绍如何诱导RA-FLS凋亡这4个方面对目前的研究成果进行总结分析，从这些机制理论出发，通过抑制RA-FLS的侵袭，为临床带来了更多治疗手段。抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-6等疗法可有效抑制RA-FLS的增殖，在临床上已被证明[24]。但部分患者经治疗后并无明显症状改善，同时还有增加感染及癌症风险的可能性[25]。炎性因子和RA-FLS能促使MMPs分泌，所以通过调控RA-FLS的增殖合并MMPs抑制剂的使用，将MMPs水平控制在合适的范围内，能减缓关节破坏程度。miRNA在RA-FLS病变中所起的作用越来越得到重视，部分miRNA的作用机制已得到初步阐明，但miRNA对靶基因的调节是一个复杂的网络体系，仍需大量科研人员的不懈努力[26]，相信未来可作为调控RA-FLS的主攻方向。诱导RA-FLS凋亡是目前治疗RA的关键指标之一，诱导细胞早期凋亡可改善RA病程的进展，目前诱导细胞凋亡的方法和药物有很多，但具体机制有些仍不清楚。

总之，影响RA-FLS的因素还有很多。在未来的研究中，可以通过调控与RA-FLS相关因素的水平来改变RA-FLS对关节的侵袭，从而尽可能找到根治RA的手段，目前对于RA-FLS的研究仍任重而道远。

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收稿日期：2015-04-23；修回日期：2015-07-06

心脏成纤维细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

恒温振荡器(THZ-C)购于中国江苏太仓试验设备厂;PCR仪购于ABI公司;GDS-8000凝胶成像分析系统购于美国UVP公司;DU70紫外分光光度计购于美国Beckman公司。胎牛血清购于中国北京索来宝公司;D-葡萄糖(分析纯)购于重庆北碚化学试剂厂,按浓度分为正常血糖浓度(5.5 mmol/L,NG)和高糖浓度(30 mmol/L,HG);Ros购于美国Santa公司;兔抗大鼠Ⅰ型前胶原抗体购于美国Santa公司;Trizol试剂购于SBS公司。

1.2 细胞提取及培养

日龄2~3 d Sprague-Dawley大鼠,雌雄不限,清洁级,由河北医科大学实验动物中心提供。剪取乳鼠心脏前1/3的心室部分,利用消化酶法及差速贴壁法去除未贴壁的心肌细胞,提取培养乳鼠心脏成纤维细胞,传代培养,实验用2~3代传代细胞。

1.3 分组及处理

将D-葡萄糖溶解、过滤除菌后加入6孔板中,每孔2 mL,配制分组,30 mmol/L高糖孵育6 h后,应用0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24 h,将细胞进行分组,其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12 h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响;另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响。另设HG模型组(仅HG干预)及空白对照组(0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG干预)。即8个分组分别为:(1)空白对照组(0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG);(2)HG模型组;(3)HG+10μmol/L Ros组;(4)HG+30μmol/L Ros组;(5)HG+50μmol/L Ros组;(6)HG+30μmol/L Ros 18 h组;(7)HG+30μmol/L Ros 24 h组;(8)HG+30μmol/L Ros 36 h组。

1.4 Real-timePCR检测Ⅰ型前胶原mRNA的表达

检测物(Ⅰ型前胶原)的引物序列全部由美国GeneCopoeia公司提供。Ⅰ型前胶原引物序列:上游5′-GGACCTGTG ATGTGCAAAGT-3′,下游5′-CACGGGTAATTCTGTTCT TC-3′,扩增片段418 bp;以β-actin作为内参照,引物序列:上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′,下游5′-ATCGTACTCCTGCTYGCTGA-3′,扩增片段232 bp。采用TRIZOL法遵照SBS公司相关说明书进行心脏成纤维细胞总RNA的提取:取适当稀释的RNA样品,用DU70紫外分光光度计测定所抽提RNA的浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。A260/A280=1.8~2.0方可使用,总RNA浓度=A260×稀释倍数×0.04(μg/μL),用前调整为1μg/μL。按M-MLV Reverse transcriptase操作说明合成cDNA第一链;取反转录产物进行Real-time PCR反应,反转录产物50倍稀释后按以下体系进行Real-time PCR反应:2×ALL-in-One qPCR Mix(10μL);ALL-in-One qPCR primer 2μL;1st strand cDNA(5倍稀释液)(2μL);50×Rox Reference Dye(0.4μL);ddH2O(5.6μL)Final Volume(20μL),反应条件:95℃10 s,60℃20 s,72℃15 s,反应40个循环,反应结束后,立即进行融解曲线分析。GDS-8000凝胶成像分析系统测定电泳条带的光密度值,根据Comparative Delta-deltaC法ΔΔCt=干预组(Ctm RNA-CtGAPDH)-对照组(Ctm RNA-CtGAPDH),利用2-ΔΔCt计算干预组mRNA光密度与对照组光密度的比值×100%。

1.5 Western blot分析检测Ⅰ型前胶原蛋白的表达

胰酶消化收集心脏成纤维细胞于离心管中,离心后加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA,离心后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量,分装上清用于加样。配制9%的分离胶及4%的浓缩胶,将总蛋白加至上样孔中,进行SDS-PAGE恒压电泳,染色转膜后,杂交、显色,用封闭液将一抗稀释(抗Ⅰ型前胶原1∶500)。包被一抗、二抗,膜用TBST液洗3次,每次5 min,采用ECL发光试剂盒显色。膜洗涤完毕置于保鲜膜上,滴加底物工作液后用保鲜膜包好,放入暗室。在暗室中将X光片小心地压到保鲜膜上,依顺序进行曝光、显影、定影。采用凝胶图像分析系统对吸光度进行测量。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析,正态分布计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用Student-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度罗格列酮对高糖诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA及蛋白表达的影响

基础生理状态下,体外培养的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白呈低表达,HG模型组Ⅰ型前胶原mR-NA[(109±11)%]和蛋白(1.57±0.02)的表达与空白对照组[(40±3)%、(0.82±0.04)]比较显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组[(91±9)%、(1.35±0.03)];HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组[(62±5)%、(1.08±0.04)],差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,Ros呈明显的浓度依赖性的下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表1、2及图1。

注:与空白对照组比较,(1)P<0.05;HG:高糖

注:与HG模型组比较,(2)P<0.05;与HG+10μmol/L Ros组比较,(3)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros组比较,(4)P<0.05;HG:高糖;Ros:罗格列酮

1:空白对照组;2:HG模型组;3:HG+10μmol/L Ros组;4:HG+30μmol/L Ros组;5:HG+50μmol/L Ros组;HG:高糖;Ros:罗格列酮

