凋亡相关因子

关键词： 凋亡 脑梗死 因子

凋亡相关因子（精选八篇）

凋亡相关因子 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

标本均来自2006年1月～2008年1月石家庄市第二医院和解放军260医院泌尿外科,其中肾透明细胞癌30例、癌旁组织(距肿瘤组织边缘2.0cm以上[2])30例、意外伤亡正常肾组织10例。肾透明细胞癌及癌旁组织标本来源的病人年龄在52岁～78岁,男:女=2:1;正常肾组织标本来源的意外伤害者年龄在19岁～48岁,男:女=4:1。

1.2 方法

1.2.1

上述标本离体后分成三组,(1)肾癌组织组;(2)癌旁组织组;(3)正常肾组织组,均用10%的福尔马林固定48小时,石蜡包埋5μm切片,同时应用免疫组织化学(immunohistochemistry)方法观察细胞增殖标记物PCNA、细胞调亡(TUNEL法检测)、凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9的表达变化,以期通过对肾透明细胞癌组织细胞增殖与凋亡的研究,探讨这些因子的表达与肾癌的关系。

1.2.2 数据处理

所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数(400)下,每个组计数30个视野中的总细胞数和阳性细胞数,分别计算凋亡细胞与增殖细胞的百分比,作为凋亡指数(apoptotic index,AI)和增殖指数(proliferation index,PI)。Caspase-3、Caspase-9以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示抗原表达量。

2 结果

2.1 HE染色结果

正常肾组织镜下可见肾皮质迷路内有许多大小不等球形小体为肾小体,周围则为大量不同断面的(主要为横断面)肾小管,其中着色为深红色的为近曲小管曲部,而染色稍浅的则为远端小管曲部,细胞排列整齐,胞质染色深。肾透明细胞癌组织镜下可见肿瘤细胞体积较大,圆形或多边形,胞质染色浅,透明或颗粒状,核固缩,间质富有毛细血管和血窦。

2.2 PCNA免疫组化染色结果

正常肾组织内的细胞核有弱的阳性表达,癌旁阳性表达增加,高于正常肾组织;肾癌组织阳性表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,明显高于癌旁组织。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.3 TUNEL检测结果

在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,高于正常肾组织组,肾癌组织阳性表达最少。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.4 Caspase-3和Caspase-9免疫组化结果

Caspase-3和Caspase-9在正常肾组织中可见少量弱的阳性反应。癌旁组织阳性表达增加。棕黄色颗粒颜色较深,阳性染色见于细胞胞膜及胞浆;肾癌组织表达明显减少,在胞膜及胞浆表达,棕黄色颗粒颜色较浅。两两比较结果显示,正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。

2.5 Caspase-3与Caspase-9的相关性分析

Caspase-3蛋白的表达与Caspase-9蛋白的表达之间成正相关(r=0.988,P<0.01)。

3 讨论

Caspase是含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶(cysteine-containing aspartate-specific protease),其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶,对底物门冬氨酸部位有特异水解作用。它在凋亡中所起的主要作用是:灭活细胞凋亡的抑制物;水解细胞的蛋白质结构,导致细胞解体,形成凋亡小体;在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白,从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件,它的激活与超常表达均引起细胞凋亡,因此又称死亡蛋白酶,通过与众多蛋白质因子的相互作用调控细胞凋亡[3]。

当线粒体跨膜电位在某种凋亡诱导因素作用下降低时,PTP开放,导致线粒体膜通透性增大,使细胞凋亡的启动因子如:细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡诱导因子(AIF)等从线粒体内释放出来,释放到胞浆中的细胞色素C结合凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1)和Caspase-9后,再激活Caspase-3,这是导致细胞凋亡产生的中心事件[4]。

我们分别以PCNA和TUNEL法标记了肾癌组织细胞的增殖和凋亡情况。细胞增殖与凋亡是组织正常生长,行使功能的两个基本要素。二者互相制约,处于动态平衡之中,组织细胞受损或增殖过度时,通过凋亡清除受损及异常过多的细胞,防止组织进一步损伤,而凋亡或其他原因丢失的死亡细胞则由增殖来补充,以保持正常的细胞数目及体积。这些精细的调节都是由一系列基因进行调控的,这一过程的失衡会导致疾病的发生。

肾癌细胞的生物学行为与癌细胞的增殖活性密切相关,PCNA是一种仅在增殖状态细胞内出现的非组蛋白型核蛋白。PCNA的表达越高说明DNA复制活跃程度增加,它是反映细胞增生的一项重要指标。[5,6,7]我们的实验显示:PCNA在正常肾组织、癌旁组织和肾癌组织中阳性表达不同,三组两两比较均有差异性,说明PCNA在肾透明细胞癌发生过程中起着重要作用,并且可以作为肾透明细胞癌诊断的一种参考指标。另外PCNA的活跃程度也反映了肾透明细胞癌的发生状态。

