抗原抗体（精选九篇）
抗原抗体 篇1
1 材料与方法
1. 1 试验材料选取本院2012 年6 月~2014 年12 月190份血液筛查阴性标本, 同时采集190 份质控血液标本。
1. 2 方法将所选取的380 份血液标本进行严格检测, 应用双抗原夹心法检测HCV抗体。在检测时所应用试剂有吉比爱、Ortho丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂, Chiron RIBA确认试剂。
1. 2. 1 抗原制备嵌合表位抗原经包涵体的形式表达, 采取离子交换层析措施进行纯化, 然后通过Sephadex G-50 柱凝胶完成过滤采集, 应用SDS-PAGE将抗原蛋白进行仔细鉴定。
1. 2. 2 双抗原夹心法应用50 mmol/L碳酸盐缓冲液对抗原予以稀释处理, 多肽抗原具体浓度为:结构处多肽151 g/ml, NS4 处多肽0.51 g/ml, NS5 处多肽0.251 g/ml, 所应用到的基因工程表达抗原具体浓度有c7 应用1 g/ml, C11 应用1 g/ml。每个孔内均加进100 μl, 在37℃状态中持续保存1 h, 然后放置到4℃冰箱内过夜, 应用30% 小牛血清PBST实施封闭处理, 在每个孔内加进200 μl, 37℃状态中保存1 h, 然后去除封闭液, 应用50 μl样品稀释液, 每个孔内加进5 μl, 37℃状态中保存30 min, 然后应用PBST进行5 次冲洗。选择最为适宜酶稀释度, 通过棋盘滴定方法在每个孔内加进50 工作浓度的酶标记抗原, 37℃条件下放置15 min, 经PBST冲洗5 次, 每孔加入50 μl底物缓冲液及50 μl显色剂, 在37℃状态中保存10 min, 使之能够完全显色。然后在每个孔内加进50 μl2 mol/L硫酸, 停止反应, 应用酶标仪于450 nm波长条件下实施吸光度效果检测, 若检测结果≥临界值者则表示阳性, 反之则表示阴性。
2 结果
应用双抗原夹心法检测标本, 显示126 份为阳性标本, 1份为阴性标本, 应用Chiron RIBA确认试剂检测显示其均呈现阳性, 双抗原夹心法检测敏感性为99.21%。见表1。
3 讨论
对患者HCV抗体进行检测是确定其是否发生感染的初步阶段, 主要有用作筛检工作的酶免疫检测 (EIA) 以及用作确证工作的重组免疫印迹试验 (RIBA) , 其中RIBA由于需要较高费用且并未建立严格试验标准, 目前在临床诊疗中并无较多应用[4]。由于EIA存在较为明显的便利性及稳定性、自动化功能强、价格较低等优点, 在临床中应用到血液筛查及检测工作较为广泛。目前EIA发展至第三代, 依然实施间接法予以检测, 因其方法学存在一定固有缺陷性, 极易导致结果出现假阳性及漏检情况[5]。目前在临床中将双抗原夹心ELISA法检测试剂作为发展方向具有较为明显应用价值, 夹心法可使得酶标记的特异性抗原将间接法检测时酶标记的抗体进行取代由此完成整个检测, 与间接ELISA法进行比较, 其对于样品检测存在双特异性选择特点, 可以将血清内出现的抗HCV的总抗体完成检测, 有效防止间接ELISA法所存在的检测弊端, 确保检测结果具有更高的敏感性与特异性, 而且因为HCV抗原所具有的分子量较小, 以酶进行HCV抗原的直接性标记, 往往使得空间位阻情况发生, 导致抗体与抗原无法轻易结合, 存在较为明显抑制作用, 因此HCV抗原的标记是建立抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA检测方法的一个较为重要的难点[6]。
在本文研究中, 双抗原夹心法检测显示阳性为126 份, 阴性为1 份, 双抗原夹心法检测无需对血清产品予以稀释, 也不会因类风湿因子等不良因素而受到干扰, 存在较为理想的特异性, 而且能够对血清中各种抗体予以检测, 尤其免疫球蛋白M (Ig M) 类抗体可以明显减少自病毒感染至应用ELISA法检测到抗体间的“窗口期”。所以采取双抗原夹心ELISA法检测确保HCV感染诊断试剂存在较高特异性, 其检出率明显上升, 有效缩短检测时间, 具有较高临床推广应用价值。
参考文献
[1]李文新.不同方法试剂检测丙型肝炎病毒抗体结果分析.中国输血杂志, 2014, 27 (6) :622-624.
[2]龙宏洋, 叶玉芬, 朱学强, 等.丙型肝炎病原学不同检测方法的临床应用价值对比分析.检验医学与临床, 2015, 12 (5) :597-599.
[3]孟庆玲, 鲁健, 邱丰, 等.丙型肝炎Ig G抗体ELISA诊断试剂比对分析.中华实验和临床病毒学杂志, 2013, 27 (3) :221-223.
[4]鲜玉萍, 杨红英.丙型肝炎核心抗原检测的临床意义.检验医学与临床, 2012, 9 (18) :2320-2321.
[5]张健, 刘宜仲, 杨珊, 等.HCV核心抗原检测在血液筛查中的初步研究.现代检验医学杂志, 2012, 27 (2) :110-111.
抗原抗体 篇2
RH株弓形虫抗原及高效价多克隆抗体的制备
通过制备和分析弓形虫抗原蛋白,并以此抗原制备高效价的兔抗弓形虫多克隆抗体,为弓形虫的免疫检测和诊断提供有效的方法和途径,同时也为基因工程产物的鉴定提供方便有效的检测手段.速殖子主要来源于感染后72～74 h获得的腹水,通过常规方法制备和提纯弓形虫可溶性抗原,采用SDS-AGE方法分析抗原蛋白的分子量.以抗原和福氏佐剂制备成完全和不完全福氏佐剂通过脊柱两旁皮下多点免疫的途径免疫新西兰大白兔,制备兔抗弓形体多克隆抗体,间接ELISA法检测血清中抗体的效价.经过观察所获得的`虫体阶段主要处在宿主细胞巨噬细胞内而尚未逸出阶段,通过对结果的分析,所制备的弓形体抗原的分子量主要集中在17～156 ku之间,与文献报道有差异,兔抗弓形体抗体效价在60 000以上.该研究结果将为弓形体的蛋白质研究,免疫诊断、预防及有效治疗奠定基础.