2.2 罗格列酮(30μmol/L)不同干预时间对Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白表达的影响

30 mmol/L的HG孵育心肌成纤维细胞6 h后,以含0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24 h,再加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h,结果显示,HG+30μmol/L Ros18 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组[(91±10)%、(1.31±0.07)];HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组[(67±6)%、(1.01±0.04)],差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,相同浓度Ros呈明显的时间依赖性下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表3及图2。

注:与HG模型组比较,(1)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros 18 h组比较,(2)P<0.05;与HG+30μmol/L Ros 24 h组比较,(3)P<0.05;HG:高糖;Ros:罗格列酮

1:HG模型组;2:HG+30μmol/L Ros 18 h组;3:HG+30μmol/L Ros 24h组;4:HG+30μmol/L Ros 36 h组;HG:高糖;Ros:罗格列酮

3 讨论

糖尿病合并心肌病患者的心肌损害包括心肌细胞及心肌间质细胞两个方面。已有的研究主要集中于心肌细胞的损伤,近年来,心肌间质的纤维化及其在糖尿病心肌病的发生、发展中的作用越来越多地受到研究者的重视。糖尿病患者的心肌纤维化进展到一定程度后会导致心室的收缩、舒张功能失调,加速心功能恶化,当心功能出现失代偿时便会出现心力衰竭症状。因此预防和减轻心肌间质胶原沉积及纤维化已成为糖尿病心肌病治疗的重要目标和手段。既往的研究显示,高血糖可导致心肌间质胶原蛋白沉积,从而导致纤维化。高血糖导致胶原大量沉积的机制为高浓度的葡萄糖一方面可促使胶原蛋白的糖基化,另一方面可降低胶原蛋白的降解,引起胶原沉积与心内膜下,导致心肌的纤维化及重构;另外,高血糖会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可上调致纤维化的细胞因子的表达[5],激活PKC信号系统的关键信号蛋白———成纤维细胞生长因子(FGF)的表达[6],而且高血糖可使转化生长因子-β(TGF-β)异常高表达,后者与其受体Ⅱ结合后可以诱导组织型基质金属蛋白酶抑制剂合成,抑制细胞外基质(ECM)的降解[7],加重心肌纤维化程度。

PPAR-γ作为一个重要的细胞分化的转录因子,在血管与心肌组织均有表达,它能调节糖和脂质代谢,发挥抗炎、抗氧化、抗增殖作用。Guo等[8]报道,上调PPAR-γ的表达后可以明显抑制肝星状细胞胶原蛋白的分泌作用,TZDs药物的典型代表——Ros主要通过活化细胞内的PPAR-γ、增加对胰岛素的敏感性来减轻肝脏、脂肪、肌肉等器官或组织对胰岛素的抵抗。研究报道,Ros通过降低血管紧张肽受体-1的表达[9,10],可部分阻断AngⅡ的促纤维化作用,从而减轻了胶原的聚集。还有研究显示,BDL大鼠用感染表达PPAR-γ的腺病毒载体后,ColⅠmRNA表达明显降低[13,14,15]。李洁等[16]研究发现,Ros可减轻胶原蛋白沉积,且这种作用不依赖于血糖的变化,其机制可能与阻断或下调NF-κB信号转导系统或肾素-血管紧张素-醛固酮系统有关。本研究的浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组;HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组,差异均有统计学意义(P<0.05)。本研究时间依赖结果显示,HG+30μmol/L Ros 18h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组;HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组,差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示,不同浓度或相同浓度Ros可明显下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达,提示Ros在抑制高糖刺激下心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达、抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。

综上所述,Ros对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节在浓度及时间上均呈现依赖关系,可能为临床糖尿病心肌病的有效预防和治疗提供新的思路与切入点。

摘要：目的 观察罗格列酮(Ros)对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节。方法 30 mmol/L高糖(HG)孵育新生大鼠心脏成纤维细胞,其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12 h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响;另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响;另设HG模型组(仅HG干预)及空白对照组[0.1%胎牛血清DMEM培养基+常规血糖浓度(NG)干预]各1组。应用Real-time PCR法测定心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达;Western blot检测Ⅰ型前胶原蛋白质的表达。结果 HG模型组Ⅰ型前胶原mRNA[(109±11)%]和蛋白(1.57±0.02)的表达与空白对照组[(40±3)%、(0.82±0.04)]比较显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度依赖性实验结果显示,HG+10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±9)%]和蛋白(1.35±0.03)的表达低于HG模型组;HG+30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(62±5)%]和蛋白(1.08±0.04)的表达低于HG+10μmol/L Ros组;HG+50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[(51±4)%]和蛋白(0.93±0.02)的表达低于HG+30μmol/L Ros组,差异均有统计学意义(P<0.05)。时间依赖结果显示,HG+30μmol/L Ros 18 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(91±10)%]和蛋白(1.31±0.07)的表达低于HG模型组[(109±11)%、(1.57±0.02)];HG+30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(67±6)%]和蛋白(1.01±0.04)的表达低于HG+30μmol/L Ros 18 h组;HG+30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[(42±4)%]和蛋白(0.87±0.01)的表达低于HG+30μmol/L Ros 24 h组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Ros可呈浓度和时间依赖性地下调高糖刺激下新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达,可能在抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。

心脏成纤维细胞 篇5

强脉冲光对培养的人成纤维细胞表达MMP-1和TIMP-1的影响

目的:观察强脉冲光照射对体外培养的成纤维细胞表达基质金属蛋白酶(MMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响,探讨IPL嫩肤作用的.分子生物学机制.方法:采用能量密度分别为20、25、30J/cm2的强脉冲光对培养的人成纤维细胞进行照射,于照射后24h及48h应用ELISA法测定上清液中MMP-1和TIMP-1的表达并与对照组比较.结果:照射24h后25及30J/cm2组上清液中检测到的MMP-1、TIMP-1含量轻度升高;48h时各能量组MMP-1均升高,但各组间并无显著性差异.TIMP-1随能量的升高而含量增高.结论:强脉冲光照射成纤维细胞后可引起MMP-1,TIMP-1表达的增加,但是TIMP-1的增加远远大于MMP-1的增加,提示IPL嫩肤作用的生物学机制可能与成纤维细胞产生的TIMP-1增加有关.