关于PCNA在肾透明细胞癌不同分期表达差异性的研究,目前还不完全一致,多数认为PCNA表达显著相关于高分期[8,9,10,11,12,13],但少数研究结果认为PCNA表达与分期无相关关系[14],我们的数据显示PCNA在正常肾组织、癌旁组织及肾癌组织之间有明显差异性,而在肾癌组织4个分期之间无显著性差异(P>0.05)。

我们的实验表明,肾癌组织PCNA表达增加,癌旁组织轻度增加,正常肾组织也有一定表达,但明显少于肾癌组织,表明增殖过度可能导致肾癌病变的发生。

在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。我们的实验TUNEL显示:凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,棕黄色颗粒颜色较深,高于正常肾组织组,肾癌组织阳性表达最少,两两比较结果显示:正常肾组织组与肾癌组,正常肾组织组与癌旁组,肾癌组与癌旁组之间均有明显差异(P<0.01)。肾癌4 个期之间比较无显著性差异(P>0.05)。肾透明癌组织细胞存在增殖过度与凋亡减少,而且凋亡因子表达下调,说明细胞凋亡参与了肾透明癌组织病变的发生和发展,因此进一步揭示细胞凋亡在肾透明细胞癌发生中的机制。

Caspase-3、Caspase-9与肾癌:肾癌肿瘤细胞增殖与肿瘤凋亡减少有关,肿瘤细胞通过复杂的机制下调凋亡基因,从而使肾癌肿瘤细胞出现恶性增殖。Caspase家族是细胞凋亡下游关键酶,而且诱导细胞凋亡,实质上都是通过Caspase蛋白的次序激活来实现的。[15,16]Caspase-3是其家族中最重要的一员,是细胞凋亡效应分子,大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需通过Caspase-3介导信号传导途径导致细胞凋亡,[15,17]在我们的研究中,Caspase-3表达与细胞凋亡指数呈正相关,表明Caspase-3在肾癌中的低表达,致使细胞凋亡减少,致使细胞积累增多,导致细胞异常增生,使肾癌发生并发展,说明Caspase-3低表达是在肾癌中肿瘤形成的主要基础。

同时我们发现,肾癌Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下调,明显低于癌旁组织及正常肾组织组,更能表明肾癌组织存在细胞凋亡减少。Caspase家族广泛存在于机体细胞中,主要以酶原的形式存在。在凋亡信号的刺激下,Caspase酶原活化,Caspase-9位于Caspase级联反应的最上游,能在其他蛋白辅助因子的参与下发生自我活化并激活下游的Caspase-3,启动Caspase级联反应,诱导细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成员,大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需要通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡[18]。它作用于特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变,完成对底物的切割后可引起细胞凋亡。我们的研究中,Caspase-3蛋白表达与凋亡指数(AI)呈正相关,Caspase-3与Caspase-9蛋白表达亦正相关,更能说明,在肾癌组织中,存在细胞凋亡的过低表达。

综上所述,肾癌组织细胞存在增殖过度与凋亡减少,而且凋亡因子Caspase-3、Caspase-9表达下调,说明细胞凋亡参与了肾癌组织病变的发生和发展,因此进一步揭示细胞凋亡在肾癌发生中的机制,为肾癌发生和发展的研究提出新的思路,为探讨肾癌的治疗指出新方向,具有一定的临床意义。肾癌细胞的发生是多种基因相互作用的结果,各相关基因在肾细胞癌的发生发展过程中相互影响,共同促使了肿瘤的形成。

摘要：目的:本课题旨在通过检测人肾透明细胞癌组织中细胞增殖(PCNA)与凋亡(TUNEL法)及凋亡相关因子Caspase-3、 Caspgse-9表达的变化,研究这些因子的表达与肾癌的关系。方法:标本离体后分成三组,(1)肾透明细胞癌组;(2)癌旁组织组;(3)正常肾组织组,应用HE染色法、TUNEL法及免疫组织化学方法进行观察研究。结果:(1)HE染色结果:肾透明细胞癌组织镜下可见肿瘤细胞体积较大,圆形或多边形,胞质染色浅,透明或颗粒状,核固缩,间质富有毛细血管和血窦。(2) TUNEL检测结果:在肾癌组织、癌旁组织及正常肾组织组均有凋亡发生。凋亡肾组织细胞表现为染色质凝集、边集,核固缩。正常肾组织组细胞核有弱的阳性表达,癌旁组织表达明显增多,肾癌组织阳性表达最少。(3) PCNA免疫组化染色结果:正常肾组织内的细胞核有弱的阳性表达,癌旁阳性表达增加,肾癌组织阳性表达明显增多。(4) Caspase-3、 Caspase-9免疫组化结果:Caspase-3 Caspase-9在正常肾组织中可见少量弱的阳性反应,癌旁组织阳性表达增加,肾癌组织表达明显减少。结论:癌旁细胞组织Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达明显高于正常肾组织及癌组织,癌组织表达最少;而PCNA则相反,癌组织高于癌旁组织和正常肾组织,正常肾组织表达最少。癌组织中Caspase-3和Caspase-9表达下降,PCNA表达升高说明细胞凋亡减少,癌组织细胞增殖旺盛,是肿瘤形成的重要机制。Caspase-3、 Caspase-9、 PCNA于肾透明细胞癌的表达在肿瘤分期间无明显差异性。

凋亡相关的斑点样蛋白ASC 篇2

与凋亡相关的斑点样蛋白ASC是一种含胱天蛋白酶募集域和热蛋白样结构域的蛋白质,它与NF-κB、胱天蛋白酶-1(caspase-1)和热蛋白(pyrin)等多种分子有关,在炎症、细胞凋亡和肿瘤等方面发挥重要作用.