作 者：陈美 周克夫 赵卿 李鹰 林宇光 洪凌仙 CHEN Mei ZHOU Ke-fu ZHAO Qing LI Ying LING Yu-guang HONG Ling-xian 作者单位：厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建,厦门,361005刊 名：厦门大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：45(5)分类号：Q18关键词：弓形虫抗原 多克隆抗体 SDS-PAGE ELISA
抗原抗体 篇3
【关键词】 企业贷款； 风险评判； 人工免疫算法； 抗原抗体； 亲和度
银行风险管理是银行的核心功能。其中贷款风险管理水平的高低直接影响银行的盈利性和安全性。它包括信贷前可行性分析、贷时审查和执行、贷款回收和评估三个阶段，而第一阶段是防范贷款风险的主要手段之一。所以科学合理构建银行对企业贷款风险评判体系是关键内容。文中引入人工免疫原理及人工免疫算法，将贷款指标的审计值作为抗原，将抗原的平均值，又称聚类中心值作为抗体。从抗体与抗原的匹配，计算出抗体与抗原的亲和度，来衡量银行产生对贷款类资产的免疫反应，即验证指标体系的优中劣等级划分及其预警区间值的合理性和有效性，旨在使构建的评判指标体系具有科学性和实用性。当企业的贷款被确认为优良等级时，企业才能使用信用贷款；若为中等等级，就要考虑为担保贷款或抵押贷款；若为劣等等级，说明贷款存在风险银行不予放贷。
一、生物免疫原理
免疫（Immune）一词由拉丁语Imminis衍生而来。免疫机体的抗感染能力来自宿主对入侵病原微生物的不同程度的无感受性。机体对不同抗原（指标审计值）能够进行识别和排斥，以维持正常的生命环境。免疫是生物体识别自体（self），排除异己（non-self）过程中所产生的生物学效应的总和。对机体起有利的生理性保护作用。识别了“自身”抗原，会形成天然免疫耐受性能，识别是“非己”抗原，就产生排斥作用，以维持抗体生理平衡和免疫保护作用。如果免疫功能失调，则对人体有害。当某种抗原刺激人体以后，人体对这种抗原产生一种物质，称为抗体。抗体能够识别抗原，一旦抗体与抗原的亲和力—亲和度值增大，抗体就能抵抗抗原和消灭抗原。免疫种类有主动免疫和被动免疫。
*主动免疫：机体受外来入侵所获得的免疫属于自适应（adaptive）免疫或特异性（specific）免疫，都属于主动免疫。
*被动免疫：母体在胎儿期注入疫苗为被动免疫。
主动与被动免疫共同构成一套机体免疫系统。
二、人工免疫原理
机体免疫是抗体与抗原的亲和力产生应答效应。抗原是一类物质，它能刺激机体内免疫系统产生一种特异性免疫应答，抗原具有两种特性：
1.抗原原性指抗原能刺激免疫细胞，在人工免疫原理中，可将评判指标审计值作为抗原原性体，刺激免疫细胞可理解为各评判等级的预警区间值。抗原会活化、增值，可将所有指标审计值叠加成实体抗原。
*判别所分评判等级准则：
D（Ci）>［D（Ci）］=0.5，则抗原与抗体之间亲和力合格，可以不改变评判等级数目k，并使用此评判指标体系及此评判系统。
D（Ci）≤［D（Ci）］=0.5，则亲和力太小，需改变评判级别数目k±1，重新判定合理性。
四、银行对企业贷款可行性及风险评判指标体系
银行对企业贷款风险及可行性评判时，科学合理构建其评判指标体系是关键。“安全性”原则是银行经营时要遵循的三性原则之一。就银行贷款而言，对企业使用等级的评定是银行防范贷款风险的基础。银行主要从企业基本素质，经济实力、经营能力、经营效益、使用状况和发展前景等方面来判断企业评判等级。每个方面应有具体指标来衡量。每个指标又有各自的参照监控值和评分标准，文中主要参考财政预算和兴业银行的公司客户使用等级通用评定标准。表1中指标评级数据的权值是以企业客户的实有净资产小于10亿为条件制定的，如果大于10亿，则净资产收益率要求≥4%~6%，故数据段又要调整。
优、中、劣评分标准的量化值要随货币政策变动、金融形势发展和银行的经营目标，而随机动态调整评分标准和权值。
五、各申报贷款企业的实际指标审计值和同一指标归一化处理值
归一化公式u=（J-Jmin）/（Jmax-Jmin）
式中，u为在［0，1］区间的归一化值，在表2的（ ）内，参见表2。
J为这一指标的实际审计值。
Jmax为各个企业在同一指标中的最大审计值。
Jmin为各个企业在同一指标中的最小审计值。
六、各评判等级A，B，C的抗原与抗体及其匹配表达式
表3中，抗原值等于一个企业所有指标审计值之和。
抗原级额定值为1.000/k=1.000/3个级别＝0.333。于是获得：A级为0.66～1.00，B级为0.33～0.66，C级为0.0～0.33。
按抗原值的归一化处理值0.000～1.000（参见表2）可确定抗原值所处等级，参见表3。
f（Ci）=1/DB=0.4708
f'（Ci）=[fmax-f（Ci）]/（fmax-fmin）=0.640
结论：D（Ci）=1/（1+f'（Ci））=0.609>[D（Ci）]=0.5
验证结论：所有抗原与抗体之间的浓度和亲和度较大，说明所分等级数及等级区间值科学合理，这种评判指标体系科学完善有使用实用价值。
（三）银行对各申报贷款企业的可行性及风险评判结论（见表5）
八、结语
对企业申报贷款可行性评判是防范银行经营风险的关键，这对银行安全运行正确决策具有科学价值，从案例说明这种基于人工免疫原理的评判技术是科学可行的。三个评判等级的浓度函数值C（Ci）均在0.5~0.9之间。所以它具有有效性和可操作性。银行还要根据各银行的经营目标和需求、世界和国内金融形势的发展以及国家货币政策的变动，而对指标体系中的量化数据和指标权重值随机进行动态调整。
【参考文献】
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［10］ 周毓萍.基于集对原理和变权机制的企业贷款可行性研究［J］.华中师范大学学报，2010，44（4）:580-584.
［11］ 周毓萍，徐琦，余敏.湖北省农业银行风险管理能力研究［J］.会计之友，2010（4）:51-53.
