高效抑制剂

关键词：

高效抑制剂（精选六篇）

高效抑制剂 篇1

1.1 教材的地位和作用

中药制剂分析是以中医药理论为指导, 应用现代分析理论和方法, 研究中药制剂质量的一门应用学科[1], 是对药品质量的最后把关, 即应用《中国药典》规定的方法和技能, 对中药制剂进行规范检验, 并对其真伪、优劣作出客观公正的评价, 从而避免“毒胶囊”等事件的发生。

高效液相色谱法位于《中药制剂分析》中的第四章第四节, 是本章的重点内容之一。本节是在学习了气相色谱法的基础上对色谱法含量测定的进一步学习。高效液相色谱法是目前使用频率最高的含量测定方法, 应用范围十分广泛, 因此, 通过高效液相色谱法的学习, 能够使学生更好地掌握相关技能, 为从事中药制剂质量控制等工作奠定基础。

1.2 教学目标

通过对双黄连口服液中黄芩苷含量测定的学习和实践, 使学生学会采用高效液相色谱法测定中药制剂中有效成分的含量。

(1) 知识目标:掌握高效液相色谱法的基本原理、仪器的组成、定量分析的计算方法;

(2) 能力目标:学会高效液相色谱仪的基本操作, 能准确计算出中药制剂中有效成分的具体含量;

(3) 素质目标:培养学生“依法检验、实事求是”的职业道德, 让学生知道检验结果的准确与否直接关系到患者的用药安全, 融思想政治教育和人文教育于始终。

1.3 教学重点、难点

重点:高效液相色谱仪的基本操作, 高效液相色谱法含量测定的计算方法。

高效液相色谱法是目前使用频率最高的含量测定方法, 因此, 高效液相色谱仪的基本操作、含量测定的计算方法是从事中药制剂检验工作的必备技能, 是本节的教学重点。

难点:高效液相色谱仪的基本原理和基本操作。

高效液相色谱仪的基本原理深奥、复杂, 操作注意事项多, 仪器价格昂贵, 学生实践机会少, 因此, 学生掌握高效液相色谱仪的基本操作存在一定的难度。

2 说教法及学法

2.1 学情分析

授课对象是中药制药技术专业大专二年级下学期的学生, 学生基础薄弱, 抽象思维能力较差, 但学习兴趣高。通过大一下学期医药统计基础的学习, 他们对相关、回归等数据处理方法有了一定的了解, 但公式、计算很繁琐, 可能存在厌学、畏难心理。学生通过气相色谱法的学习, 对色谱法分析中药中有效成分的含量有了一定的了解。

2.2 教法

教无定法, 贵在得法。选择有效的教学方法是取得良好教学效果的保证[2]。根据本次授课内容及学生需要具备较强形象思维能力和一定抽象思维能力的实际, 本次课采用任务驱动的教学模式, 穿插使用提问法、类比法、讨论法、归纳法、演示法等多种教学方法, 综合运用多媒体、网络、图像、视频、Flash动画等多种教学手段, 将抽象问题形象化、具体化;将复杂问题简单化、程序化;同时适时、恰当地运用现代办公系统代替繁琐的数学计算, 将枯燥、繁琐的问题人性化、简单化, 排除学生的畏难心理, 激发学生的学习兴趣。

2.3 学法

在任务驱动下, 将需要学习的知识转变为需要完成的任务, 让学生成为学习的主体, 使学生在完成任务的同时学到知识, 实现“在做中学, 学中做”。同时在完成任务的过程中, 教师引导学生去发现问题、分析问题、解决问题, 引导学生通过知识的纵向类比、生活常识的联想、归纳总结等方法达到最佳的学习和记忆效果。

3 说教学环节设计

3.1 总体设计原则

充分体现“学生为主体, 教师为主导”和以人为本的全面发展理念, 以工作过程为导向、工作任务为驱动, 坚持“理论必需够用、突出实践技能”的原则, 深入浅出, 理论联系实际培养高素质的技能型人才。

3.2 具体设计

3.2.1 导入新课 (提问法, 任务驱动法) 复习上一节气相色谱

法内容, 引入任务“采用双黄连口服液实物展示, 现需要测定双黄连口服液中有效成分黄芩苷的含量”, 提问:色谱法按照流动相的状态来分, 可以分为哪几类?能否采用气相色谱法测定黄芩苷含量?

设计意图:温故知新, 承前启后, 让学生进一步掌握色谱的分类及气相色谱法的适用范围。通过提出任务, 激发学生的求知欲望, 调动学生的学习积极性和主动性, 引导学生进行高效液相色谱法的探究学习。

3.2.2 讲授新课 (任务驱动法、类比法、示范法、讨论法) 任务引领:

采用教师引导, 学生小组讨论的方式, 通过经典液相色谱法和气相色谱法的不足, 引出高效液相色谱法的概念;通过高效液相色谱法、经典液相色谱法和气相色谱法的纵向比较, 引出高效液相色谱的适用范围及优点。通过气相色谱仪的类比, 得出高效液相色谱仪的基本组成。