作 者：赵英男 左云飞 ZHAO Ying-Nan ZUO Yun-Fei 作者单位：大连医科大学检验医学院,大连,116027刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：26(3)分类号：Q5关键词：ASC NF-κB 胱天蛋白酶-1 热蛋白(pyrin) CpG

凋亡相关因子 篇3

近年来研究表明[1]细胞凋亡为脑梗死的病理生理机制之一，尤其在缺血半暗带区凋亡是神经细胞主要的死亡方式。脑梗死后神经细胞凋亡是由一系列复杂的级联反应所引起，有很多因子参与，已有研究[2]表明Fas在其中起重要的作用，然而目前关于其下游促凋亡因子（fas-associated death domain,FADD）、半晓天冬酶-8(Caspase-8）及抗凋亡因子FLIP与脑梗死关系的研究报道极少。本研究利用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，检测它们在不同时间点m RNA及蛋白的表达及神经细胞凋亡情况，并分析其意义。试图初步探讨脑梗死后神经细胞凋亡分子病理机制，并为脑梗死的诊治提供一定的理论基础，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂

高速低温离心机（美国Beckman公司），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），凝胶图像分析仪（上海天能科技有限公司）。TUNEL凋亡检测试剂盒（德国Roche公司），兔抗鼠FADD、Caspase-8及FLIP多克隆抗体（美国NEOMarkers公司），SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司），Trizol（美国Molecular research center）,PCR引物由Primer5.0软件设计，由上海英骏生物公司合成：FADD引物：5'-TCCCTTACCCGATCACTCA-3'（上游），5'-CTGGGCAGACACGACCTAC-3'（下游），扩增产物长221 bp;Caspase-8引物：5'-TGATGAAGAGGC TCTGAGTAA-3'（上游），5'-TGGCAAAGTGACTG-GATATA-3'（下游），扩增产物长489 bp;FLIP引物:5'-GGCCCTGAGCACTGTGTCTG-3'（上游），5'-TCG GCCTGTGTAATCCTTTGTAA-3'（下游），扩增产物长379 bp；β-actin:5'-CGCACCACTGGCATTGTCA T-3'（上游），5'-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3'（下游），扩增产物长200 bp。

1.2 实验动物分组及模型制备

10～12周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只（由中南大学湘雅医学院实验动物部提供），体重（250±20)g。随机分为正常组（n=10），假手术组（n=10），脑缺血再灌注模型组（n=40）（以下简称模型组），模型组再按再灌注6、12、24及72 h分成4个亚组，每组10只动物。参考LONGA[3]的线栓法制备局灶性右侧大脑中动脉脑缺血模型，缺血2 h后拔出线栓形成再灌注。假手术组大鼠线栓插入深度为8～10 mm，其余操作同手术组。

1.3 原位细胞凋亡检测（TUNEL)

于相应时间点麻醉动物，开胸暴露心脏，左心室穿刺并经升主动脉用0.01 mo L/L PBS快速灌注后，以250 m L 4%多聚甲醛缓冲液由快到慢灌注固定3、4 h，取脑，30%蔗糖液固定24 h，在缺血灶范围做脑连续冠状冷冻切片，按TUNEL试剂盒说明进行操作。凋亡细胞观察与计数：光镜下凋亡细胞核呈黑褐色，可破裂成小碎片或出现凋亡体，正常细胞核则被核固红染成红色。于显微镜下（×200）计数凋亡细胞数，每个区域计数10个视野（来自不同切片），细胞计数采用图像分析软件进行定量分析。

1.4 FADD、Caspase-8及FLIP免疫组化染色

按上述方法将大鼠进行取材并制作成冷冻切片，然后按SABC免疫组化试剂盒说明书对FADD、Caspase-8及FLIP进行免疫组化染色，Ⅰ抗稀释浓度为1∶100，免疫染色阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗。在缺血大脑皮层用HMIAS22000高清晰度彩色图文分析系统测定FADD、FLIP免疫反应阳性细胞的平均灰度值代表蛋白表达的高低。免疫组化染色的强弱与灰度值成反比，即染色越深，阳性反应产物表达高或活性强，灰度值越小，反之则大，免疫反应产物呈棕黄色。