抗原抗体 篇4
1 对象和方法
1.1 对象
华南农业大学2004—2008年9月入学的全部本科生,共43 938人,年龄18~20岁,85.00%以上为广东省学生,约15.00%为外省学生。硕士生共3 593人,年龄23~26岁,70.00%以上为省外学生,广东省学生不足30.00%。
1.2 方法
在学生入学体检时取静脉血,用酶联免疫法检测HBsAg、HBsAb。
2 结果
本科生中HBsAg阳性率呈逐年下降趋势,平均下降11.07%;HBsAg、HBsAb阴性的学生比率有上升趋势,2008年最高(36.05%),平均为28.26%,见表1。
硕士生中HBsAg阳性率有所波动,平均为7.67%,总体比本科生低;HBsAg、HBsAb阴性的比率除2007年较低外(20.05%),其他年份与本科生相近,平均为27.17%,见表2。
3 讨论
乙肝主要通过血液、体液、性接触和母婴传播,可发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。随着高校的扩招,本校在校生总数已近4.3万人,虽然学生乙肝病毒携带率逐年下降,但仍然有约5 000人携带乙肝病毒,作为学生高度聚集的校园,如何控制这类人群的病情发展,并且阻止其引起传播,采取什么措施才能取得有效预防效果,是学校卫生工作要探讨的重点问题,笔者认为对学生分类管理有助于高校乙肝的防控工作。
3.1 乙肝病毒携带者的管理
(1)让学生知晓自己携带乙肝病毒,养成良好的生活、饮食和行为习惯,有利于病情的控制。校医院必须把学生体检状况告知学校及本人,既要做到保护患者隐私,又能及时与学校配合,共同关注学生情绪波动,以免因心里脆弱发生意外。(2)开展对乙肝病毒携带者的心理疏导。针对学生发现“HBsAg阳性”、“小三阳”和“大三阳”时出现的恐慌情绪,解释乙肝5项指标阳性和阴性的临床意义,使患者认识机体抗原抗体产生的机制,消除“阳性”恐惧症。(3)为乙肝病毒携带者建立管理档案,至少每半年复查1次肝功能,每年进行1次肝脏B超检查,及时发现病情变化[1]。
3.2 乙肝患者的管理
(1)积极治疗。从乙肝传播途径看,一般接触不会传染乙肝,根据肝功能损害程度,决定住院治疗或门诊治疗,病情较轻者边学习、边治疗;病情较重者应住院观察,保证足够休息。(2)心理护理。学生患乙肝,会产生紧张、害怕和焦虑等心理,思想压力大,情绪低落,或是自暴自弃,不愿接受治疗,这些不良情绪不利于疾病的治疗和恢复,应耐心、细致地做好心理疏导,帮助患病学生解除顾虑,树立治疗信心。(3)及时跟踪病情。部分学生病后可能表现为不在乎的心理,应及时追踪病人尽早就医,定期复查。(4)生活指导。引导病人注意休息,避免过劳,加强营养,绝对禁酒。
3.3 保护易感群体
(1)对HBsAg、HBsAb阴性的学生,通过多种途径开展乙肝防治宣传教育,让学生认识到接种疫苗是最有效的预防措施,积极参与乙肝疫苗接种。(2)对经初种无应答的学生要重复接种,通过增加疫苗剂量或更换疫苗品种,提高抗体阳转率;HBsAb滴度小于10的学生,要加强乙肝疫苗接种,以保证抗体的长期有效性。
3.4 加强健康学生的卫生知识宣教
(1)健康学生每年定期体检,建议学生检测乙肝抗原抗体及肝功能,及时发现潜在问题。(2)宣传乙肝预防的一般知识,了解乙肝传播途径、预防措施,做好自我保护。(3)提倡人文关怀,不仅要消除对HBsAg阳性者的恐惧和歧视,而且应该给予其更多的关爱。
摘要：目的 了解近年来高校新生乙型肝炎(简称乙肝)病毒携带率及掌握需要保护的学生群体,为预防保健工作提供依据,探讨高校乙肝防控的管理模式。方法 对近5年来高校新生(含本科生及硕士生)进行乙肝抗原抗体检测并统计分析。结果 高校新生乙肝病毒携带率逐年下降,需要接种乙肝疫苗获得保护的群体有上升趋势。结论 乙肝预防工作不能懈怠,对学生分类管理是高校乙肝防控工作的关键。
关键词：乙型肝炎,高等院校,预防保健
参考文献
抗原抗体 篇5
1 对象与方法
1.1 调查对象
该镇不同地方的8个年龄组, 每一组采集血样60份。
1.2 试剂
除乙肝血清学检测用试剂是荣盛生产的Ig G抗体酶联免疫检测试剂盒外, 其他检测用试剂均是德国维润赛润研发有限公司生产的Ig G抗体酶联免疫检测试剂盒。
1.3 方法
统一培训, 由白果镇镇卫生院采集标本, 及时送市疾控中心, 集中检测。
1.4 统计分析
用SPSS11.5软件进行卡方检验。
2 结果
2.1 不同年龄组抗体水平
经过对数据统计分析, 麻疹F组抗体水平偏低, 需要对15~19岁的人群进行补种 (χ2=10.44, P<0.01) , 其他年龄组的抗体水平都较高;风疹C组抗体水平为零, B和H组的抗体水平也低于平均水平 (54.59%) , 需要对这几个年龄组进行风疹补种, (χ2=14.72, P<0.01, χ2=4.55, 0.01<P<0.05) ;腮腺炎B、C两组的抗体水平低于平均 (67.5%) (χ2=44.43, P<0.01;χ2=15.57, P<0.01) ;乙脑的抗体平均水平为59.39%A和C组的抗体水平低于平均 (χ2=11.21, P<0.01) , 四种抗体均有显著性差异。麻疹阳性率最低的是F组, 只有80%, 在14岁前的抗体平均水平在93.98%, 并随着年龄的增长抗体整体水平都维持在较高位;风疹的整体抗体水平都较低, 其中C组为零, 要高度重视, B和H组阳性率也低于平均水平, 与年龄的大小没有关联, A组可能是与出生时应用扩免有关, 高于平均水平;腮腺炎中B、C两组的抗体水平阳性率偏低, E、F和G组的抗体水平与A组持平, 可能与身体的发育有关;乙脑抗体水平在A、C、F年龄组上都较低, 特别是A、C组, 应引起重视, 具体数据见表1。
2.2 经过对检测数据分析统计, 不难看出, 百日咳抗体阳性随着年龄的增大, 有所下降, 只是A和C组有显著性差异 (χ2=9.22, P<0.01) , 到E组之后, 阳性率又逐渐升高;白喉抗体阳性在B组中阳性率与A、C组都有着显著性差异 (χ2=35.15, P<0.01;χ2=26.83, P<0.01) , 从D组开始, 白喉抗体阳性率一直维持在一定水平, 只是到30随后有所下降, 低于其他年龄组的平均抗体水平 (χ2=28.47, P<0.01) ;破伤风抗体阳性率平均水平仅有12.49%, 说明破伤风抗体阳性率偏低, 30岁之后的抗体阳性率为0, A组与B、C两组都有显著性差异 (χ2=16.42, P<0.01;χ2=10.21, P<0.01) ;甲肝抗体的阳性率A和G组的阳性率明显低于平均水平 (χ2=26.12, P<0.01;χ2=97.31, P<0.01) 。具体数据见表2。
2.3 经过对检测数据分析统计, 可以看出, HBs Ab的阳性率整体都较高, 为74%, 明显高于杨春秀等[2]71.35% (χ2=17.68, P<0.01) , 在A~E组中有5人阳性, 系母婴传播而导致阳性的, 为防止母婴传播而导致乙肝阳性的防治重点是在加强阻断母婴传播。具体数据见表3。
3 讨论
近几年来随着国家扩大免疫规划逐步加强, 儿童疫苗接种率不断提高, 发病率明显下降。对于自愿接种各种疫苗的人群来说, 只要有要求接种疫苗的, 家长都会很自愿的来接种疫苗, 而对接种疫苗没有意识的家长, 出于自身的考虑, 如怕孩子受痛等, 各个方面的原因, 不会自愿接种疫苗, 同时, 在接受检测上, 自愿检测的基本上大致也是自我意识上去的家长们, 因此, 在宣传上还是要大下功夫, 多做疾病重在预防等等方面的思想工作, 这也有利于疾病防控工作的开展。
本次调查表明, 该镇麻疹Ig G抗体阳性率达到92.36%, 与庞红等健康人群麻疹Ig G抗体阳性率达到96.68%十分接近[1]。风疹的阳性率仅为54.59%, 低于庞红等79.67%的报道, 腮腺炎抗体阳性率为67.49%, 三者之间均存在显著性差异, 建议抓紧查漏补种, 切实提高人群疫苗接种率和抗体阳性率。百日咳、白喉及破伤风三者的抗体阳性率均处于较低的水平, 这与刘跃红等[2,3]报道的百、白、破抗体阳性率都低, 特别是在>1至5~6岁这个阶段, 均处于很低的水平, 建议要密切关注。乙肝表面抗体阳性率96.25%, 明显高于杨春秀等宜昌市城区儿童乙肝抗体水平调查分析[2]71.35%。
从本次活动中可以看出, 在3~4岁年龄组中, 麻、风、腮及百日咳抗体阳性率都低于平均抗体水平, 有待于进一步进行补种工作, 而麻疹抗体阳性率距离消除麻疹还有一定差距。应进一步加大宣传力度, 不断提高人群免疫抗体水平, 为消除麻疹打下坚实的基础。
参考文献
[1]庞红, 张泽升, 刘红联, 等.上海市长宁区外来和本地小学生麻疹风疹等IgG抗体水平调查[J].中国疫苗和免疫, 2009, 6 (15) :223-225.