任务分析:通过教师引导, 学生讨论的方式, 得出高效液相色谱法测定中药中有效成分含量的基本程序, 即制备供试品溶液, 检测和测定结果的计算。培养学生养成爱动脑筋的良好习惯和分析问题、解决问题的能力, 同时使学生加深对本单元内容的理解。

任务实施:以双黄连口服液中黄芩苷含量测定为例, 讲解并示范相关操作, 在此基础上让学生分组实践, 强化训练实践技能。

(1) 供试品溶液的制备:对于含量测定而言, 细节决定成败, 因此该部分的教学重点是进一步规范学生的操作, 采用讨论的方式让学生列出操作过程中需要注意的事项, 让学生在制备过程中加以注意。学生制备好供试品的溶液后, 让他们知道必须微孔滤膜过滤后才能进样, 接下来用演示的方式向学生讲解如何进行微孔滤膜过滤样品。

(2) 检测:主要让学生掌握高效液相色谱法的基本操作。这是本单元教学的重点和难点, 主要采用讲解、示范、实践相结合的方式进行教学。首先采用实物和示意图相结合的方式向学生讲解高效液相色谱仪的基本组成, 通过Flash动画向学生展示高效液相色谱仪的基本原理和基本操作, 同时可以让学生在Flash动画中进行简单的模拟操作。接着采用讲解和示范相结合的方式向学生讲解工作站的基本操作、微量注射器的使用等。教师以黄芩苷对照品为例, 示范仪器的基本操作, 在此基础上让学生分组实践进行样品检测。

(3) 含量计算:主要是让学生学会含量的计算方法。运用现代办公系统代替繁琐的数学计算, 将枯燥、繁琐的问题人性化、简单化, 激发学生的学习兴趣。首先告诉学生可以不用计算, 利用计算机直接得到回归方程, 这样调动学生的好奇心和学习的积极性。接着用演示的方式向学生介绍如何在Excel中得到浓度和峰面积之间的回归方程, 如何计算出样品中的具体含量, 接下来让学生进行计算, 算出每组测定的结果。

任务评价:先让学生汇报测定结果及计算过程, 并进行自我评价, 专题讨论误差的来源, 这样可以锻炼学生的语言组织能力, 表达能力及分析问题、解决问题的能力。同时学生讨论的内容可以给教师以信息反馈, 了解学生还有哪些知识、技能掌握的不够, 在此基础上教师进行归纳总结, 让学生更好地掌握相关知识和技能。

任务延伸:对本单元的内容进行延伸、迁移, 让学生通过双黄连口服液中黄芩苷含量测定这一实例, 掌握高效液相色谱法测定中药制剂中有效成分含量的方法。

设计意图:以任务驱动法为主, 穿插使用类比法、示范法、讨论法等多种教学方法, 将需要学习的知识转变为需要完成的任务, 从而引导学生去发现问题、分析问题、解决问题, 使学生从被动地学习知识变成主动地完成任务, 充分激发学生学习的主观能动性, 努力使学生的学习状态从“要我学”转变为“我要学”。充分体现出“以学生为主体, 以教师为主导, 以发展为主线”的现代教学理念[3]。

4 说教学评价

采用综合评价的方法, 除了教师对学生的评价外, 还让学生进行自我评价和小组评价, 评价内容也不局限于期末考试成绩和平时成绩, 而是从理论、技能、态度、职业素养、协作精神、学习能力、表达能力等多方面进行评价, 实行课堂教学和工作岗位的无缝衔接, 让学生将来能够更好地适应工作岗位。同时“不以成败论英雄”, 考核的指标也不仅仅是实验结果的准确与否, 而应注重学生在整个教学、实践过程中的掌握情况, 注重过程考核, 以实践技能为主。

参考文献

[1]江滨.中药制剂分析[M].北京:科学出版社, 2005.

[2]张运良, 刘梯楼, 孙双姣, 等.薄层色谱说课设计[J].卫生职业教育, 2012, 30 (3) :68-70.

细菌密度感应系统抑制剂 篇2

细菌密度感应系统抑制剂

许多条件致病菌依赖密度感应系统作为毒力表达的`最重要的调节器.该文就革兰氏阴性细菌密度感应系统抑制剂的作用机制、分离与鉴定及应用等方面进行系统阐述.

作 者：杜娟 黄远帅 DU Juan HUANG Yuan-Shuai 作者单位：重庆医科大学医学检验系、临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室、重庆市重点实验室,重庆,400016刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：26(4)分类号：Q93关键词：密度感应系统 密度感应系统抑制剂 信号分子

高效抑制剂 篇3

1 仪器与试药

Agilent 1260 Series高效液相色谱仪 (示差检测器) , 色谱柱Ultimate氨基柱5μm 4.6×250mm。

乳糖及蔗糖对照品购自中国药品生物制品检定所, 注射用盐酸表柔比星为市售样品, 商品名为法玛新, 辉瑞制药 (无锡) 有限公司, 乙腈为色谱纯, 其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

乳糖对照品溶液:精密称取乳糖对照品0.2g, 置于100m L量瓶中。用水配成浓度为2mg/ml的溶液;蔗糖对照品溶液:精密称取蔗糖对照品0.2g, 置于100m L量瓶中, 用水配成浓度为12mg/ml的溶液;混合对照品液:分别取乳糖对照品及蔗糖对照品于同一容量瓶中, 加水制成2mg/ml的溶液。