1.5 RT-PCR法检测FADD、Caspase-8及FLIP的mRNA表达

于相应时间点将成功动物模型深度麻醉，取缺血侧脑组织装于冻存管，置液氮中速冻后，移至-80℃冰箱中保存。取出冻存的脑组织，剪取缺血区脑组织100 mg，按总RNA提取试剂盒说明提取其中的总RNA，以紫外分光光度计测定A260∶A280比值，计算总RNA浓度。取1μg总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。然后取1μL逆转录产物配成25μL的PCR反应体系放入PCR仪按反应条件设定的程序自动完成PCR扩增。FADD、Caspase-8、FLIP与β-actin的PCR反应的变性温度、退火温度和延伸温度均分别为：94℃、55℃（FLIP的退火温度为56.1℃除外）和72℃，反应时间均分别为45 s、40 s和40 s，循环次数均为30次。扩增完成后取PCR扩增产物5μL，于2%琼脂糖凝胶中电泳，经凝胶扫描分析系统行吸光度扫描，分别计算FADD、Caspase-8及FLIP基因表达量与β-actin表达量的比值。

1.6 统计学处理

所有数据经SPSS15.0软件进行统计学处理。统计指标均进行正态检验和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以双尾P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 脑缺血再灌注后神经元凋亡的变化

正常组及假手术组可以观察到散在分布的凋亡细胞，凋亡细胞核染色阳性，细胞体积较小，且收缩变形。与正常组及假手术组比较，模型组再灌注6小时缺血侧坏死灶周围可以观察到凋亡细胞明显增多，并于以后时间点逐渐增多，至72 h达高峰，差异均有显著性（P<0.001）。见表1，图1、2。

2.2 FADD、Caspase-8及FLIP的蛋白及mRNA表达

免疫组化检测发现：正常组及假手术组大鼠顶叶皮层均有少量FADD、Caspase-8及FLIP蛋白阳性细胞表达，二组之间比较其表达差异均无显著性（P>0.05）。与正常组及假手术组比较，模型组脑缺血再灌后各时间点缺血侧顶叶皮层FADD及Caspase-8表达差异均有显著性（P<0.001），其均于6h即明显上升，于再灌注12 h达到高峰，至24 h及72 h则明显下降。FADD及Caspase-8的m RNA表达变化与其蛋白表达变化基本一致。与正常组及假手术组比较，模型组大鼠脑缺血再灌后各时间点缺血侧顶叶皮层FLIP蛋白表达均明显增强（P<0.05～0.001），其于缺血再灌注后6h其蛋白表达明显增强（P<0.001），并达高峰，以后时间点逐渐下降，FLIPmRNA表达变化与其蛋白表达变化基本一致。见表1、2，图3～12。

注：1）与正常组、假手术组比较，P<0.05,注:1)与正常组、假手术组比较,P<0.05,2)与正常组、假手术组比较,P<0.001

注:覮与正常组、假手术组比较，P<0.001

图9中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图10中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图11中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

图12中1道为Marker;2、3道分别代表正常组与假手术组;4～7道分别代表模型组6 h、12 h、24 h、72 h;8～11道分别代表干预组6 h、12 h、24 h、72 h

3 讨论

近年来研究表明[4]细胞凋亡为脑梗死的重要病理生理机制之一，其神经细胞凋亡涉及多条凋亡通路。随着诊疗技术的进步，逐渐开展起来的溶栓技术已使闭塞的血管再通机会大大增加，脑缺血再灌注损伤日益为人们所重视。已有大量研究[5,6]表明脑缺血再灌注损伤与兴奋性氨基酸毒性、神经细胞Ca2+超载、炎症反应及自由基产生有密切的关系。特别是缺血再灌注后不配对电子的持续反应而产生的自由基，被认为是导致其神经功能障碍的主要原因[7]。已有研究[8]发现脑缺血再灌注后的氧化应激能使死亡受体Fas及其配体Fas L表达明显增强，从而诱导神经细胞凋亡。FADD及caspase-8是死亡受体Fas介导的凋亡通路中重要的促凋亡因子[9]。Fas与Fas L结合或与激动抗体交联后形成三聚体，募集胞浆内FADD,FADD与Fas二者的死亡域相互作用，显露其死亡效应区，再将caspase-8募集于Fas号复合体，激活半胱氨酸蛋白酶级联，导致细胞凋亡，此途径即是Fas-FADD-Caspase-8通路，为死亡受体Fas介导的最主要的凋亡通路[9]。FLIP是FADD-Caspase-8途径的内源性抑制剂，它可以结合Fas-FADD复合体，阻断DISC中Caspase-8的激活，从而抑制FADD转导的凋亡信号[10]。目前，国内外关于FADD、caspase-8及FLIP与脑梗死关系的研究报道极少。

本研究发现免疫组化检测到模型组FADD、Caspase-8的m RNA及蛋白表达均增强，同时检测到大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡明显增多，基于Fas/Fas L在脑缺血再灌注损伤中的作用已经得到确认，因此提示Fas-FADD-Caspase-8凋亡通路可能为其重要凋亡通路之一。此外，本研究还发现抗凋亡因子FLIP的m RNA及蛋白表达亦增强，究其原因可能是神经细胞的自我保护机制之一，以防止或减少缺血再灌注所导致的细胞凋亡，但其具体机制尚待进一步研究。此研究亦启发笔者在今后研究或临床应用中可以用上述因子作为新的治疗靶点，应用药物或更先进的方法作干预，从而达到减少脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的目的。