作 者：王永贤 刘平应朝霞 葛文娱 WANG Yong-xian LIU Ping YING Zhao-xia GE Wen-Yu 作者单位：西安交通大学第二医院皮肤科,陕西,西安,710004刊 名：中国美容医学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF AESTHETIC MEDICINE年，卷(期)：16(7)分类号：Q813.1关键词：强脉冲光 成纤维细胞 MMP-1 TIMP-1

心脏成纤维细胞 篇6

1 Materials and methods

1.1 Culture and identification of cardiac fibroblasts

Male Sprague-Dawley rats(1～3 days old)were purchased from the Animal Center,Hebei Medical U-niversity(Shijiazhuang,P.R.China).All experiment procedures were performed in accordance with the Guidelines of Animal Experiments from the Committee of Medical Ethics,Ministry of Health of P.R.China.Primary cultures of neonatal rat cardiac fibroblasts were isolated by trypsin digestion and different speed adherence as previously described[4].The cardiac fibroblasts were maintained in a 1∶1 mixture of Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12(DMEM/F12)(Gibco,USA)supplemented with 10%fetal bovine serum(FBS)(Gibco,USA).Experiments were performed on second to fourth passage cells.The fibroblasts were determined by morphological characterization and by positive staining for fibronectin(Santa Cruz,USA)(Figure 1).

1.2 Experimental groups

Cardiac fibroblasts were cultivated in 25 cm2-flasks at a density of 2×105cells/cm2.To achieve quiescence,the cells were incubated with DMEM/F12containing 1%bovine serum albumin(BSA)(Sigma,USA)for 24 hours.After being starved,the cells were incubated with aldosterone(Ald,10-7mol/L)(Sigma,USA)for various incubation periods as 0,1,2,4,8and 16 h.Cardiac fibroblasts were also pre-incubated with various concentrations of atorvastatin(Ato,10-6,10-5and 10-4mol/L)and mevalonate(Mev,10-3mol/L)(Sigma,USA)for 24 hours:1,Control;2,Ald(10-7mol/L);3,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-6mol/L);4,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-5mol/L);5,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L);6,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)+Mev(10-3mol/L).

1.3 RT-PCR for TGF-βRⅠmRNA expression

Cardiac fibroblasts were rinsed twice with PBS and total RNA was prepared for reverse transcription.TGF-βRⅠprimers(upstream primer,5'-TAGAAC TCCCAACTACAG G-3';downstream primer,5'-ATAATCCGACACCAACCA-3')and GAPDH primers(upstream primer,5'-AATGCATCCTGCACCAA-3';downstream primer,5'-GTAGCCATATTCATTGTCA-TA-3')weresynthesizedinBEIJINGSBS GENETECH CO.,LTD(Beijing,China).PCR amplification was then performed with synthetic gene-specific primers for TGF-βRⅠ(533 bp)and GAPDH(515bp),using a DNA PCR kit(TaKaRa Dalian,China)in a GeneAmp model 9600 thermocycler(Perkin-Elmer;Norwalk,CT)for 32 cycles(TGF-βRⅠ:45 s at94℃,45 s at 55℃,90 s at 72℃;GAPDH:45 s at94℃,45 s at 48℃,90 s at 72℃).A final extension at72℃for 10 min was performed to ensure that all reactions were completed.PCR products were separated by electrophoresis on 1%agarose gel and were visualized by ultraviolet-induced fluorescence.The intensity of each band was quantified using BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++(VILBER LOURMAT,France).The resulting densities of the TGF-βRⅠmRNA were expressed relative to the corresponding densities of the GAPDH bands(internal control)from the same RNA sample.All experiments were repeated three times.

1.4 Statistical analysis

Data were expressed as the mean±SD.Differences between groups were assessed by one-way ANOVA followed by the Student-Newman-Keuls post hoc test.Differences were considered statistically significant at P<0.05.

2 Results

2.1 Effect of al dosterone on TGF-βRⅠmRNA

1,Control;2,Ald(10-7mol/L);3,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-6mol/L);4,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-5mol/L);5,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L);6,Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)+Mev(10-3mol/L).1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs Ald(10-7mol/L)group;3)P<0.05 vs Ald(10-7mol/L)+Ato(10-4mol/L)group

expression

The cells were incubated with aldosterone(10-7mol/L)containing 1%BSA for 0,1,2,4,8 and 16 h.As shown in Figure 2,aldosterone sig nificantly increased TGF-βRⅠmRNA expression as early as in4 h,and then reached the maximal level at 8 h.

2.2 Effect of atorvastatin on aldosterone-induced TGF-βRⅠmRNA expression

Cardiac fibroblasts were also pre-incubated with varying concentrations of atorvastatin(10-6,10-5and10-4mol/L)for 24 h.As shown in Figure 3,aldosterone stimulated TGF-βRⅠmRNA expression,which was inhibited by atorvastatin(P<0.05).To investigate the pathway of atorvastatin inhibiting aldosterone-activated TGF-βRⅠmRNA expression,the cardiac fibroblasts were pre-incubated with mevalonate.The results showed that mevalonate effectively restored aldosterone–induced increase in TGF-βRⅠmRNA expression.

3 Discussion

It has been rep orted in both clinical researches and animal experiments that atorvastatin is able to improve cardiac remolding,independent of its ability to lower total and low-density lipoprotein cholesterol[5].Alarge body of evidences demonstrated that atorvastatin may exert several inhibition effects on cardiac fibroblasts,such as cardiac fibroblasts proliferation,tansforming to myofibroblasts,collagen synthesis and extracellular matrix deposition[5,6].However,no data have been found,at this time,about the mechanisms of atorvastatin on these effects.Our previous study showed that atorvastatin reduced cardiac fibrosis by significantly down-regulating the over-expression of endothelin-1/endothelin-A receptor system in aldosterone-induced cardiac fibroblasts[7,8].TGF-β1,existing in the extracellular matrix and in the circulation,play an important role in cardiac fibrosis by acting upon heart cells through the TGF-βRI and then propagating downstream intracellular signals,contributes to fibrogenic responses[9].Sakata and assistants further indicated that transforming growth factorbeta receptor antagonism attenuates myocardial fibro-sis in mice with cardiac-restricted over-expression of tumor necrosis factor[10],confirming that TGF-βRI isresponsible for the development of myocardial fibrosis.Taken together,it was speculated that atorvastatin may contribute to its anti-cardiac remodeling effects via a mechanism that involves the expression of TGF-βRⅠ.In supporting this hypothesis,our study revealed that atorvastatin dose-dependently inhibits TGF-βRⅠmRNA expression in cultured rat cardiac fibroblasts induced by aldosterone.Thus,the current study supports the hypothesis that the anti-remodeling effect of atorvastatin is mediated by down-regulating TGF-βRⅠm RNA level.In addition,the inhibitory effect of atorvastatin on the expression of TGF-βRⅠm RNA was abolished by mevalonate,which might be related to the inhibited synthesis of other isoprenoid intermediates in the signaling pathway[11].This strongly suggested that atorvastatin exerted pleiotropic effects through these intermediates inhibits small GTP-binding proteins prenylation[12,13],Rho and Ras induce the accumulation of small GTP-binding proteins and block the intra-cellular signal transduction.This signal transduction pathway contributes to gene expression,separated from that of statins on lipids.Our results showed that inhibitory effects of atorvastatin on TGF-βRⅠmRNA expression stimulated with aldosterone were restored by mevalonate.This strongly suggested that atorvastatin exerts its effects through the mevalonate pathway.