供试品溶液的制备:精密称取注射用盐酸表柔比星样品1瓶, 置25ml量瓶中, 加水溶解并定容至刻度, 摇匀。

2.2 专属性试验

通过筛选, 确定色谱条件为色谱柱为Ultimate NH2柱, 以乙腈:水 (57:43) 为流动相, 流速为1.0ml/min, 柱温45℃。取对照品混合液进行试验。结果乳糖与蔗糖的分离度为2.02, 理论塔板数以乳糖计为5900。取盐酸表柔比星及羟苯甲酯适量, 加水制成溶液, 进样, 结果盐酸表柔比星及羟苯甲酯不干扰含量测定。

2.3 耐用性试验

更换实验用色谱柱 (三根不同氨基色谱柱) 、流动相比例 (乙腈比例变化±2%) 、柱温 (35℃、40℃、45℃) 及流速 (0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min) , 考察各项指标变化对含量测定影响, 同时考察乳糖与蔗糖的分离度, 并评价塔板数, 结果表明各项指标变化对含量测定结果无明显影响, 乳糖与蔗糖分离度符合规定, 塔板数较高。耐用性试验符合规定。在各种色谱条件下对称因子在0.9至1.1之间, 塔板数均大于5000。

2.4 线性范围试验

精密称取乳糖对照品适量, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为乳糖的对照品储备液。分别精密量取对照品储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml, 分别置于25ml的容量瓶中, 分别加水稀释至刻度, 摇匀。制成系列溶度溶液, 作为线性溶液, 分别精密量取20μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以乳糖的浓度为横坐标, 乳糖峰面积为纵坐标, 计算线性回归方程, 结果当进样量为20μl时乳糖在0.25mg/ml~2.0mg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.5 准确度试验

精密称取乳糖对照品, 加水溶解并稀释制成2mg/ml的溶液, 作为对照品溶液。精密称取注射用盐酸表柔比星制剂适量各三份, 分别置于25ml容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀。分别精密量取对照品溶液及供试品溶液适量, 加水稀释至10ml, 作为供试品溶液80%、100%、120%组。精密量取对照品溶液及各供试品溶液20μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算乳糖的含量, 计算回收率。结果表明平均回收率为98.7%, RSD为1.8%, 准确度试验符合试验要求。

2.6 重复性及中间精密度试验

分别精密称取注射用盐酸表柔比星供试品6份, 分别加水使溶解并稀释制成供试品溶液。按照乳糖含量测定方法进行重复性试验, 结果6个供试品本品含量为99.2%, RSD为0.7%, 重复性符合规定。

取注射用盐酸表柔比星供试品, 照含量测定方法进行试验, 变动因素为实验时间、实验人员, 考察含量测定结果变化情况。结果6次测定平均含量为99.7%, RSD为1.6%, 中间精密度结果符合规定。

2.7 溶液稳定性试验

精密称取供试品适量, 按照已拟定的含量测定方法制备乳糖供试品溶液, 室温条件下放置放置24小时, 分别于0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时及24小时进样。考察乳糖峰面积变化情况, 结果乳糖峰面积在24小时内的, 表明供试品溶液在室温条件下放置8小时内较稳定。

2.8 样品含量测定

取注射用盐酸表柔比星供试品5瓶, 加水溶解并转移至25ml容量瓶中, 定容, 按照所确定含量测定方法测定供试品含量, 结果5瓶供试品乳糖量分别为50.6mg、51.8mg、49.6mg、52.0mg、53.1mg。考虑到装量差异, 供试品中乳糖量基本一致。

3 讨论

所建立含量测定方法可行, 操作简便, 结果准确, 可以用来测定注射用盐酸表柔比星中乳糖含量, 也可为制剂处方筛选提供方法。

摘要：目的:建立注射用盐酸表柔比星制剂中乳糖含量测定方法。方法:采用离子对高效液相色谱法, 色谱柱为Ultimate NH2柱 (250mm*4.6mm, 5um) , 以乙腈:水 (57:43) 为流动相, 流速为1.0ml/min, 柱温45℃。结果:盐酸表柔比星不干扰乳糖含量测定, 耐用性试验符合规定, 乳糖溶液的溶度在0.25mg/ml至2.0mg/ml范围内线性关系良好, 准确度平均回收率为100.5%, RSD为0.8%, 重复性及中间精密度符合规定, 溶液稳定性研究结果表明溶液在24小时内稳定。结论:所建立的含量测定方法操作简便、准确, 重现性好, 可用于注射用盐酸表柔比星含量测定, 可更好地控制产品质量。

关键词：乳糖,含量测定,方法学,高效液相色谱法

参考文献

[1]杨自洁.龚吉军.任国谱.邓放明原料乳与乳制品中碳水化合物质量控制研究进展[J].食品工业科技, 2012 (22) .

[2]伍桃英, 李梦怡, 李亦蔚, 沈娜, 曾知音, 程云辉.3种测定乳制品中乳糖含量方法的比较[J].食品与机械, 2010, 9, 26 (5) :71-72.