参考文献

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凋亡相关因子 篇4

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

SD大鼠36只, 雌雄各半, 体重200 g～250 g, 由成都中医药大学实验动物研究中心提供。随机分为假手术组、缺血再灌注组、西药对照组[硫氮$\begin{array}{l}\text{艹}\\ \text{卓}\end{array}$酮, 30 mg/ (kg·d) ]及益气通脉口服液小剂量[临床用量的5倍, 2.5 mL/ (kg·d) ]、中剂量[临床用量的10倍, 5 mL/ (kg·d) ]、大剂量组[临床用量的15倍, 7.5 mL/ (kg·d) ]。益气通脉口服液, 由成都中医药大学药学院提供, 批号20051026 (每毫升含生药2 g) ;硫氮$\begin{array}{l}\text{艹}\\ \text{卓}\end{array}$酮 (恬尔心, 盐酸地尔硫$\begin{array}{l}\text{艹}\\ \text{卓}\end{array}$片) , 浙江亚太药业股份有限公司生产, 批号:20050401。caspase-3:兔抗IgG.bax:兔抗IgG;fas:兔抗IgG均购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC。caspase-3、bax 、Fas试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。4%戊巴比妥钠、生理盐水、10%甲醛溶液等。

1.2 方法

1.2.1 给药方法

术前连续7 d, 每日灌胃1次。空白组和模型组分别于相同时间给予相同容积的生理盐水灌胃。

1.2.2 建立动物模型

戊巴比妥钠麻醉后仰卧位固定在鼠板上。切开气管插管用ALC-V8型动物呼吸机维持呼吸。测量术前标准Ⅱ导联心电图。剪去胸前手术区毛, 剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜3 cm～4 cm, 于左侧第四肋间, 用18#血管钳沿第四肋间, 钝性分离肋间肌3 cm长, 打开胸腔, 撑开4、5肋骨, 用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。助手用左手拿小镊子夹一小棉球, 用棉球将心脏向右面轻推, 在左心耳与肺动脉圆锥之间找到与左冠状动脉伴行的心大静脉, 在左心耳下方2 mm处用眼科针3.0丝线穿线, 进针深度为1.0 mm～1.5 mm, 宽2 mm～3 mm, 连同心大静脉一齐结扎冠状动脉左前降支 (假手术组只穿线不结扎) , 结扎冠状动脉后迅速将心脏放入胸腔, 结扎30 min后, 拔去引线使冠状动脉再通, 并观察心电图有无再灌注心律失常。所有实验动物均在术后1 h断头处死, 立即开胸取出心脏置于甲醛溶液中固定。

1.2.3 免疫组化

SP法检测caspase-3、bax、fas蛋白表达。 在显微镜200倍下用图形分析系统定量观察。

1.3 统计学处理

实验数据均以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。数据采用SPSS 11.5统计软件进行, 用One-Way ANOAY方差分析, 两组间比较采用LSD及S-N-K分析。用组间 t 检验。

2 结 果

2.1 caspase-3检测 (见表1)

凋亡标志因子caspase-3表达在缺血再灌注后增多, 用药后caspase-3表达减少, 但益气通脉小剂量组无统计学意义, 可能与大鼠数较少有关。随用药剂量增多有明显差异, 益气通脉中、大剂量组表达比西药对照组减少。

2.2 凋亡因子bax检测 (见表2)

促凋亡因子bax在心肌缺血再灌注损伤后表达明显增高, 用药后表达明显降低。随用药剂量增多逐渐减低。其中益气通脉中、大剂量组较西药对照组表达减低。其中益气通脉大剂量组与西药对照组差别有统计学意义。

2.3 Fas检测 (见表3)

促凋亡因子Fas在心肌缺血再灌注损伤后表达明显增高, 用益气通脉口服后其表达明显降低。随用药剂量增多逐渐减低。其中益气通脉中、大剂量组较西药对照组表达减低。其中益气通脉大剂量组疗效优于西药对照组, 差异有统计学意义。

3 讨 论

缺血心肌组织的存活必须依赖再灌注, 但再灌注通常会进一步加重心肌细胞损伤[5]。因此, 减轻再灌注损伤是最大限度保护心脏、有效救治缺血性心脏病的关键之一。

缺血再灌注时, 部分心肌细胞发生凋亡。细胞凋亡是一种受基因调控的主动性细胞死亡, 表现为凋亡信号通路的启动及相关基因的表达。caspase-3目前被认为是各种细胞凋亡过程中的关键酶, 既能接受凋亡信号, 成为凋亡的执行者, 又是凋亡效应器。是凋亡发生过程中所需要的一种重要的蛋白酶, 同时也是凋亡发生的标志酶[6]。许多实验均证明了I/R使caspase-3活性增加而促使心肌细胞凋亡。bax是一种凋亡调控因子, Oltral等[7]首先发现并对其结构和功能进行了描述。徐明等[8]研究表现, 急性心肌缺血再灌注心肌细胞内bax蛋白表达。再灌注组较缺血组心肌细胞中bax表达显著增高 (P<0.05或P<0.01) 。Fas蛋白是一种细胞表面受体, 属肿瘤坏死因子和神经生长因子受体家族成员。Fas蛋白与其配体或单抗结合后均可启动凋亡信号的传递。临床上, 冠状动脉粥样硬化[9]、慢性心功能不全[10]等心血管疾病中Fas蛋白均参与了细胞凋亡。