In conclusion,in the present study we showed that atorvastatin down-regulates the aldosterone-induced expression of TGF-βRⅠmRNA in cardiac fibroblasts by a mevalonate mechanism.Because pathologically elevated TGF-βRⅠmRNA expression is thought to enhance the role of TGF-β1 in the development of cardiac fibrosis,these data suggested a new possible mechanism by which statins attenuate cardiac

摘要：目的 探讨阿托伐他汀对醛固酮诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞转化生长因子-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)mRNA表达的影响。方法 采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取和培养乳鼠心脏成纤维细胞,应用RT-PCR检测心脏成纤维细胞TGF-βRⅠmRNA的表达。结果 给予醛固酮(10-7mol/L)4h后,TGF-βRⅠmRNA表达开始增加,8h达高峰;提前给予阿托伐他汀(10-6,10-5,10-4mol/L)能剂量依赖性地抑制醛固酮诱导的TGF-βRⅠmRNA表达,而甲羟戊酸可逆转阿托伐他汀的这种抑制作用。结论 阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-βRⅠmRNA表达,其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关。

心脏成纤维细胞 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料及分组

选取我院2010年6月至2015年2月收治的46例面部外伤患者为观察对象。其中男39例, 女7例;年龄1~35岁;摔倒致异物划伤40例 (87.0%) , 玻璃割伤6例 (13.0%) ;伤口位于额部10例 (21.7%) , 上睑15例 (32.6%) , 颊部3例 (6.5%) , 唇部12例 (26.1%) , 鼻部6例 (13.0%) 。所有患者均无高血压病及糖尿病, 受伤至入院时间均在12小时内, 伤口长度2~6cm, 对rha FGF、rh-b FGF均不过敏。利用简单随机化分组法将患者分为观察组24例和对照组22例。两组患者基本情况大体一致。

1.2 方法

所有患者麻醉、消毒后小心清除坏死组织。观察组将包装中自带的10ml溶媒加入2.5万U的rh-a FGF (上海万兴生物制药有限公司生产, 每瓶2.5万U) 中, 制成浓度为2500U/ml的药液, 喷于创面, 充分利用整形美容缝合技术给予一期缝合, 以rh-a FGF浸湿的纱布覆盖缝合的伤口, 再用无菌敷料覆盖, 每日消毒后换药一次。对照组应用rh-b FGF (南海朗肽制药股份有限公司生产, 每瓶2万U) , 术后以rh-b FGF换药, 方法同观察组。所有患者伤口愈合后及时拆除缝线。

1.3 观察指标

观察两组伤口愈合时间、创面感染及不良反应发生情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件包进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 行t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者伤口均愈合, 无创面感染。观察组伤口平均愈合时间为 (4.3±0.7) 天, 明显短于对照组的 (4.7±0.6) 天, 差异有统计学意义 (t=2.07, P<0.05) 。两组用药过程中均未见疼痛及过敏等不良反应。

3 讨论

面部外伤在日常生活中较常见, 对患者心理影响较大, 迫切希望少留瘢痕, 早期愈合。因此, 如何缩短面部伤口的愈合时间及尽可能减少缝合后产生组织移位、五官变形是外伤处理首先考虑的问题, 运用无创、无张力原则使深部断裂的组织分层次缝合, 顺皮肤朗格线一期缝合伤口, 减少二次修复是广大医务工作者的努力方向。在眼部尤其要考虑眼轮匝肌、内外眦韧带及皮肤的修复, 口唇部注意红唇缘、唇珠及人中脊的修复, 鼻部及耳部应注意避免软骨的外漏, 防止软骨炎的发生。

伤口修复是一个复杂的过程, 其中血液的渗出、巨噬细胞及血小板的游走、凝血机制的触发、炎症介质及各种细胞因子都参与其中。有研究[1,2]表明, rh-a FGF在组织修复、神经、肾脏及血管缺血再灌注方面都发挥了积极的生物学作用。rh-a FGF将基因重组于大肠杆菌中制成生物功能及理化性质一致的a FGF, 是存在于中胚层及神经外胚层的一种氨基酸多肽序列, 刺激血管内皮细胞的增殖、分化, 进而增加局部的血液循环及氧供。其对深二度烧伤及削痂术后应用有良好的促愈合作用[3]。它还对糖尿病溃疡、皮瓣循环障碍及神经修复方面有促愈合作用[4]。rh-a FGF是一种多肽因子, 通过激活酪氨酸激酶类受体改变空间构象引起多信号的传递, 激活靶基因促进细胞的分裂增殖[5], 促进毛细血管及成纤维细胞的增生, 还能够促进细胞周期S期的含量, 促进神经细胞脱氧核糖核苷酸的生成, 修复受损伤的上皮及神经血管等。有研究表明, b FGF在创伤愈合中有巨大作用, 可以对皮肤的纤维化、血管化和上皮化起到调控和介导作用[6]。面部外伤后伤口环境呈酸性, rh-a FGF较rh-b FGF在酸性环境中更容易发挥生物学效应[7], 促进伤口愈合。

本文结果显示, 观察组伤口平均愈合时间明显短于对照组, 差异有统计学意义, 且用药后也未发现明显不良反应。可见, 与rh-b FGF相比, 应用rh-a FGF能缩短面部外伤的愈合时间, 且用药安全。

参考文献

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[6]丁韧, 汤学明.创伤愈合的细胞生物学进展[J].创伤外科杂志, 2000, 2 (1) :59.

牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定 篇8

研究旨在从牛胎儿耳组织中分离到成纤维细胞, 并用组织贴附培养法进行原代培养, 在传代培养过程中观察总结了体外培养成纤维细胞的生长特征, 用PCR法鉴定了性别, 找到一种简单、实用的胎儿体细胞系早期性别鉴定方法, 为后续牛体细胞克隆与胚胎移植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

牛胎儿、阳性对照与阴性对照牛血液, 取自黑龙江八一农垦大学农场;DMEM/F12, 购自Gibco公司;胰蛋白酶, Sigma公司产品;标准胎牛血清, TBD公司产品;细胞培养板与培养瓶, Costar公司产品;PCR 引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;Taq酶、细胞基因组DNA提取试剂盒, 购于天根生化科技有限公司。

1.2 牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用组织块贴附法:取胎龄为40 d的胎牛, 在无菌条件下用手术剪在PBS液中剥除胎膜, 剪下分离出的牛胎儿 (体长约2.1 cm) 耳朵放入37 ℃灭菌生理盐水中;将胎儿耳尖剪下一小块, PBS洗3遍后用酒精消毒30 s, 再用PBS洗3遍;将清洗好的牛胎儿耳尖用含10%血清的DMEM/F12培养液洗2次, 放入培养皿中用眼科剪剪成1 mm2左右的小块, 用镊子将剪碎的组织块转移到35 mm的3个卡氏培养瓶中, 用牙科探针将组织块铺展, 并使组织块内侧贴壁;将已加好血清、双抗的DMEM/F12预热, 在每个培养瓶中加入5 mL预热好的培养基, 做好标记, 把培养瓶放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养, 使组织块贴壁, 5 h后轻轻翻瓶, 培养2 d后换液, 培养至第3天观察细胞生长情况。待细胞长到80%～90%汇合时, 将一部分细胞冷冻起来, 一部分按照1∶2 的比例传代培养。

1.3 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定

将牛胎儿成纤维细胞消化收集后, 按相同的密度 (2.3×104/mL) 接种于一个24孔培养板中, 37 ℃、5% CO2、饱和湿度恒温培养;每隔2 d换液, 每隔1 d消化收集2孔细胞, 用血细胞计数板分别计数3孔的细胞数, 每孔计数3次求平均值。连续计数10 d, 绘制生长曲线。

1.4 细胞DNA的提取

用细胞基因组DNA提取试剂盒提取牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA, 用血液基因组DNA提取试剂盒提取阳性对照与阴性对照牛基因组DNA, 作为PCR反应的模板。

1.5 PCR 反应的引物序列及反应条件

根据GenBank数据库中牛SRY基因序列设计PCR引物:P1 5′-CCAGGGAACTGCTTGGGTA-3′, P2 5′-TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA-3′, 预计产物为255 bp ;根据牛β-珠蛋白基因序列设计合成1对内标引物[2]: P3 5′-TATCCCACTTACAAGGCAGGTT-3′;P4 5′-GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA-3′, 预计产物为405 bp 。

采用20 μL反应体系, 以牛基因组DNA为模板, 反应条件为 94 ℃预变性5 min;94 ℃变性50 s , 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环;72 ℃延伸10 min。

2 结果

2.1 牛成纤维细胞的培养结果

组织块培养12 h后在倒置显微镜下观察, 可见组织块贴壁, 有少量细胞开始沿组织块周围向外生长;培养第2天, 组织块边缘游离出许多单个细胞, 大多数为上皮样细胞及一些颗粒物质, 并呈晕状, 只有少部分游离出个别成纤维细胞;培养第4天, 组织块周围仍有大量上皮样细胞, 但大部分组织已游离出成纤维细胞 (见图1) ;培养第6天上皮样细胞比例减少, 成纤维细胞已占多数, 成梭状延伸 (见图2) ;培养第8天成纤维细胞生长旺盛, 已基本铺满瓶底, 但组织块间仍有间隙 (见图3) ;培养第10天后组织块间隙消失, 细胞汇合连生, 密密地铺满瓶底 (见图4) 。

2.2 牛成纤维细胞的生长曲线

牛胎儿成纤维细胞以2.3×104个/mL接种于24孔细胞培养板中, 6～10 d长满细胞。每隔2 d换液, 隔1 d计数3孔细胞数, 取平均值, 连续计数10 d, 绘制生长曲线 (见图5) 。由图5可见, 牛胎儿成纤维细胞生长增殖的滞留期为 0～1 d, 对数生长期为 2～6 d, 平台期为7～10 d, 第10天开始有下降趋势。

2.3 牛基因组DNA的提取结果

从牛胎儿成纤维细胞、牛血液中提取牛基因组DNA, 经0.8%琼脂糖凝胶电泳, 得到的条带大小为20 kb左右 (结果见图6) , 这与GenBank中的一致。

M. λDNA/HindⅢ Marker;1.公牛血液基因组;2.母牛血液基因组;3.牛胎儿成纤维细胞基因组。

2.4 PCR扩增结果

分别以公牛、母牛血液基因组DNA和牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板进行PCR反应, 反应后各取10 μL, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图7。由图7可见:以阳性对照公牛血液基因组DNA为模板扩增得到403 bp的β-珠蛋白基因和255 bp的SRY 基因2条扩增带 (1泳道) ;以阴性对照母牛血液基因组DNA为模板扩增得到403 bp 的1条扩增带 (2泳道) 。以牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板扩增结果见3, 4, 6泳道 , 第3号泳道 (第1牛胎儿成纤维细胞系) 有403 bp的β-珠蛋白基因和255 bp的SRY 基因2条扩增带, 第4, 6号 (第2, 3牛胎儿成纤维细胞系) 只有β-珠蛋白基因基因扩增带而没有SRY基因条带, 故可确定第1牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为公牛, 第2, 3牛胎儿成纤维细胞系的供体胎牛为母牛。

M. pUC18 DNA/Msp Ⅰ Marker;1.阳性对照;2.阴性对照;3, 4, 6.第1, 2, 3细胞系;5, 7.空白对照。

3 讨论

当前对牛胎儿成纤维细胞培养比较常用的方法有组织块贴附法和酶消化法。组织块贴附法简便易行, 得到的细胞均质性好, 易于操作, 而且不用胰蛋白酶消化, 避免对细胞造成伤害[3]。所以, 试验选用组织块贴附法培养细胞。

用组织块贴附法培养牛胎儿成纤维细胞时, 细胞呈贴附型生长, 原代和早期传代细胞是上皮样和成纤维样细胞的混合物, 从发育生物学角度来看, 二者来源不同, 上皮样细胞来源于外胚层, 成纤维细胞来源于中胚层[4]。组织块培养初期, 由于细胞仍基于原组织生长, 所以首先移出生长的主要是上皮样细胞, 成纤维样细胞由于母细胞数量少而显得增加数量较慢。但随着细胞在体外传代次数的增加上皮样细胞逐步被淘汰。成纤维细胞对消化液比上皮细胞更敏感, 通过控制适宜的消化时间可以使成纤维细胞脱壁, 而上皮细胞仍保持贴壁, 经过3～5 次传代纯化后, 就可以得到比较纯的成纤维细胞[5]。本试验细胞生长曲线呈“S”型, 表现为潜伏期、对数生长期和平台期, 接种第1天细胞刚刚贴壁, 处于恢复期, 细胞数量基本保持不变;从第2天进入对数生长期;3～6 d为增殖高峰期, 6 d后进入平台期, 细胞逐渐长满, 10 d后由于接触抑制开始走向衰亡。