高效抑制剂 篇4

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子天平(梅特勒MT-5,XS105 DualRange),离心机(LD4-2A),高效液相色谱仪(Waters 1525,岛津LC-10AT,LC-10ATVP)。

1.2 试药

硝酸甘油对照品(中检所提供,批号100236-200401,0.998%)、硝酸甘油溶液(北京益民药业有限公司生产)、硝酸甘油片[上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂等3个厂家共5批]、硝酸甘油注射液(广州白云山明兴制药有限公司等4个厂家共9批)、水(纯化水)、乙腈(色谱纯试剂)。

2 方法与试验

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(4.6mm×150mm,5μm);流动相:乙腈-水(50∶50);流速:1.0ml/min;进样量:20μl;检测波长:215nm。上述色谱条件下系统适用性、空白辅料、供试品溶液和自身对照溶液色谱图见图1～7。

2.2 系统适用性溶液的制备

取硝酸甘油对照品适量,用1mol/L盐酸溶液溶解并制成每毫升中含硝酸甘油0.5mg的溶液,置100℃水浴中加热30min,放冷,用1mol/L氢氧化钠溶液调至中性,照上述色谱条件测定,在硝酸甘油峰相对保留时间为0.5处应出现降解物峰(二硝酸甘油)。理论板数按硝酸甘油峰计算不低于2000。

2.3 空白辅料溶液的制备

片剂除硝酸甘油外按处方比例称取其他辅料,混匀,按“2.5.2”项下方法制备片剂的空白辅料溶液。硝酸甘油溶液及其注射液精密量取无水乙醇按“2.5.1”项下方法制备硝酸甘油溶液及其注射剂的空白辅料溶液。

2.4 自身对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml,置100ml量瓶中,用流动相[乙腈-水(50∶50)]稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。

2.5 供试品溶液的制备与测定

2.5.1 硝酸甘油溶液供试品溶液的制备与测定:

取本品适量,用流动相稀释制成每1ml中约含硝酸甘油1mg的溶液,作为供试品溶液;照上述色谱条件测定,按主成分自身稀释对照法计算杂质的量。

2.5.2 硝酸甘油片供试品溶液的制备与测定:

取本品5片(规格:0.5mg),置25ml量瓶中,加流动相15ml,超声振荡3min,振摇30min,放冷至室温,用流动相稀释至刻度,摇匀,以每分钟4000转离心5min,上清液作为供试品溶液;照上述色谱条件测定,按主成分自身稀释对照法计算杂质的量。

2.5.3 硝酸甘油注射液供试品溶液的制备与测定:

取本品适量,用流动相稀释制成每毫升中含硝酸甘油1mg的溶液,作为供试品溶液;照上述色谱条件测定,按主成分自身稀释对照法计算杂质的量。

2.6 仪器精密度实验

取对照溶液(浓度为10μg/ml)连续进样6次,RSD为1.5%。

2.7 标准曲线的绘制

精密称定硝酸甘油对照品12mg,置100ml量瓶中,用流动相溶解,并稀释至刻度,作为标准贮备液。分别精密吸取此贮备溶液适量,加溶剂稀释成浓度为0.5、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的溶液。按正文色谱条件测定,在浓度0.5～11.7μg/ml范围内线性关系良好,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作图,计算线性回归方程为:A=15262C+1358.9,r=1(n=8)。

2.8 检出限

按信噪比3∶1计算,硝酸甘油的检出限为3.12ng/ml。

2.9 破坏性实验

取硝酸甘油对照品适量,加1mol/L盐酸溶液制成每毫升中含0.5mg的溶液,置100℃水浴中加热30min,放冷至室温,用1mol/L氢氧化钠溶液调至中性,作为酸性破坏实验;取硝酸甘油对照品适量,加1mol/L氢氧化钠溶液制成每毫升中含0.5mg的溶液,置100℃水浴中加热30min,用1mol/L盐酸溶液调至中性,作为碱性破坏实验;取硝酸甘油对照品适量,加流动相制成每毫升中含0.5mg的溶液,置1500LX日光灯下照射30min,作为光照破坏实验;取硝酸甘油对照品适量,加30%过氧化氢0.5ml,用流动相制成每1ml中含0.5mg的溶液,放置30min作为氧化破坏实验。照上述色谱条件测定,记录色谱图。硝酸甘油溶液在碱性条件下已分解完全;对光照、氧化基本稳定;在酸性条件下降解。现设的色谱条件对降解产物有很好的分离。

2.10 样品测定

取硝酸甘油溶液、硝酸甘油片和硝酸甘油注射液样品,按供试品溶液的制备项下所述方法进行操作,在上述色谱条件下,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入高效液相色谱仪,记录各自的色谱图和峰面积,按自身对照法计算有关物质的量。结果见表1、表2、表3。