[2]杨春秀, 岳娅妮, 涂玉梅.宜昌市城区儿童乙肝抗体水平调查分析[J].公共卫生与预防医学, 2006, 6 (17) :42-43.
抗原抗体 篇6
目前, 检测沙丁胺醇的方法有气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 法、高效液相色谱 (HPLC) 法、液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 法、酶联免疫吸附 (ELISA) 法等[5]。 前3种检测方法的优点是准确可靠, 但同时存在着前处理繁琐, 需要昂贵仪器等缺点, 不利于大范围推广应用, 尤其是基层单位及其现场检测。ELISA法是一种基于抗原、抗体反应和酶化学反应的检测方法, 具有快速、灵敏、操作简单和一次性检测样品量大的特点, 而且不需要复杂、昂贵的仪器设备, 对操作者的专业要求比较低[6,7]。试验采用琥珀酸酐法和碳二亚胺法将沙丁胺醇与蛋白质分子耦联合成人工抗原, 并对合成的抗原进行鉴定, 同时还制备了抗Sal多克隆抗体, 为进一步开发其残留检测的ELISA试剂盒、胶体金试纸和免疫传感器等免疫分析方法奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
沙丁胺醇 (相对分子质量为239.31, 纯度≥99%) 、琥珀酸酐 (相对分子质量为100.04) 、碳二亚胺 (EDC) 、丙烯酰胺 (Acr) 、亚甲基双丙烯酰胺 (Bis) 、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , Sigma公司生产;牛血清白蛋白 (BSA) 、鸡卵白蛋白 (OVA) , Amresco公司生产;四甲基乙二胺 (TEMED) , 美国BBI公司生产;甲醇、无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、过硫酸铵、乙二胺四乙酸 (EDTA) 、冰醋酸、硝酸银、乙醇、醋酸钠、甘油、甲醛、考马斯亮蓝, 均为国产分析纯。
1.2 试验动物
健康雄性新西兰大白兔, 由河北省实验动物中心提供。
1.3 人工抗原的制备
参照参考文献[8], 采用琥珀酸酐法将160 mg沙丁胺醇加到20 mL甲醇中, 使之溶解;旋转蒸发后加入30 mL无水乙醇, 室温搅拌4 h;充分溶解后加入90 mg琥珀酸酐, 磁力搅拌使之反应72 h得到沙丁胺醇琥珀酸衍生物 (Sal-HS) 。称取Sal-HS 40 mg溶于4 mL Tris-HCl缓冲液中, 充分溶解后缓缓加入碳二亚胺 80 mg, 室温搅拌过夜;取BSA 20 mg溶于Tris-HCl缓冲液中, 充分溶解后将BSA 溶液逐滴加入上述反应液中, 搅拌反应过夜。反应结束后, 装入透析袋透析48 h, 期间换液6～9次, 即得免疫抗原Sal-HS-BSA。检测抗原 (Sal-HS-OVA) 的制备方法同Sal-HS-BSA。
1.4 人工抗原的鉴定
1.4.1 紫外扫描 (UA) 法
以Sal-HS不同波长下对应的吸光度作图, 然后以Sal-HS浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标绘制标准曲线;以BSA不同波长下对应的吸光度作图, 然后以BSA浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。对免疫抗原Sal-HS-BSA进行紫外扫描, 获得相应的吸光度, 根据物质吸光度的可加性计算获得相应的浓度, 进行耦联比计算。耦联比的计算公式[9]:耦联比= (CSal-HS/MSal-HS) / (CBSA/MBSA) , 其中C为蛋白浓度, M为相对分子质量。检测抗原Sal-HS-OVA的鉴别方法同Sal-HS-BSA。
1.4.2 SDS-PAGE电泳法
采用垂直平板电泳法对免疫抗原Sal-HS-BSA进行鉴定[10]。配制好12%分离胶后进行灌胶, 在分离层以水封住胶面, 在室温放置1 h待分离胶凝固以后将水倒掉, 灌注配制好的5%浓缩胶, 加入适当梳齿, 室温静置30 min至浓缩胶完全聚合, 备用。将样品浓度稀释至1 mg/mL, 取40 μL样品, 加入等量的样品缓冲液, 沸水浴中煮5 min后上样。同时以标准品BSA作为对照进行电泳, 待电泳结束后, 将胶取出采用考马斯亮兰染色3 h, 脱色液脱色4 h, 最后用紫外凝胶成像系统分析软件分析结果。检测抗原Sal-HS-OVA的鉴定方法同Sal-HS-BSA。
1.5 多抗血清 (PAB) 的制备
取3只健康雄性新西兰大白兔, 耳缘静脉取血后作为阴性对照。首次免疫, 将弗氏完全佐剂与等体积免疫抗原Sal-HS-BSA混合, 乳化后颈背部皮下多点注射。免疫间隔2周后进行第2, 3, 4, 5次免疫, 免疫间隔时间为2周, 将弗氏不完全佐剂与等体积免疫抗原混合, 乳化后颈背部皮下多点注射。第5次免疫后静脉取血, 分离抗血清。
1.6 多抗血清的鉴定
1.6.1 效价测定
采用间接ELISA法测定血清效价。以最适检测抗原量包被检测板, 将抗血清倍比稀释, 以P/N≥2.1 (P为样本吸光度值, N为阴性血清吸光度值, 空白对照为PBS缓冲液) 时的抗血清稀释倍数为此多抗血清的效价。
1.6.2 敏感性测定
用阻断ELISA法测定抗Sal多克隆抗体对不同浓度的Sal的抑制率 (B/B0, 其中B是Sal不同标准浓度下的OD450值, B0是Sal标准浓度下的OD450值) , 以B/B0为纵坐标, 以不同浓度Sal (ng/mL) 的对数值为横坐标, 绘制标准抑制曲线, 以半数抑制浓度 (IC50值) 衡量敏感性。
2 结果
2.1 免疫抗原的合成鉴定结果
2.1.1 紫外扫描法鉴定结果
Sal-HS的紫外扫描结果及标准曲线见图1和图2, 得到的线性方程为y=0.055 5x+0.021 3, R2=0.992 8。BSA的紫外扫描结果及标准曲线见图3和图4, 得到的线性方程为y=0.068 5x+0.014 2, R2=0.999 7。耦联物Sal-HS-BSA的紫外扫描结果见图5, 由图5中可以看出, Sal-HS-BSA在最高吸收峰278 nm下的吸光度值为0.392;通过考马斯亮兰法测得耦联物Sal-HS-BSA中蛋白浓度为5.0 mg/mL, 带入线性方程y=0.068 5x+0.014 2中, 计算耦联物中BSA的吸光度值为0.357 6;根据物质吸光度的可加性原理, 耦联物Sal-HS-BSA中Sal-HS的吸光度值为0.034 4 (0.392-0.357 6) 。将0.034 4带入线性方程y=0.055 5x+0.021 3中计算得Sal-HS浓度为0.236 mg/mL。则耦联比率= (CSal-HS/MSal-HS) / (CBSA/MBSA) = (0.236/404) / (5.0/66 000) =7.7︰1。按照相同的方法测得Sal-HS-OVA耦联比为8.6︰1。
2.1.2 SDS-PAGE电泳法鉴定结果 结果见图6。
从图6可以看出, 耦联物Sal-HS-BSA与BSA电泳条带相比, 有明显拖尾现象, 同时耦联物也有明显的滞后现象, 说明耦联物的相对分子质量有所增加, 证明耦联成功。经紫外凝胶成像系统分析得出, 耦联物Sal-HS-BSA的分子质量为69 ku, BSA的分子质量为66 ku, 偶联比约为7.4∶1, 与紫外扫描的鉴定结果基本一致。耦联物Sal-HS-OVA鉴定及耦联比计算同上。
2.2 多抗血清的鉴定结果