试验通过PCR扩增反应扩增出公牛的一段近255 bp的SRY基因特异性片段和403 bp的β-珠蛋白基因特异性片段, 而牛胎儿成纤维细胞、阴性对照母牛和空白对照只有403 bp的β-珠蛋白基因特异性片段。故判定有255 bp扩增带的母体为公牛, 而无此带的为母牛。这一结论为转基因克隆动物研究中转染目的基因以及保存和扩增性别已知的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据, 也进一步说明PCR法对细胞系性别进行早期鉴定, 在家畜体细胞克隆与胚胎移植中具有很大的应用价值。

参考文献

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心脏成纤维细胞 篇9

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料、仪器设备

Forcel四点弯曲细胞力学电子加载仪(华西口腔医院正畸科和成都电子科技大学联合研制);细胞加力板:75 cm2聚苯乙烯组织培养瓶(Falcon, USA)瓶璧切割成8 cm×3.5 cm的加力板;荧光倒置相差显微镜(Olympus IX50/IX70, Japan);Leica Applicat图像分析系统(Leica DMI6000B Germany);F-actin直标荧光抗体BODIPY FL Phallacidin(Dako USA),激发波长505 nm、发射波长512 nm;生长培养基:DMEM培养基(Gibco,USA),加入100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素,10%胎牛血清(Hyclone, USA);分化培养基:DMEM培养基(Gibco,USA),加入100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素,5%胎牛血清(Hyclone, USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 加力

采用酶消化法和组织块法联合培养法对hPDLF做原代及传代培养,取传代至第6 代的人牙周膜成纤维细胞,以2×104/ml的密度接种于彻底灭菌的加力板上,每板细胞数量为2 ml。然后将加力板放入培养皿中,待细胞完全贴壁后加入生长培养基,37 ℃、饱和湿度、95%空气、5% CO2孵箱中培养。48 h后,将培养板浸泡于另一培养皿的生长培养基中,继续培养3 d,隔日换液。在细胞加力前1 d,将生长培养基换为分化培养基,在分化培养基中继续培养1 d后使用。

采用Forcel四点弯曲加力装置,对接种了细胞的加力板加力,频率0.5 Hz,位移1 mm,加力板变形量2 000 μstrain(细胞变形量0.2%),按0、0.5、1、4、8、12 h分为6 个加力时间段分别施加张、压应力,每个实验组包含3 个实验样本,3 个实验样本均来自同一瓶计数的细胞,以相同的细胞密度和细胞量接种在3块加力板上。

1.2.2 细胞固定与检测

在设定的时间将实验组与对照组的细胞培养板取出,用PBS液洗2 次;用4%多聚甲醛(4 ℃预冷)固定5 min;PBS液洗2 次;滴加0.1% Triton X-100,处理10 min;PBS液洗2 次,5 min/次;滴加BODIPY FL(1/200稀释),37 ℃孵箱中静置1.5 h后取出,PBS液冲洗3 次,(整个过程注意避光);在荧光倒置相差显微镜下观察细胞骨架形态及其改变情况、采集图像,并用图像处理软件测定细胞的荧光强度。

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件,用方差分析(ANOVA)分别对各加力组和未加力组的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)进行统计学分析,SNK法进行组间两两比较。P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 形态学观察

荧光倒置显微镜下观察,人牙周膜成纤维细胞未加力时,细胞排列比较乱,细胞形态呈典型的梭形,荧光染色强;F-actin纤维呈束状平行排列,纤维较疏松,分布均匀,应力纤维清晰可见(图 1)。加力后细胞形态发生变化:加力1 h可见,细胞排列整齐,形态仍呈梭形,细胞体积稍变小, F-actin纤维呈束状平行排列,压力组细胞F-actin应力纤维开始向细胞膜周围靠近(图 2、3);加力4 h后,细胞开始收缩变圆,边界清晰,细胞间隙增大, F-actin纤维束转变为紧密排列,分布不均匀,F-actin应力纤维多集中于靠近细胞膜处,束状平行排列方向性变差,应力纤维数目变少。张力组细胞长度和宽度都有收缩,细胞短而细,而压力组细胞长度缩短,宽度却有增加,细胞短而粗(图 4、5);加力8 h后,细胞形态进一步发生皱缩,F-actin应力纤维数目更少,形态仍然不规则(图 6、7);加力12 h后,细胞形态恢复呈典型的梭形,荧光染色增强,与未加力组接近(图 8、9)。

2.2 荧光强度测量

各处理组细胞骨架平均荧光染色强度值见表 1。

对不同应变组作单因素方差分析(One-way ANOVA)和SNK法组间两两比较显示:除0.5 h和12 h组外,其余各实验组细胞平均染色强度均较对照组减弱,差异有显著性(P<0.01)。在加力4 h以内,随加力时间延长染色强度有逐渐减弱的趋势;加力4 h以后,随加力时间的延长,染色强度开始逐渐增强,加力12 h后染色强度已与未加力组接近,差异无显著性(P>0.05)。双因素方差分析显示,张力组和压力组之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

随着信号传导研究的深入,人们发现细胞骨架对力学信号的传递起着重要的作用,其功能受到不同信号的调节[1,2]。有学者[3]研究发现,微丝结构可以发生改建和重 排,说明 机 械力可以对微 丝产生影响。聚合态纤维肌动蛋白(F-actin)是微丝的主要成分,参与细胞形态维持及多种细胞功能,其结构重排、聚合和解聚的动态变化,在一定程度上反映了细胞的功能状况。

以往学者研究表明,不同性质的机械力对细胞形态和细胞骨架的作用随作用强度的变化而不同。Norton

(μm 2,±s)

(μm 2,±s)