3 讨 论

硝酸甘油溶液及其制剂(硝酸甘油片)质量标准最早收载于1985年版《中国药典》二部[2],根据国家药典委员会国药化发[2008]25号文“关于发送《中国药典》2010年版(二部)化学药品科研项目会议纪要的通知”要求、各生产单位对标准的修订意见及国内外质量标准情况,建立了反相高效液相色谱法测定硝酸甘油溶液及其制剂有关物质。该方法设计参照英国药典[3]收载的硝酸甘油溶液和硝酸甘油片有关物质检查项下的色谱条件,英国药典收载的硝酸甘油溶液和硝酸甘油片所用的色谱条件基本相同,区别在于硝酸甘油溶液使用戊四硝酯(pentaerythrityltetranitrate)作为系统适用性的参照物,硝酸甘油片使用硝酸甘油在酸性条件下加热产生的降解产物(二硝酸甘油)与主成分的相对保留时间作为系统适用性的参数。由于戊四硝酯为易爆物且不易得到,故最终参考硝酸甘油片所用的色谱条件。

硝酸甘油注射液的辅料为无水乙醇,与硝酸甘油溶液相同,乙醇的干扰峰出现在2.5min前,对有关物质测定无干扰,但测定时均应扣除乙醇峰。硝酸甘油片各厂家的辅料不尽相同,其中北京益民药业有限公司的辅料为:微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁,经实验,辅料的响应峰在1.5min处。故测定时应扣除溶剂峰和相应的辅料峰。

摘要：目的 探讨测定硝酸甘油溶液及其制剂的有关物质的方法。方法 采用高效液相色谱法,用自身对照法测定硝酸甘油溶液及其制剂的有关物质。色谱柱为DiamonsilC18(4.6mm×150mm,5μm),以乙腈-水(50∶50)为流动相,于波长为215nm处检测。结果 硝酸甘油在0.5～11.7μg/ml(A=15262C+1358.9,r=1,n=8)范围内线性关系良好,仪器精密度实验RSD=1.5%(n=6),最低检测限为3.12ng/ml。结论 采用反相高效液相色谱法测定硝酸甘油及其制剂的有关物质简便快捷,能准确地测定产品的有关物质。

关键词：反相高效液相色谱法,硝酸甘油,有关物质

参考文献

[1]Goodman LS,Gilman A.The pharmacological basis of therapeutics[M].New york:Macmillan Publishing Co,1980:819.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:人民卫生出版社,1985:521.

高效抑制剂 篇5

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

宫颈癌Caski细胞株由四川大学妇科肿瘤实验室惠赠;新型重组高效复合干扰素 (rSIFN-co) 由四川辉阳生命有限公司惠赠;同类型复合α干扰素 (infergen) 由美国安进公司生产;普通重组Ⅰ型干扰素干扰素α-2b (IFNα-2b) 购自哈药集团医药有限公司;顺铂注射液由云南生物谷灯盏花药业有限公司生产;MTT试剂为Sigma公司产品;二甲基亚砜为美国GAYLORD生产企业产品;流式细胞仪;航新ZS-3板式酶标仪。

1.2 Caski细胞生长抑制试验

1.2.1 细胞培养与分组

用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释药品, 在96孔培养板中培养宫颈癌Caski细胞。以培养液调定细胞数为1×105/ml制成单细胞悬液, 在培养板各孔中加入100 μl细胞悬液。向培养板中分别加入rSIFN-co、复合α干扰素、IFNα-2b和顺铂, 每种药物的浓度梯度为0.156 μg/ml、0.625 μg/ml、2.5 μg/ml和10 μg/ml, 并设置对照组, 每个浓度设3个复孔。放置于37℃、5%CO2孵箱培养72小时。

1.2.2 MTT法检测细胞生长抑制率

配制MTT试剂, 使其浓度为5 mg/ml。培养板各孔分别加入10 μl MTT液, 轻微震荡使其混匀, 放置于37℃, 5%CO2孵箱中反应4小时后, 见培养板孔底部出现蓝色结晶。弃去培养板中上清液, 每孔加入100 μl二甲基亚砜, 室温下待结晶溶解, 在570 nm波长酶标仪读取OD值。

1.2.3 计算细胞生长抑制率

细胞生长抑制率= (1-样品孔OD值/对照孔OD值) ×100%。

1.3 Caski细胞凋亡试验

1.3.1 细胞培养与分组

分13组在含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中培养宫颈癌Caski细胞, 第1组直接用培养液培养72小时, 作为对照组;第2～4组rSIFN-co浓度分别为0.156 μg/ml、0.625 μg/ml、2.5 μg/ml;第5～7组复合α干扰素浓度分别为0.156 μg/ml、0.625 μg/ml、2.5 μg/ml;第8～10组IFNα-2b浓度分别为0.156 μg/ml、0.625 μg/ml、2.5 μg/ml;第11～13组顺铂浓度分别为0.156 μg/ml、0.625 μg/ml、2.5 μg/ml。

1.3.2 流式细胞仪检测Caski细胞凋亡率

收集每组细胞至离心管中以1000 r/min离心5分钟, 弃去上清液, 采用Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡。每样本细胞数约为1×106个, 用孵育缓冲液洗1次, 1000 r/min离心5分钟, 用100 μl的标记液重悬细胞, 室温下避光孵育15分钟, 以1000 r/min离心5分钟沉淀细胞, 孵育缓冲液洗1次, 加入荧光溶液在4 ℃下孵育20分钟, 避光并不时震动, 以流式细胞仪检测。