2.2.1 效价的测定结果
第5次免疫后, 静脉取血, 采用间接ELISA方法测定效价, 结果见表1。
由表1可知, 免疫的3只新西兰大白兔血清抗体效价均达到了1∶1×105, 说明获得了较好的免疫效果, 其中3号兔血清效价最高。
2.2.2 敏感性的测定结果
采用阻断ELISA方法对多抗血清敏感性进行测定, 结果见图7。Sal作为竞争药物能与包被抗原竞争性地结合Sal抗体, 抑制了Sal抗体与Sal包被抗原结合, 其抑制率 (B/B0) 与Sal药物的浓度对数线性关系较好, 对Sal抗体的IC50值为9.12 ng/mL, 多抗血清对Sal具有较高敏感性。
3 讨论
Sal属于水杨醇型β-兴奋剂, 分子自身并没有合适的基团可以直接连接到载体蛋白上, 所以需要先将分子上的羟基 (-OH) 转换成羧基 (-COOH) 才能与载体蛋白耦联。根据Sal 分子上的3个羟基的活泼程度, 在无水条件下, 加入琥珀酸酐与Sal分子上酚羟基邻位的羟甲基发生醇解反应, 生成Sal 的琥珀酸衍生物 (Sal-HS) 。然后通过交联剂EDC的加入, Sal琥珀酸衍生物单酯化后使Sal 苯环上添加了1个羧基碳链。在适当缓冲环境里, Sal-HS上的羧基与载体蛋白上的氨基通过缩水反应形成酰胺键使之连在一起, 生成了Sal与载体蛋白的耦联物[11]。鉴定小分子人工抗原的常用方法有紫外扫描法 、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 、红外检测、核磁共振碳谱、标记抗原示踪法等[12]。红外检测 ( IR) 、核磁共振碳谱 (C132NMR) 、标记抗原示踪法等对试验条件和试验人员要求非常高, 且费时、繁琐。目前, 一般均采用紫外扫描法和SDS-PAGE电泳法检测、分析小分子抗原, 用以评价耦联产物是否耦联成功并测算耦联比。本试验中SDS-PAGE电泳法检测结果显示, BSA的泳动速度大于Sal-HS-BSA, 说明Sal-HS-BSA的分子质量大于BSA, 证明耦联成功, 同时采用凝胶成像系统计算了耦联比;在紫外扫描结果中, 根据物质吸光度的可加性原理, 计算了Sal与BSA、OVA的耦联比, 与SDS-PAGE电泳法的鉴定结果基本一致。
试验所得的Sal-HS-BSA耦联物的耦联比为7.7∶1, 用以免疫新西兰大白兔, 制备了抗Sal多克隆抗体, 用间接ELISA法检测多抗血清效价达到1∶1×105, 采用阻断ELISA法对抗体的敏感性进行了测定, 抗体对Sal的IC50为9.12 ng/mL。说明半抗原Sal和载体蛋白耦联成功, 并可获得高效价、敏感的多克隆抗体, 为制备Sal单克隆抗体和建立Sal免疫学分析方法奠定了研究基础和技术储备。
摘要：为了合成沙丁胺醇 (Sal) 人工抗原、制备沙丁胺醇多克隆抗体, 试验采用碳二亚胺法和琥珀酸酐法合成了免疫抗原Sal-HS-BSA和检测抗原Sal-HS-OVA, 通过紫外扫描 (UV) 法和SDS-PAGE电泳法进行鉴定, 并以Sal-HS-BSA免疫新西兰大白兔, 获得了高效价和高敏感性的多克隆抗体。结果表明:Sal与载体蛋白上的牛血清白蛋白 (BSA) 和鸡卵白蛋白 (OVA) 耦联成功, 耦联比分别为7.7∶1和8.6∶1;抗体效价达到1∶1×105, 对Sal的半数抑制浓度 (IC50) 为9.12 ng/mL。说明对人工合成抗原进行免疫可获得高效价、敏感的多克隆抗体。
关键词：沙丁胺醇,人工抗原,多克隆抗体
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抗原抗体 篇7
1 材料和方法
1.1 菌种
禽多杀性巴氏杆菌C48-1(A:5)菌株，购自中国兽药监察所。
1.2 血清
阳性血清按常规方法将C48-1菌株灭活后多次免疫SPF鸡后制备而成;阴性血清采自SPF鸡;试验血清采自不同免疫期的鸡。
1.3 酶标兔抗鸡IgG
购自sigma公司，经测定工作浓度为1∶30 000ㄢ
1.4 禽多杀性巴氏杆菌ELISA抗原的制备与包被
取C48-1菌株接种于含裂解血的马丁琼脂斜面培养基培养24 h后，用含3‰甲醛的灭菌生理盐水洗下菌苔，500 rpm离心去沉淀，再用0.01M、p H7.4的PBS洗涤3次，最终悬浮成光密度1.0(540nm)的细菌悬液。
1.4.1 超声波裂解抗原
按文献[2]方法，将上述菌液经超声波裂解后，1 500 rpm离心30 min吸取上清即为超声波裂解抗原。酶标板每孔加入100 L抗原，置4℃过夜包被。
1.4.2 脂多糖蛋白抗原
按文献[3]方法，将菌液置56℃水浴30 min后，3 000 rpm离心30 min吸取上清即为脂多糖蛋白抗原。酶标板每孔加入100 L抗原，置4℃过夜包被。
1.4.3 全菌抗原
按文献[4]方法，每孔加入100 L菌液，置37℃烘干包被。
1.5 ELISA抗原包被浓度及血清稀释度的测定
用棋盘滴定法分别测定不同抗原的最佳包被浓度以及最佳血清稀释度。
1.6 间接ELISA检测禽多杀性巴氏杆菌免疫血清
按常规程序进行，对12份试验血清和阴性血清进行检测，每份血清同时重复3次，求其平均值作为检测结果。
1.7 特异性试验
1.7.1 阻断试验
将禽多杀性巴氏杆菌阳性血清与C48-1菌液充分混合，37℃作用1.5 h,3 000 rpm/min离心20 min，取上清分别与3种包被抗原进行反应。根据阻断前后样品的OD值变化确定试验的特异性。
1.7.2 交叉试验
用AIV、NDV、IBV、IBDV、MDV、沙门氏菌、副嗜血杆菌阳性血清加入已包被抗原的酶标板中进行ELISA试验，观察结果。
1.8 重复性试验
对5份试验血清分别进行5次ELISA测定，比较血清P/N值的批间变化。
2 结果
2.1 ELISA抗原包被浓度及血清稀释度的测定
根据棋盘滴定法的结果，确定各抗原的最佳包被浓度，超声波裂解抗原为1∶100，脂多糖蛋白抗原为1∶150，全菌抗原为1∶100。最佳血清稀释度均为1∶200ㄢ
2.2 间接ELISA检测禽多杀性巴氏杆菌免疫血清
阴性血清与12份试验血清的检测结果见表1，在试验血清的检测结果中，全菌抗原检测的P/N值最高，说明其敏感度较高;而在阴性血清的检测结果中，超声波裂解抗原的检测值最高，说明其非特异性最高。
2.3 阻断试验
用3种抗原分别检测阻断前后阳性血清的OD值，发现阻断后的阳性血清OD值均为阴性，说明三种抗原均能阻断阳性血清与包被抗原反应，表明建立的ELISA方法都是特异的。
2.4 交叉试验
用3种包被抗原分别检测IBV、IBDV、AIV、NDV、沙门氏菌、鸡副嗜血杆菌阳性血清，结果均为阴性，其中脂多糖蛋白抗原和全菌抗原具有良好的特异性。
2.5 重复性试验
从上述试验血清中随机抽取5份进行重复性试验，结果见表3。比较三种抗原的检测结果，发现全菌抗原的变异系数均低于其他两种抗原，说明全菌抗原的检测结果具有较高的均匀度。
3 讨论
目前常见的禽多杀性巴氏杆菌血清学检测方法有琼脂扩散试验、间接血凝试验以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。由于琼脂扩散试验和间接血凝试验以其较低的敏感性或繁琐的操作决定了这两种方法不适合对大批量血清样品进行快速检测。而大量试验证实间接ELISA方法具有很高的灵敏性[2,5,6]，其检测水平可达ng[7]。此外ELISA还有着特异、快速、准确等特点[8,9]，特别是近年来酶标仪的系统化使间接ELISA的使用更加普遍。