等[4]利用双轴应变基底膜拉伸装置对牙周膜细胞进行拉伸,观察到细胞形态的变化与施加应变的大小无关。Chiba 等[5]对牙周膜成纤维细胞施加循环牵张力也发现类似的变化。Carano 等[6]发现动态和静态机械拉伸都可导致成纤维细胞直接形变,作用一定时间后,细胞能够适应新的机械环境而引起生物学效应的丧失。麻健丰等[7]采用自制的细胞体外静态机械加载装置用不同的拉伸应变量加力于细胞上,结果显示静态拉伸应变可影响牙周膜成纤维细胞的骨架形态。彭庭莉等[8]对体外培养的人牙周膜成纤维细胞施加静张力和不同的动态张力,结果表明不同张应力可引起体外培养的人牙周膜成纤维细胞的形态和F-actin发生有规律的变化,特别是动态张应力,在细胞投影面积以及细胞平均荧光强度方面均与加力时间呈正比,微丝随加力时间的延长而逐渐变粗。杨美祥等[9]对hPDLF分别施加静压力、周期性牵张力和流体剪切力,流体剪切力作用6 h后,部分人牙周膜成纤维细胞出现收缩、微丝排列等方面的变化;12 h后,部分细胞死亡、脱落。较大的静压力(>100 kPa)作用12 h后,可引起细胞间隙增大等变化,细胞骨架改变较少。

本研究采用的Forcel四点弯曲加力装置原理类似于机械梁四点弯曲加载原理。将体外培养的细胞种植于细胞培养板上,通过该装置的驱动,培养板弯曲变形,其上、下表面积发生改变,一方为张应力,另一方为压应力。通过控制垂直向的位移,可以精确控制细胞所受的应变量,且应变量大小恒定、统一。细胞应变的大小根据公式ε=td/a(L-1.33a)算出,其中ε为应变量,t为培养板的厚度,d为垂直向位移,a为同侧内外支撑点距离,L为两外侧支撑点距离。

本实验对比研究了动态张应力和压应力对体外培养的人牙周膜成纤维细胞的细胞形态和细胞骨架的作用,结果发现加载2 000 μstrain时2 种性质的力在加载4 h内使细胞荧光染色强度逐渐下降,加载12 h后细胞形态恢复正常、染色强度已接近未加力组,动态张、压应力在同一时段对hPDLF细胞骨架的荧光染色强度差异无显著性(P>0.05)。结果提示动态张应力和压应力都能使体外培养的人牙周膜成纤维细胞的细胞形态和细胞骨架发生变化,体外培养的hPDLF细胞骨架对动态张、压应力的敏感度无明显差异。

本实验的结果表明hPDLF细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性,能够适应一定范围的机械力作用,而细胞骨架肌动蛋白表达量在受力后改变表明肌动蛋白在细胞内机械力信号的传导中起作用,初步揭示了机械力作用下细胞骨架形态结构变化的规律,为后续研究提供了方向。

摘要：目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化。方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1000、2000、4000μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化。结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异。结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性。

关键词：人牙周膜成纤维细胞,张应力,压应力,细胞骨架

参考文献

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心脏成纤维细胞 篇10

波形蛋白附在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端，因而波形蛋白在支撑及锚固原生质内的细胞器方面有重要作用。还能维持细胞的形状、细胞质的完整性及稳定细胞骨架内的相互作用。贴壁细胞贴附在一定的固相表面 (如载玻片) 上生长，容易观察、培养、封片和进行其他相关特性的研究[4,5]。试验从天祝白牦牛胚胎中采样，体外制备、分离、培养胚胎成纤维细胞，并进行细胞鉴定。

1 材料

1.1 仪器

CK40-32PH型倒置相差显微镜 (Olympus) 、CK41型荧光倒置相差显微镜 (Olympus) 、3110型CO2培养箱 (Thermo) 、普通生物显微镜 (Olympus) 、MP120型便携式酸度计 (Thermo) 、液氮贮存器 (Thermo) 、AR2140型电子天平 (奥豪斯公司) 、Bcm-100型生物洁净工作台 (江苏净化) 、PYX—BHS型隔水式恒温培养箱 (上海) 、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 (上海) 、80-2B低速离心机 (上海) 、电动移液器 (德国) 、超低温冰箱 (日本三洋) 、JM-G035-6002卧式方形压力蒸汽灭菌器 (江苏太仓) 、AR2140电子分析天平 (奥豪斯公司) 、QZ-B5-4环境消毒机 (北京中农) 、生物安全柜 (丹麦) 、盖玻片、培养皿、玻璃吸管、吸耳球等，均由西北民族大学生工程与技术国家民委重点实验室提供。

1.2 试剂

角蛋白抗体、波形蛋白抗体，Abcam公司生产;S-P免疫组化试剂盒、抗体稀释液、DAB染色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司生产;多聚甲醛，上海生物试剂有限公司生产;DMEM、5%胰酶，甘肃省动物细胞工程技术研究中心馈赠;4%多聚甲醛，西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室配制。

1.3 4%多聚甲醛的配制

A液:多聚甲醛40 g，纯化水400 m L。B液:Na2HPO4·2H2O 16.88 g，纯化水300 m L。C液:NaOH 3.86 g，纯化水200 m L。

配制方法:A液在500 m L的三角烧瓶中配制，加热至60℃，多聚甲醛完全溶解后冷却待用。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl将pH值调至7.2～7.4，最后补充纯化水至1 000 m L，充分混合，4℃冰箱保存，备用。

2 方法

2.1 细胞爬片的准备

盖玻片泡酸24 h，自来水冲洗10次，纯净水冲洗10次，并用擦镜纸擦拭干净，放入培养皿中 (为了防止盖玻片在培养皿中来回晃动，可在盖玻片下面加1滴PBS) ，用牛皮纸包好，高压灭菌备用。

2.2 第一抗体浓度的确定

角蛋白抗体上明确标出牛的最适浓度为1∶150，为了找到波形蛋白合适的抗体浓度，首先进行了测定波形蛋白最适浓度的预试验。

设定的浓度梯度分别为1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600。

试验结果表明，比例为1∶100时效果最好，确定波形蛋白的最适浓度为100μL。

2.3 牦牛原代胚胎成纤维细胞的制备[6]

用组织块法制备白牦牛的原代胚胎成纤维细胞。从甘肃省天祝县白牦牛屠宰场取60日龄牦牛胎儿，去头、皮肤、内脏及四肢，仅留躯干。取1小块组织，放入青霉素瓶中;用眼科剪将组织剪成1 mm3的小块，并加入少许培养基使组织湿润;将剪好的小组织块倒入无菌的细胞瓶中，用长针头将小组织块均匀涂布于细胞瓶壁，每小块间距0.2～0.5 cm;小组织块放置好后，轻轻翻转细胞瓶，使瓶底朝上;然后向瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内;培养4～6 h，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，以防小块漂起而造成培养失败。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24 h后补充培养液。培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不搬动，以利贴壁和生长，培养3～5 d后换液。

再取4块胚胎组织，按照上述步骤将胚胎组织在小青霉素瓶中剪成大小分别为7～9 mm、6～8 mm、3～5 mm、1～2 mm的小组织块，分别按18, 20, 24, 40块铺于细胞瓶中。每天在倒置显微镜下观察能游离出成纤维细胞的组织块数并计数，计算组织块成活率。