1.4 统计学处理

所有定量分析数据以undefined表示, 采用方差分析不同药物、不同浓度组之间的差异, 应用SPSS 14.0软件包进行统计学分析。

2 结 果

2.1 干扰素对Caski细胞生长抑制的作用

宫颈癌Caski细胞在含rSIFN-co 0.625 μg/ml的培养基中培养72小时后, 可见细胞生长明显受到抑制, 体积缩小, 并出现凋亡小体, 细胞数目明显减少, 且随干扰素浓度的增加, 变化越明显。同样以复合α干扰素、IFNα-2b和顺铂0.625 μg/ml作用72小时后, 细胞生长受到抑制, 出现凋亡小体, 细胞数目明显减少。对Caski细胞生长的抑制作用以rSIFN-co和顺铂明显, 图1 (见插页4-1) 。对照组Caski细胞贴壁生长, 排列较紧密, 细胞数量较多, 随着细胞培养时间的延长, 细胞逐渐增多。

2.1.1 顺铂及rSIFN-co对宫颈癌细胞的抑制作用

见表1, rSIFN-co与顺铂均对宫颈癌细胞生长有抑制作用, 且作用效果随浓度增加而增强, 呈剂量效应性。但是rSIFN-co对宫颈癌细胞生长抑制的作用不及顺铂。

①不同药物浓度间比较, P<0.01;②与同浓度顺铂组比较, P<0.01

2.1.2 干扰素对宫颈癌细胞的抑制作用

见表2, 抑制率随干扰素作用浓度增加而升高, 特别是rSIFN-co在低浓度时对宫颈癌细胞生长的抑制作用高于另两种常用干扰素的作用。

2.2 顺铂及rSIFN-co促进Caski细胞凋亡的作用

见表3, 顺铂及rSIFN-co均能促进宫颈癌细胞发生凋亡, 且作用效果随干扰素浓度增加而增强, 呈剂量效应性。较高浓度rSIFN-co促进宫颈癌细胞凋亡的作用与顺铂无明显差异。

①不同药物浓度间比较, P<0.01;②与同浓度复合α干扰素组比较, P<0.01;③与同浓度IFNα-2b干扰素组比较, P<0.01

①与对照比较, P<0.01;②与同浓度顺铂组比较, P<0.05

2.3 干扰素促进Caski细胞凋亡的作用

见表4, rSIFN-co促Caski细胞凋亡的作用强于IFNα-2b的作用;在低浓度时对宫颈癌细胞的促凋亡作用强于复合α干扰素的作用。

①与对照比较, P<0.01;②与同浓度复合α干扰素组比较, P<0.01;③与同浓度IFN2-2b组比较, P<0.01

3 讨 论

干扰素最主要的作用是抗病毒作用, 目前临床上主要用干扰素来治疗各种病毒感染, 特别是人乳头瘤病毒 (HPV) 和丙肝病毒 (HCV) [6]。同时干扰素还具有抗肿瘤作用, 其抗肿瘤的作用可以通过直接抑制肿瘤细胞而达到。有多项研究已明确证实上述观点[7]。重组高效复合干扰素为采用蛋白质空间构象调控技术生产的非天然新型干扰素, 具有独特的空间构象结构, 在制备过程中, 首先采用大肠杆菌偏爱性密码子进行设计, 化学合成该干扰素的编码基因。然后将其克隆到大肠杆菌表达载体, 用遗传工程方法在大肠杆菌中高效表达该干扰素蛋白质, 进一步采用全新工艺技术获得具有独特空间构象的rSIFN-co, 在生物学效应方面与其他干扰素如同类型干扰素 (复合α干扰素) 以及运用广泛的Ⅰ型干扰素 (IFNα-2b) 相比, 有高活性、强功能、低副反应等特点, 临床可大剂量使用。目前已运用到包括多毛细胞白血病等多种肿瘤治疗中, 但尚未应用于宫颈癌的治疗。大量研究证实, 宫颈癌的发生与HPV感染密切相关[2,3,4], 以HPV 16、18型感染最为普遍[5]。因此, 本研究选择由HPV16感染而形成的宫颈癌细胞株Caski作为研究对象。

干扰素能直接诱导肿瘤细胞凋亡, 并能发生除凋亡外的细胞死亡。已有研究通过基因芯片技术以及其他技术筛选干扰素调节基因的表达[8], 发现多种基因与凋亡有关, 除了干扰素相关基因1 (IRF-1) 、蛋白激酶 (PKR) 、2′-5′寡腺苷酸合成酶, 还有促凋亡家族成员bcl-2, 几种半胱氨酸蛋白酶 (caspase) , 肿瘤坏死因子家族的受体以及受体的配体等, 这些基因的存在均能促进IFN对细胞凋亡的作用。