凋亡相关因子 篇5

1 材料与方法

1.1 主要药品试剂和仪器 参附注射液由雅安三九药业有限公司提供;TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、Fas-ELISA试剂盒由美国Rapid Bio Lab提供;小动物呼吸机购自成都泰盟科技有限公司,型号为HX-200;超低温冰箱由日本三洋公司提供,型号MDF-382E;HH系列电热恒温水箱购自江苏省金坊市医疗仪器;550型酶标测试仪购自美国博乐公司。

1.2 动物模型建立及分组 健康雄性Wistar大鼠45只,体重200 g±20 g,军事医学科学院动物中心提供。采用结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型:腹腔注射3%戊巴比妥50mg/kg麻醉,第3、第4气管软骨环间行气管切开插管,连接动物呼吸机(潮气量约4 mL/100 g,吸呼比1∶1,呼吸频率60/min)。沿胸骨左缘剪开皮肤,剪断左侧第3肋骨,钝性撕开心包膜,暴露心脏,在肺动脉流出道与左心房之间结扎左冠状动脉前降支,间隔10 min连续3次心电图ST段持续抬高为结扎成功,关闭胸腔。假手术组予左冠状动脉前降支下穿线,不

1) 为北京市中医药科技基金项目(No.JJ2001-37)

结扎。术后7 d,共有38只大鼠成活,随机分为CHF组(13只)、参附组(11只)、假手术组作为正常对照组(14只)。所有存活大鼠饲养直至实验结束,大鼠饲养条件:清洁级动物实验室,温度(20±2) ℃,相对湿度:50%~65%。术后第8天给药,参附组给予参附注射液[6.2 mL/(kg·d)]腹腔注射;CHF组和假手术组给予同等量生理盐水腹腔注射,每日1次,连续4周。

1.3 检测TNF-α、IL-6和sFas含量 采用双抗体夹心ELISA法,按照试剂盒说明书操作。抗大鼠TNF-α单抗包被于酶标板上,将稀释标本加入相应反应板孔中,混匀、温育后洗板,加入Biotin标记的抗TNF-α抗体,混匀、温育后洗板3次,再加入HRP标记的TNF-α另一表位的特异性单克隆抗体,同上温育、洗涤后,加TMB 底物液于室温避光显色;加入100 μL终止液。在450 nm处测OD值,大鼠TNF-α的浓度与OD(450 nm)成正比。IL-6和sFas的测定方法同上。每次实验中,均同时测定试剂盒中提供的细胞因子标准品,并绘制标准曲线,根据标准曲线计算出待检样品中细胞因子的含量。

1.4 统计学处理 所有数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,多组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。组间两两比较行LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

CHF组大鼠血浆TNF-α、IL-6、sFas浓度较假手术组显著升高(P<0.01)。参附组大鼠血浆TNF-α、sFas浓度比心力衰竭组有所降低(P<0.05),但并未达到假手术组水平。参附组IL-6浓度比心力衰竭组降低(P<0.05),且与假手术组水平无明显差异(P>0.05)。详见表1。

3 讨 论

作为各种严重心脏疾病的最终转归--心力衰竭的研究,近50年来虽然取得较大进展,但总体来说其预后仍很差,发病率、病死率均较高。其发病机制比较复杂,至今尚未完全阐明。细胞因子是由多种细胞分泌的高效、多能的内源性肽类物质,现在研究较多的在心室重塑中起重要作用的细胞因子有TNF-α、IL-6、内皮素(ET)等。1990年Levine 等[1]首次报道严重CHF患者外周血中TNF-α升高,并指出其可能与CHF的发生有一定关系。TNF-α在急性期通过非一氧化氮(NO)依赖性通路,慢性期则通过NO依赖性通路,来调节心血管功能[2]。研究表明TNF-α浓度增加大于0.1 U/L能降低左室功能,导致心肌肥厚、肺水肿、血管通透性增加及左室心肌结构改变[3],如重塑、纤维化及瘢痕形成,其机制可能是通过降低血管内皮细胞内皮型NO合酶(eNOS)mRNA的表达,增加巨噬细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等的诱导型NO合酶(iNOS)的表达,刺激血管平滑肌及心肌超氧阴离子产生,降低NO半衰期,从而大大促进了心脏NO的合成,抑制心肌收缩力[4]。此外TNF-α还可激活成纤维细胞,导致细胞外胶原的累积,通过增加iNOS和原癌基因的表达,参与心肌细胞的凋亡[5]。其他细胞因子,如IL-6、IL-1等也参与了CHF的发生、发展,并成为目前的研究热点。