2.4 细胞爬片的制作

选择生长状态良好的细胞，镜下的标准以细胞平铺占瓶底的80%左右为宜。待细胞分布均匀、形态良好时，吸取培养基，加无血清培养基或用PBS洗1次，加胰酶3 m L，轻晃使胰酶分布到每个角落，在37℃条件下孵育消化作用2～3 min，镜下见细胞回缩，边缘折光性向圆形改变时，稍用力拍打细胞瓶，镜下可见一些圆形细胞随胰酶漂移，倒掉胰酶，加培养基，轻轻吹打几次，尽量形成单细胞悬液。将配制好的细胞悬液加入装好盖玻片的培养皿中，放入细胞培养箱培养。待细胞铺满细胞瓶壁的75%～80%时将其取出，用4%的多聚甲醛固定20 min，再用PBS洗2次后进行染色。

2.5 免疫组织化学法鉴定染片[4,7,8]

将培养的第3代细胞，接种到有盖玻片的培养皿中，细胞贴盖玻片生长。吸干培养液，经4%多聚甲醛室温固定30 min，晾干。按S-P法标准程序进行操作。用内源性过氧化物酶阻断剂阻断其干扰，再用正常山羊非免疫血清封闭。滴加抗波形蛋白单克隆抗体孵育，再滴加生物素标记羊抗鼠IgG和链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶工作液，室温镜下观察显色效果，并用中性树胶封片，光镜下观察。

3 结果

3.1 形态学观察

用倒置相差显微镜观察所培养细胞的形态，主要用于区分成纤维细胞和类上皮细胞。在含100 m L/L胎牛血清DMEM培养液中，见少量上皮细胞及大量成纤维细胞于2 d左右从组织块中爬出。每日更换DMEM后，上皮细胞逐渐死亡，1周后成纤维细胞呈短圆梭型或多角形，显示细胞状态良好，长满细胞瓶壁的80%～90%，为梭形或多突起，边缘光滑 (见图1) ，其胞体较大，细胞界限清楚，立体感强，折光率高，以梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连接成网状。随后组织块周围细胞逐渐密集，成纤维细胞在传代后第25小时时分裂增殖活跃，呈对数生长。第6～7天细胞分裂达高峰，倍增时间为28.2 h。

成纤维细胞外形与体内的成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形，细胞贴壁后呈长梭形、圆形，细胞核位于中央，胞质外伸出2～3个长短不同的突起，生长时呈放射状、旋涡状走向。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙[1,4,8]。

类上皮细胞泛指那些形态上类似上皮细胞的细胞，细胞呈扁平状，细胞贴壁后呈规则的三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞[3]。这类细胞不完全等同于动物体内的上皮组织细胞，绝大部分体外原代培养的上皮细胞只能在胎牛血清DMEM培养液中存活很短一段时间，不能传代。

3.2 天祝白牦牛原代胚胎成纤维细胞

在显微镜下观察到细胞呈长梭形或不规则形，细胞核位于中央，单核，核较大，胞质较多，胞质外伸出2～3个长短不同的突起，生长时呈放射状、旋涡状，细胞贴壁后呈长梭形、圆形，大多数平行排列，符合成纤维细胞的形态及生长特点[5,8]。

3.3 免疫组织化学染色结果

中间丝波形蛋白呈阳性，棕黄色颗粒定位于胞质，说明细胞表达波形蛋白。但同时有些细胞不显色，说明制备的胚胎成纤维细胞不纯，其中含有部分其他细胞。想要得到单一的胚胎成纤维细胞，还需要进一步传代培养纯化。通过统计，波形蛋白免疫组织化学染色95%以上为阳性，见图2。

3.4 染色的阳性率

在显微镜下随机挑选10个视野，统计100个细胞中着色的细胞数，计算染色的阳性率。组织块法 (1组、2组、3组、4组) 和胰酶消化法 (5组、6组) 的染色结果见表1。

由表1可知:波形蛋白免疫组织化学染色有95%细胞以上为阳性，说明制备的细胞中95%以上为成纤维细胞，但其中还夹杂有上皮细胞型细胞。如果要想得到单一的成纤维细胞型，还需要进行纯化试验。

4 分析与讨论

4.1 组织块法制备天祝白牦牛原代胚胎成纤维细胞

在试验中选择组织块培养法分离培养出比较纯的成纤维细胞，有效避免了胰酶对培养细胞的不良反应。组织块大小对白牦牛胚胎成纤维细胞原代培养的影响较大，不同大小的组织块得出的白牦牛胚胎成纤维细胞的存活率不同 (见图3) 。

组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快，组织块直径较大的成活率较低且生长速度较慢，两者之间呈反比。因此，组织块的大小直接关系其贴壁生长的成活率，组织块越大贴壁效果越不理想，与生长液的接触越不充分，成活率越低，反之亦然。

4.2 天祝白牦牛胚胎成纤维细胞形态观察

在倒置显微镜下观察，可见培养瓶中细胞透明，细胞质突起，呈长梭形，立体感强。有部分细胞个体出现上皮样细胞或中间型，呈星形或三角状。随着培养时间延长，组织块周围的细胞生长增加，约1周左右细胞形成单层，但部分个体也同样出现上皮样细胞，需传代纯化。

4.3 天祝白牦牛胚胎成纤维细胞的鉴定试验

试验采用免疫组织化学方法检测其是否表达中间丝波形蛋白。用免疫组织化学的方法对天祝白牦牛的胚胎成纤维细胞进行鉴定，免疫组织化学染色可见成纤维细胞中波丝蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色 (见图2) ，最后通过统计分析所制备出的细胞中胚胎成纤维细胞的比率为95%。

5 结论

用组织块法培养，大量成纤维细胞于2 d左右从组织块中爬出。组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快，组织块直径较大的成活率较低且生长速度较慢。

用倒置显微镜进行形态学观察，成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或旋涡状排列。

用免疫组织化学染色可见成纤维细胞中波丝蛋白阳性反应，表现为胞质的棕黄着色。

摘要：为了研究牦牛胚胎成纤维细胞分离培养及鉴定方法, 试验采取60日龄白牦牛胚胎, 用组织块法分离纯化、传代培养, 用免疫组织化学方法进行鉴定。结果表明:用组织块培养的成纤维细胞呈梭形, 属典型成纤维细胞, 免疫组织化学染色有95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色着染 (阳性) 。说明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞。

关键词：天祝白牦牛,成纤维细胞,分离培养,鉴定

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