本研究发现, 干扰素及顺铂对宫颈癌Caski细胞的生长有明显抑制作用, 这种抑制作用随干扰素浓度的增加而明显。虽然rSIFN-co对Caski细胞生长的抑制作用不及顺铂, 但在3种干扰素之间比较, rSIFN-co在低浓度 (0.156 μg/ml) 即对Caski细胞有抑制作用, 而复合α干扰素和IFNα-2b在2.5 μg/ml浓度对Caski细胞的抑制率明显低于rSIFN-co对Caski细胞的抑制作用。在促进宫颈癌细胞凋亡方面, 干扰素及顺铂有促宫颈癌Caski细胞凋亡的作用, 这种作用随干扰素浓度的增加而明显。较高浓度的rSIFN-co与顺铂对Caski细胞的促凋亡作用没有明显差别。3种干扰素相比较, rSIFN-co组与复合α干扰素组组间除低浓度组外, 无明显差异, IFNα-2b促使Caski细胞凋亡的作用弱于rSIFN-co的作用。

本研究还进行了经干扰素诱导的Caski细胞被细胞毒性T细胞 (CTL) 杀伤作用敏感性及机制的研究, 结果显示经不同浓度的rSIFN-co诱导后的Caski细胞对CTL杀伤作用的敏感性高于经复合α干扰素、IFNα-2b及化疗药物顺铂诱导的Caski细胞;这种效应与经干扰素诱导的Caski细胞表面黏附分子CD54及CD40的表达强度呈正相关, 表现出剂量效应关系[9]。证明rSIFN-co能诱导增加Caski细胞CD54分子及CD40分子表达强度, 从而增加Caski细胞对特异性效应细胞杀伤作用的敏感性, 使宫颈癌细胞更易被CTL清除。rSIFN-co的这种作用较同类型干扰素、普通重组Ⅰ型干扰素及化疗药物强, 结果已另行报道。

目前, IFN已运用到HPV相关宫颈炎与CIN的治疗, 但不能单一用药治疗宫颈癌, 并且治疗效果不能达到手术、化疗等治疗效果, 副反应较强, 因而临床应用治疗宫颈癌受到限制。本研究发现, rSIFN-co对体外培养的Caski细胞有明显的生长抑制及促凋亡作用, 效果优于普通I型干扰素, 在促使细胞凋亡方面, 与化疗药物顺铂的作用效果相似, 为临床治疗宫颈癌提供了新型药物, 但仍需要进一步研究证实。

参考文献

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[3]Einstein MH, Goldberg GL.Human papillomavirus and cervical neoplasia[J].Cancer Invest, 2002, 20 (7-8) :1080-1085.

[4]Bosch FX, Munoz N.The viral etiologyof cervical cancer[J].Virus Res, 2002, 89 (2) :183-190.

[5]Yamakawa Y, Forslund O, Teshima H, et al.Human papilloma virus DNA in adenocarcinoma and adenosquamous carcinoma of the uterine cervix detected by polymerase chain reaction[J].Gynecol Oncol, 1994, 53 (2) :190-195.

[6]Stark GR, Kerr IM, Williams BRG, et al.Howcells respond to interfer-ons[J].Annu Rev Biochem, 1998, 67 (1) :227-264.

[7]LimR, Knight B, Patel K, et al.Antiproliferative effects of interferon al-pha on hepatic progenitor cells in vitro and in vivo[J].Hepatology, 2006, 43 (5) :1074-1083.

[8]Wiest R, Das S, Cadelina G, et al.Bacterial translocationincirrhotic rats stimulates eNOS-derived NO production and impairs mesenteric vascular contractility[J].J Clin Invest, 1999, 104 (9) :1223-1233.

高效抑制剂 篇6

关键词：药肥混合制剂,苄嘧磺隆,苯噻酰草胺,高效液相色谱法,分析

1 前言

农药与肥料的混合物是农药的一种新制剂产品,即药肥混合制剂。近年来,水稻除草药肥因其具有施肥、除草多重功效,达到省工、省时、省力的目的,得到农民的广泛使用。0.42%苄嘧·苯噻酰颗粒剂是将农药除草剂与肥料按一定比例混配的药肥制剂产品,在水稻抛秧田使用,可有效提高杂草的防除率,同时具有一定的肥力效果。本文研究了药肥混合制剂中苄嘧磺隆和苯噻酰草胺的高效液相色谱分析方法,实现了2种农药有效成分的同柱一次性分离测定。该方法操作简便、快速,分离效果好,准确度和精密度均能达到定量分析要求,成功实现了药肥混合制剂中超低农药组分的分析测定,可作为企业生产过程质量控制和质量检验机构的质量检测方法。

2 实验部分

2.1 试剂和溶液

甲醇:色谱纯;乙腈:色谱纯;冰乙酸:色谱纯;水:新蒸馏2次蒸馏水;混合溶剂:甲醇:乙腈:水=40:40:20;苄嘧磺隆标样:已知质量分数,≥99.0%(农业部农药检定所);苯噻酰草胺标样:已知质量分数,≥99.0%(农业部农药检定所)。

2.2 仪器

高效液相色谱仪:LC-10AT,配备二级管阵列检测器和自动进样器;色谱工作站;电子天平;过滤器:滤膜孔径约为0.45μm;色谱柱为250mm×4.6mm (id)不锈钢柱,内装Hypersil BDS C18、5μm填充物。