间接ELISA有较高的敏感性，而且非常适于检测大量样品，所以不仅可以进行禽多杀性巴氏杆菌感染的流行病学调查，还可以用于检测疫苗免疫后不同时期的血清抗体，获得抗体的消长规律，从而为制定合理的免疫程序提供科学依据。由于ELISA试验中固相载体对不同抗原的吸附性不一致，各种蛋白对固相载体的吸附性也不尽相同，另外抗原的纯度又会对检测结果产生较大的影响。因此，抗原的选择对ELISA方法的建立至关重要。
本研究选择3种具有代表性的抗原，进行了初步的试验。结果表明全菌抗原比其他两种抗原具有更高的敏感度、特异性和稳定性，这可能是全菌抗原较之其他两种抗原更为纯化，且保存条件温和(4℃保存)，抗原不易损耗的缘故。另外，全菌抗原的包被过程是水分不断蒸发、抗原不断浓缩的过程，这实际上是一种强迫性包被过程，因而减少或消除了湿包被中多种差异因素的影响[10,11]。本实验的研究结果将为下一步建立禽多杀性巴氏杆菌血清抗体的ELISA检测方法奠定基础。
摘要：间接ELISA已在抗体检测中广泛应用,而抗原包被作为间接ELISA中必不可少的一步可直接影响试验的准确性。本试验分别使用超声波裂解抗原、脂多糖蛋白抗原和全菌抗原作为包被抗原,建立相应的检测方法并进行重复性试验。试验证明全菌抗原建立的禽多杀性巴氏杆菌ELISA检测方法在敏感度、特异性、稳定性方面均优于其他两种抗原。
关键词：禽多杀性巴氏杆菌,包被抗原,ELISA
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抗原抗体 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取该院临床申请HCV-RNA检测的325例患者 (325份标本) , 其中阳性结果有48例, 阴性结果有277例, 所有标本均分离血清, 放置于-70℃的冰箱之中进行保存。
1.2 方法
325例患者 (325份标本) 全部进行抗体ELISA检测和丙肝病毒核心抗原检测。
抗体ELISA检测采用HCV-Ab ELISA试剂盒检测, 操作步骤如下: (1) 准备试剂、样品盒标准品, 加入样品盒标准品并置于37度反应30 min; (1) 洗板5次, 加入酶标试剂置于37℃反应30 min; (3) 洗板5次, 加入显色液AB于37℃显色10 min; (4) 加入终止液, 于15 min之内读OD值, 计算。阳性结果进行二次复检;
丙肝病毒核心抗原检测采用HCV-c Ag ELISA试剂盒检测, 操作步骤如下: (1) 准备试剂、样品盒标准品, 加入样品盒标准品并置于37℃反应30 min; (2) 洗板5次, 加入酶标试剂置于37℃反应30 min; (3) 洗板5次, 加入显色液AB于37℃显色10 min; (4) 加入终止液, 于15 min之内读OD值, 计算。阳性结果进行二次复检;采用丙肝病毒RNAPCR检测试剂盒进行丙肝病毒RNA检测, 根据说明书上操作方法进行检测。观察记录各项检测结果并进行对比分析。
1.3 统计方法
该组数据均录入至SPSS19.0软件进行分析, 计数资料采用率 (%) 表示, 比较经χ2检验。
2 结果
该组所选取的325份血清样本, 均全部行抗体ELISA检测和丙肝病毒核心抗原检测, 其中抗体ELISA检测与丙肝病毒核心抗原检测均阳性的标本例数为31例, 抗体ELISA检测及与丙肝病毒核心抗原检测均阴性的标本例数为305例, 丙肝病毒核心抗原ELISA检测为阳性而抗体ELISA检测为阴性时的标本例数为4例, 与单用抗体ELISA检测相较两者联合检测的假阴性率均明显较低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1、2、3。
3 讨论
丙肝为丙型病毒性肝炎的简称, 也可将其称作丙型肝炎, 其主要是由于丙型肝炎病毒感染所致, 为临床传染性疾病之一[3], 丙肝患者通常无显著的临床早期症状且具有较高的致死率, 因此, 对丙肝进行早期确诊与筛查具有重要作用。临床筛查丙型肝炎的手段较多, 其中较为常用的为抗-HCV, 但其具有一定的缺陷[4,5], 对于丙型肝炎感染者而言, 其出现抗-HCV通常需要较长的时间, 进而导致易漏诊的情况发生。HCV-RNA虽对丙肝可进行较好的诊断, 但其检测费用较多, 因此, 在临床筛查丙肝时也不宜应用。
报道显示[6], 由于丙肝感染病毒抗体将长期存于人体之内较易检出, 但患者在感染HVC之后, 其抗HCV通常为缓慢出现, 因此, 一般在进行抗体血清学转换时, 可适当将其进行延迟, 通常可延迟于暴露之后数月发生, 而此时有发生抗HCV假阴性的可能性, 即在抗体可检出前, 或者在血清学转换中的窗口期[7]。在该文研究中, 对325份标本同时进行了抗体ELISA检测与丙肝病毒核心抗原检测, 结果显示, 在抗体ELISA检测和丙肝病毒核心抗原检测结果均为阳性时, 两者联合检测的假阴性率为0%, 而单用丙肝病毒抗体ELISA检测的假阴性率达到12.9%, 与单用丙肝病毒抗体ELISA检测相较应用抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测的假阴性率明显较低 (P<0.05) , 抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测检测结果均为阴性时, 两者联合检测的假阴性率仅为0.3%, 而单用单用丙肝病毒抗体ELISA检测的假阴性率达到2.3%, 与单用丙肝病毒抗体ELISA检测相较应用抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测的假阴性率明显前者较低 (P<0.05) ;当抗体ELISA检测结果呈阴性而丙肝病毒核心抗原ELISA检测结果呈阳性时, 两者联合检测的假阴性率为0%, 单用丙肝病毒抗体ELISA检测的假阴性率达到75.0%, 与单用丙肝病毒抗体ELISA检测相较应用抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测的假阴性率明显前者较低 (P<0.05) , 差异有统计学意义。由此可见, 采用抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测可使假阴性率得到有效的降低。与文献报道相符[8]。分析原因认为其与处于窗口期的丙肝患者无法检出HCV-Ab具有相关性, 虽然抗-HCV如检测为阴性, 但也可能为携带HCV有传染性, 因此较易产生漏诊的情况。而丙肝病毒核心抗原检测 (HCV-c Ag) 则可使HCV检测窗口期进行缩短[8], 进而有效减少了HCV经血液传播的风险, 有利于对免疫功能低下、不产生抗体等HCV携带者进行早期发现。
综上所述, 抗体ELISA检测联合丙肝病毒核心抗原检测操作简单且检测成本较低, 可应用于筛查丙型肝炎, 其效果确切且有利于丙肝的治疗, 采用两者联合检测, 可有效防降低假阴性率, 防止丙型肝炎筛查出现漏诊等情况, 具有重要意义。
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抗原抗体 篇9
噬菌体抗体库技术是抗体工程领域中的最重要的技术,各种小分子抗体相继产生,在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析,导向治疗和基因治疗等多个领域有着潜在的优势。该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点[1]。笔者采用噬菌体抗体库生物学技术构建鼠抗蛔虫卵可溶性抗原噬菌体展示单链抗体库,为基因工程抗体的广泛应用奠定基础,现将试验结果报道如下。