肿瘤坏死因子(TNF)家族中的成员Fas是启动细胞凋亡的一种细胞凋亡相关膜表面受体蛋白,广泛分布在各种组织细胞中,参与细胞塑形、衰老等一系列生理过程。Fas与它的天然配体FasL结合即可触发细胞凋亡[6]。游离于血清中的Fas分子称为sFas,是Fas的可溶性异构体,它是由Fas在转录水平以不同的拼接方式所产生,故sFas的血清水平可随着心肌细胞膜上Fas抗原表达的增加而上升[7]。1997年,Nishigaki等[8]发现慢性CHF的患者的血浆中的sFas的水平较对照组明显升高,且升高水平随心功能的降低而升高。

参附注射液为人参和附子的提取液。其主要药理成分人参皂甙能增强心肌收缩力;清除氧自由基,抑制脂质过氧化反应而保护心肌;抑制血浆前列环素E2(PGE2 )的降解或刺激PGE2的合成而有助于心脏功能的改善[9]。附子所含的消旋去甲基乌药碱可加强心肌收缩力,促进窦房和房室传导,增加冠脉血流和心肌耗氧,对心率有双向调节的作用。参附注射液在临床上广泛应用于CHF治疗,取得了较好的疗效,其治疗的机制及作用靶点仍有待进一步研究。

本实验以结扎左冠状动脉前降支形成梗死后心力衰竭的大鼠为研究对象,给予参附注射液治疗。治疗组、心衰组和假手术组大鼠血浆中TNF-α、IL-6、sFas水平,结果CAF组大鼠上述各项检测结果比假手术组显著升高(P<0.01)。参附治疗组大鼠血浆TNF-α、sFas、IL-6浓度均比心衰组降低(P<0.05)。提示参附注射液治疗心力衰竭的作用机制可能与其抑制凋亡相关因子水平,减少细胞凋亡有关。

摘要：目的观察参附注射液对实验性心力衰竭大鼠血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及可溶性Fas(sFas)含量的影响,探讨参附注射液在心力衰竭治疗中抗凋亡作用机制。方法采用结扎冠状动脉左前降支近端的方法建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型。将大鼠随机分为假手术组(14只,除不结扎冠状动脉左前降支外,余同手术组)CAF组(13只)和参附组(11只)。参附组腹腔注射参附注射液[6.2mL/(kg·d)],CHF组和假手术组给予同等量生理盐水,每日1次腹腔注射,连续4周。给药4周后颈动脉取血,采用双抗体夹心ELISA法测定血浆中TNF-α、IL-6及sFas含量。结果与假手术组相比,CHF组大鼠血浆TNF-α、IL-6及sFas浓度明显增高(P<0.01),参附注射液能降低CHF大鼠血浆TNF-α、IL-6及sFas的水平(P<0.05)。结论参附注射液改善梗死后心衰大鼠的心功能,可能与抑制凋亡相关因子减少心肌细胞的凋亡,发挥心肌细胞的保护作用有关。

关键词：参附注射液,心力衰竭,凋亡相关因子

参考文献

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[5]Kin H,Wang NP.Inhibition of myocardial apoptosis by postcondi-tioningis associated with attenuation of oxidative stress-mediated nuclear factor-kappakappaB translocation and TNF-alpha re-lease[J].Shock,2008,29(6):761-769.

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[7]葛长沙,胡申江,郑霞,等.急性冠状动脉综合征病人血清可溶性Fas和可溶性Fas配体及可溶性白介素2受体水平的临床价值[J].中国循环杂志,2003,18(1):28-30.

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凋亡相关因子 篇6

关键词：肿瘤因子相关凋亡诱导配体,顺铂,DR5

肿瘤治疗过程中治疗药物耐受是临床过程中需要解决的重要问题,肿瘤因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)有希望成为治疗前列腺癌的一种新的途径,因此如何解决前列腺癌对TRAIL的耐受也成为临床必须解决的关键问题。笔者诱导建立对TRAIL耐受的前列腺癌细胞株PC3-TR,化疗药物顺铂(DDP)联合TRAIL处理PC3-TR,以提高PC3-TR对TRAIL的敏感性,从而达到逆转PC3-TR对TRAIL耐受的目的,现将相关研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TRAIL(美国R&D公司),DDP(山东齐鲁制药厂),四氮唑蓝(MTT)(美国Gibco公司),RPMI1640培养液(赛默飞世尔生物化学制剂有限公司),胎牛血清(天津灏洋生物制品科技责任公司),0.25%胰酶及青-链霉素(吉诺生物医药技术有限公司)。

1.2 PC3-TR细胞株的建立及培养

人前列腺癌PC3细胞株由本实验室保存,用TRAIL(100ng/ml)处理PC3细胞,24h后更换新鲜的完全培养基,待细胞长到80%左右时,再用TRAIL(100ng/ml)处理24h,重复以上步骤。2个月后获得TRAIL耐受的前列腺癌细胞株PC3-TR,并用含TRAIL的培养基维持培养;PC3-TR细胞用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养液,并置于37℃、5%CO2、湿度99%的培养箱内培养。