2.3 液相色谱操作条件

流动相:甲醇:水:冰乙酸=60:40:0.1 (V/V);流量为1 mL/min;柱温为30℃;检测波为254nm;进样体积为20μL;保留时间:苄嘧磺隆约为9.59 min,苯噻酰草胺约为15.91 min。

上述操作条件系典型操作参数,具体操作时可根据不同仪器的特点,对给定操作参数作适当调整,以期获得最佳效果。典型的苄嘧磺隆、苯噻酰草胺标样和药肥混合制剂的液相色谱图如图1、图2所示。

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制

称取苄嘧磺隆标样0.05 g (精确至0.000 2 g),置于50 mL容量瓶中,用混合溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。此溶液为A溶液。

称取苯噻酰草胺标样0.08 g (精确至0.000 2 g),置于50 mL容量瓶中,用混合溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。此溶液为B溶液。

准确吸取A溶液1.0 mL及B溶液10 mL于50 mL容量瓶中,用混合溶剂稀释至刻度,摇匀,备用。

2.4.2 试样溶液的配制

称取经磨碎并混匀的试样4.2 g (精确至0.000 2 g),置于250 mL三角瓶中,准确移取50 mL混合溶剂,超声振荡萃取20 min,离心,上层清液用0.45μm滤膜过滤后备用。

2.4.3 测定

在上述操作条件下,待仪器基线稳定后,连续注入数针标样溶液,计算各针相应值重复性,直至相邻2针响应值相对变化≤1.5%后,按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2.4.4 计算

将测得的2针试样溶液及试样前后2针标样溶液中苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)的峰面积,分别进行平均。试样中苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)的质量分数X1(%),按式(1)计算:

式(1)中:A1为标样溶液中苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)峰面积的平均值;A2为试样溶液中苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)峰面积的平均值;m,为苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)标样的质量,单位为g;m2为试样的质量,单位为g;ω1为标样中苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)的质量分数,数值以%表示;f为苄嘧磺隆(苯噻酰草胺)标样溶液的稀释系数,其中f苄嘧磺降=0.02,f苯噻酰草胺=0.2。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 检测波长的选择

利用带二级管阵列检测器的液相色谱仪进行扫描,可得到苄嘧磺隆最大吸收波长为234 nm,苯噻酰草胺的最大吸收波长为218 nm,为兼顾样品中2个农药成分质量分数能同时进行测定,实验人员选择254 nm作为本方法的最佳吸收波长。

3.1.2 色谱柱和流动相的选择

分离柱采用常用C18柱,从分离时间和效果考虑,选定250 mm×4.6 mm (id)不锈钢柱,内装Hypersil BDS C18填充物。分别选用甲醇、水和冰乙酸配成不同比例的流动相,反复筛选进样,得到不同的分离效果图。经多种分离情况对比,选定流动相为甲醇:水:冰乙酸=60:40:0.1 (V/V)时,农药组分中的苄嘧磺隆和苯噻酰草胺得到较理想的分离,基线平稳,峰形对称(如图1、图2所示)。

3.2 线性关系的测定

准确称取苄嘧磺隆标样50.4 mg、苯噻酰草胺805.6 mg,分别置于50 mL容量瓶中,用混合溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。移取上述溶液0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL,分别置于5个50 mL容量瓶中,用混合溶剂稀释到刻度,摇匀。按上述色谱条件下进样分析,分别以苄嘧磺隆、苯噻酰草胺浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到线性关系良好的线性关系图:分析方法线性相关性试验结果见表1,苄嘧磺隆线性关系图如图3所示,苯噻酰草胺线性关系图如图4所示。回归方程为:

相关系数为:

3.3 精密度的测定

取同一批次的药肥样品,在上述色谱操作条件下平行测定5次,测得结果经统计:农药组分苄嘧磺隆、苯噻酰草胺的标准偏差分别为0.000 36、0.002 39;变异系数分别为1.38%、0.58%。分析方法的精密度试验结果见表2。

3.4准确度的测定

称取已知含0.42%苄嘧·苯噻酰颗粒剂分别准确加入已知量标准品,配成5份已知量样品,在上述色谱操作条件下进行分析,测得农药组分苄嘧磺隆、苯噻酰草胺的平均回收率分别为99.8%、99.8%。分析方法的准确度试验结果见表3。

4 结语

试验结果表明,用本方法测定0.42%苄嘧·苯噻酰颗粒剂药肥混合制剂中农药组分苄嘧磺隆、苯噻酰草胺质量分数,其主成分与杂质能有效分离,具有较高的准确度和精密度,且线性关系良好,成功实现药肥混合制剂中超低农药组分的分析测定,是一种可行的分析方法。

参考文献

[1]HG/T 2467.12—2003,农药颗粒剂产品标准编写规范[S].

[2]HG 3720—2003,50%笨噻酰草胺可湿性粉剂[S].

[3]朱晶,王岱峰.苯噻酰·苄复配制剂的液相色谱分析[J].辽宁化工, 2003,32(1):37-38.

[4]陈九星,陈力华,梁骥,等.33%苯噻酰·异丙·苄可湿性粉剂的高效液相色谱分析[J].精细化工中间体,2003,33(3):58-60.