1 材料
1.1 噬菌体及菌株
Escherichia coli TG1、质粒表达载体pCANTAB5E 和辅助噬菌体M13K07,均由Amersham Biosciences公司生产。
1.2 主要试剂及试剂盒
总RNA 抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent) 、逆转录试剂盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit),Gibcobrl公司生产;DNA纯化试剂盒,Promega 公司生产;SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶,购自宝生物工程(大连)有限公司;HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体,Amersham Biosciences公司生产;重组猪蛔虫抗原AD41蛋白,由贵阳中医学院微生物及免疫学实验室制备并保存。
1.3 试验动物
雌性Balb/ c 小鼠,6周龄,体重为20 g,由贵阳医学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 免疫小鼠
给6 周龄雌性Balb/c 小鼠腹腔注射重组猪蛔虫抗原AD41蛋白,每2周加强免疫1 次,共免疫4次。每次免疫后的第3天采血,并用ELISA 方法测定血清抗体效价。第4 次免疫后处死Balb/c小鼠,取脾脏,备用。
2.2 RNA 的抽提及cDNA 第一链的合成
将脾脏放入预冷的研钵中研磨成匀浆,按照总RNA 抽提试剂盒的说明书抽提RNA,按照逆转录试剂盒说明书用Olig(dT)20 引物合成cDNA 第一链。
2.3 鼠抗体VH基因和VL 基因的PCR 扩增及其拼接
以cDNA为模板,参照参考文献[2]中介绍的扩增鼠源抗体重链及轻链可变区的扩增引物序列,连接(Gly4Ser)3肽采用J.S.Huston等[3]介绍的柔性短肽3形式,重链和轻链的序列分别添加互补序列,重链可变区VH 引物为VH1BACK 5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′,VH1FOR 5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3′;轻链可变区VL引物为VK2BACK 5′-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3′,MJK1FONX 5′-CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3′,MJK2FONX 5′-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3′,MJK4FONX 5′-CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3′,MJK5FONX 5′-CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3′。带有限制性酶切位点的全长ScFv 基因引物为VH1BACK Sfi 5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(其中S=G、C,M=A、C,R=A、G,W=A、T),JK1NOT10 5′-GAGTCATTCTGCG-GCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3′,JK2NOT10 5′-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3′,JK4NOT10 5′-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3′,JK5NOT10 5′-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTCAG-CTCCAGCTTGGTCCC-3′,Linker 5′-GGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTG-AGCTCACCCAGTCTCCA-3′ (下划线处为酶切位点,斜体为连接肽),由宝生物工程(大连)有限公司合成。
以cDNA 为模板,应用VH基因引物(VH1BACK、VH1FOR) 和VL 基因引物(VK2BACK、MJK1FONX、MJK2FONX、MJK4FONX、MJ K5FONX) 进行PCR 扩增全套VH和VL。反应条件:94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共30个循环,用扩增产物进行胶纯化回收VH和VL。
以回收的VL 片段为模板,以Linker 与VL 下游引物的等量混合物(MJK1FONX、MJK2FONX、MJK4FONX、MJK5FONX等量混合) 为引物进行PCR扩增。反应条件:94 ℃ 1 min,55 ℃ 3 min,72 ℃ 2 min,共30个循环,用扩增产物进行胶回收Linker-VL片段。
取等量的纯化VH、Linker-VL进行PCR扩增。反应条件:94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共20 个循环。
以扩增产物为模板,与引物JK1NOT10、JK2NOT10、JK4NOT10、JK5NOT10等量混合,以VH1BACKSfi为引物。反应条件:94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环,用扩增产物进行胶纯化回收,即可获得单链抗体(ScFv)片段。
2.4 噬菌体抗体库的构建
将上述PCR 产物ScFv 纯化回收,用SfiⅠ、NotⅠ双酶切,与经同样双酶切的质粒表达载体pCANTAB5E 用T4 DNA 连接酶连接,然后转化大肠杆菌TG1,涂在SOBAG平板上。次日用2 ×YTAG培养基(含20 mg/L氨苄西林及10 mg/L四环素)洗脱菌落,稀释至OD600值为0.5,加入辅助噬菌体M13K07 继续振摇1 h,离心,重悬于2 ×YTAK培养基中,振摇过夜。次日离心收集上清液,加入1/5 体积的PEG/NaCl 溶液,冰浴,离心,重悬沉淀即为噬菌体ScFv库。
2.5 抗体库的扩建
取适量抗体库接种在100 mL 2×YT-ATK(含1%葡萄糖、100 mg/L氨苄西林及20 mg/L四环素)培养基中,37 ℃振摇培养至OD600值为0.68;加入辅助噬菌体M13K07于37 ℃静置60 min;4 ℃、3 500 g离心15 min,沉淀重悬于100 mL 2×YT-ATK(含100 mg / L氨苄西林、20 mg / L四环素、70 mg / L卡那霉素) 中,过夜培养;4 ℃、8 000 g离心15 min;取上清液用4%PEG-8000 和3%NaCl 沉淀;4 ℃、10 000 g离心25 min;弃上清液,将离心管倒置于无菌吸水纸上10 min;除去PEG液,取沉淀用4 mL PBS 缓冲液重悬,移入另一离心管,反复吹打混匀,10 000 g离心5 min,上清液即为噬菌体抗体库,检测库容。用SB 培养液对所制备的噬菌体抗体库进行10 倍系列稀释(1×106～1×109),分别加入100 μL大肠杆菌TG1(OD600值=1),室温感染20 min,涂在SOBAG 平板(含100 mg/ L氨苄西林),于37 ℃培养过夜,次日计数噬菌落形成单位(cfu)和噬菌体抗体库的库容,4 ℃保存,备用。
2.6 抗体库重组率测定和多样性分析
从SOBAG 平板上随机挑取10个单菌落,用相应的引物进行PCR 扩增,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测相应扩增条带,测定抗体库的重组率;随机挑取抗体库,共10个阳性单克隆,PCR 扩增ScFv 基因片段,电泳回收后BstNⅠ酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳检测并分析酶切图谱。
2.7 重组质粒的双酶切鉴定
随机取PCR 反应阳性克隆,提取质粒,以SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.8 噬菌体抗体库的富集筛选
将重组蛋白抗原以每孔100 ng 包被ELISA 板,3%BSA 封闭,PBST洗涤后加入噬菌体抗体库100 μL,37 ℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液,以PBST 洗涤1次(第2轮洗涤5 次,第3 ～ 5 轮洗涤10 次),加入100 μL 洗脱液[含0.1 mol / L HCl(pH值为2)和0.1%BSA],于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出,立即用6 μL 2 mol/ L三羟甲基氨基甲烷(Tris)中和,加入2 mL大肠杆菌TG1,37 ℃静置20 min;加入20 mL SOBAG(含70 mg/L卡那霉素),37 ℃培养2 h;加入辅助噬菌体M13K07、卡那霉素,反复淘洗5次,收集沉淀,特异性噬菌体抗体得到高度富集。
2.9 单克隆噬菌体抗体的鉴定
用经5 轮筛选后的洗脱噬菌体感染大肠杆菌TG1,涂于SOBAG平板,过夜培养;随机挑选细菌菌落,接种于4 mL含氨苄西林和四环素的SOBAG中,37 ℃振荡培养过夜;取200 μL加至4 mL含同样量抗菌素的SOBAG中,37 ℃振荡培养2 h;加入40 μL辅助噬菌体M13K07,培养2 h;再加入卡那霉素至70 μg /mL,30 ℃振荡培养过夜;次日离心收集上清液,即为单克隆噬菌体抗体,4 ℃保存,备用。将待检噬菌体抗体与等量1%BSA 混合,室温孵育20 min;加至经重组猪蛔虫抗原AD41蛋白包被和BSA封闭的ELISA 板中,于37 ℃温育2 h;用PBST 洗板4 次,PBS 洗涤2 次,与HRP 标记的M13 噬菌体单克隆抗体进行结合反应,TMB 显色。
3 结果
3.1 鼠抗体VH 和VL 基因的PCR扩增结果
提取Balb/c小鼠的总RNA,经反转录PCR 扩增出免疫球蛋白的重链、轻链可变区基因,其中重链可变区基因和轻链可变区基因大小在300～400 bp之间,见图1。
M.100 bp DNA Ladder;1,2.分别为VH、VL基因PCR扩增产物。
3.2 VH与VL基因的拼接结果
将纯化后的VH 和VL 基因片段与编码(Gly4Ser)3的Linker 基因片段混合,经重叠延伸反应将VH 和VL 基因随机连接成ScFv片段,并进行PCR 扩增。电泳结果显示,扩增的ScFv大小约为750 bp,见图2。
1.PCR扩增产物;M.DL-2 000 Marker。
3.3 噬菌体抗体库的重组率及库容计算结果
构建的初级抗体库按照公式(库容= 涂板后生长出的噬菌斑数目/涂板菌液量×涂板菌液稀释的倍数)计算,得库容量为3.0×106 cfu。随机挑取10个菌落,经PCR鉴定表明,重组率为80%(8/10),故次级抗体库的库容量为2.6×106 cfu。重组单克隆菌落的PCR鉴定结果见图3。
M.DL-2 000 Marker;1～10.随机挑选的单菌落。
3.4 抗体库的多样性
随机挑取10 个单菌落,经PCR 扩增ScFv片段,电泳回收后用BstNⅠ酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,抗体库中抗体分子的多样性良好,结果见图4。
M.DL-2 000 Marker; 1～10.随机挑选的阳性单克隆。
3.5 重组质粒的双酶切鉴定结果
随机提取PCR反应阳性克隆,通过试剂盒抽提质粒,用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,结果见图5。
M.DL-2 000 Marker;1.双酶切产物。
3.6 噬菌体抗体库的筛选结果
对噬菌体抗体库进行5 轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,可以看到随着洗涤次数的增加,噬菌体抗体的收获率增加,经过5轮筛选增加约113倍,表明噬菌体抗体库得到富集。
3.7 单克隆噬菌体抗体的鉴定结果
从第5 轮筛选得到的菌落中随机挑选30个单克隆噬菌体抗体,制备噬菌体抗体,经ELISA检测,有25个单克隆噬菌体抗体对重组蛋白呈阳性反应。
4 讨论
长期以来,猪蛔虫病的防治均以药物驱虫为主,但驱虫药物均不同程度地存在不良反应且长期使用能够产生抗药性等危害。因此,对蛔虫病诊治的研究在公共卫生学方面有着重要的意义。
相对其他虫种来说,关于猪蛔虫病免疫诊断技术的研究较少。常常采用粪便的直接涂片法或饱和盐水漂浮法等简单的方法并结合临床症状对猪蛔虫作出诊断。但由于猪蛔虫具有特殊的生活史,当通过粪便检出虫卵时,往往幼虫已经在宿主的肝脏、肺脏器官内移行,并造成了损害,而且粪便检虫卵法检出率低,也容易漏检。
噬菌体抗体库技术的建立为基因工程抗体的研究翻开了新的一页[4,5,6,7,8]。该技术用PCR方法扩增出抗体的全套可变区基因,重组到原核表达载体中,并通过与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,将Fab或ScFv表达在噬菌体表面,再利用“吸附-洗脱-扩增”过程高效地筛选出特异的小分子抗体片段。目前,国内外已报道了多种噬菌体抗体库的构建,并从中筛选出多株具有表达功能活性的小分子抗体,如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ、gpl20等ScFv或Fab抗体[9,10,11,12],有些已进入了临床Ⅰ/Ⅱ期试验。目前,这些小分子抗体在感染性疾病的诊断与防治[13,14]、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究[15]、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗[16]、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用。
在试验中,用重组猪蛔虫抗原AD41蛋白免疫Balb小鼠,使Balb小鼠产生针对重组猪蛔虫抗原AD41蛋白的抗体,提取脾细胞RNA,扩增获得全套抗体重链、轻链可变区基因,构建重组抗体库。库容是重组抗体库多样性的一个指标,是保证有效筛选的前提基础。因此,在设计抗体重链及轻链可变区基因扩增引物时,应充分考虑鼠免疫球蛋白基因不同家族的可变区序列。研究扩增设计可变区引物时引用郑志明等[2]设计的引物进行鼠源性重链和轻链的扩增,能够保证扩增的多样性。