1.3 测定方法

四氮唑蓝快速比色法(MTT)测定细胞生长抑制率,将处于对数生长期的PC3-TR细胞胰酶消化,制成单细胞悬液,细胞接种于96孔板内,每孔接种104个细胞。按实验要求将PC3-TR分为DDP组、TRAIL组、DDP+TRAIL组,每组6个复孔;细胞贴壁后。DDP组按0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/ml的浓度梯度加入DDP;TRAIL组按10.0、20.0、50.0、100.0ng/ml加入TRAIL;DDP+TRAIL组分别加入DDP(0、5.0、10.0μg/ml)、TRAIL(20.0、50.0、100.0ng/ml),并设未加药物处理的空白对照组。各组处理后继续置于37℃,5%CO2、湿度99%的培养箱内培养24h,每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl,继续培养4h后终止培养,小心洗尽孔内培养液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl,震荡10min,酶标仪波长570nm处测定各孔的吸光度(A值)。各用药组细胞抑制率(IR)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.0软件包进行数据处理。计量数据以$\overline{x}\pm s$表示,组间比较采用F检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DDP组、TRAIL组对PC3-TR细胞增殖的抑制效应

用不同浓度的DDP:0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/ml处理PC3-TR细胞24h后,MTT法测定DDP及TRAIL对PC3-TR的细胞增殖抑制效应。DDP在其浓度为0～20.0μg/ml对PC3-TR细胞增殖IR在15.2%以下,其DDP浓度增加到50μg/ml和100μg/ml其细胞增殖IR分别为(18.3±8.7)%及(25.1±16.6)%。不同浓度DDP组间进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

用不同浓度的TRAIL:0、10.0、20.0、50.0、100.0ng/ml处理PC3-TR细胞24h后,MTT法测定TRAIL对PC3-TR的细胞增殖抑制效应。TRAIL浓度为0～100.0ng/ml对PC3-TR细胞增殖IR在25.8%以下;不同浓度TRAIL组间进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 DDP+TRAIL组对PC3-TR细胞增殖的抑制效应

小剂量的DDP(5.0μg/ml及10.0μg/ml)与50.0ng/ml TRAIL联合使用,其对PC3-TR细胞增殖IR分别为(50.4±13.7)%与(72.2±2.9)%,联合应用DDP及TRAIL对PC3-TR细胞增殖IR明显高于空白对照组和单独使用DDP组(5.0、10.0μg/ml)及TRAIL组(50.0ng/ml),差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

3 讨 论

TRAIL是一类能诱导肿瘤细胞发生凋亡的配体,它与肿瘤细胞的凋亡及细胞因子的产生有着密切的关系。目前TRAIL的受体被证实有5种,而与TRAIL诱导前列腺癌凋亡相关的受体主要以TRAIL-R2/R5为主。TRAIL通过与死亡受体TRAIL-R1/R4或TRAIL-R2/R5分子胞内含有的死亡结构域结合,并与死亡结构域激活的Caspase8前体形成死亡诱导信号复合体(death including signal complex,DISC),随后Caspase8被活化后,分别经线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径,最后共同汇合与Caspase3、6、7诱导肿瘤细胞凋亡[1,2]。目前的研究显示有50%～60%的肿瘤对TRAIL敏感,而对于对TRAIL耐受的肿瘤,人们通过采用不同的化疗药物与TRAIL联合使用的方法以增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。现在已得到证实有此类作用的化疗药物如阿霉素、DDP、紫杉醇等,如单独使用以上药物耐药肿瘤细胞株会显示对以上药物的抵抗性,而与TRAIL联合使用可使诱导肿瘤细胞凋亡的作用明显加强[3]。另外也有研究显示,全反式维甲酸与TRAIL联合使用能明显的提高耐药卵巢癌细胞对TRAIL的敏感性,但能否逆转卵巢癌对TRAIL的耐受性还有待进一步研究来证实[4]。

注:与空白对照组、DDP单独用药组、TRAIL单独用药组比较,*P<0.01

为了研究DDP与TRAIL联合使用后能否逆转前列腺癌细胞株对TRAIL的耐受,首先要建立对TRAIL耐受的前列腺癌细胞株。目前建立肿瘤的耐药细胞株的方法主要有2种:药物浓度递增持续法及大剂量间歇诱导法。笔者采用大剂量的TRAIL间歇诱导PC3细胞的方法建立TRAIL耐受的前列腺癌细胞株PC3-TR,结果显示PC3-TR细胞株不仅对TRAIL耐受,对DDP及HGS-ETR2都存在抵抗,显示其具有多药耐药性(multidrug resistance,MDR)。而肿瘤的MDP主要与P糖蛋白介导的多药耐药基因相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)有关[5,6]。

DDP是多种化疗方案的核心药物,在化疗过程中起关键的作用。DDP含铂的部分可以DNA之间形成铂化DNA,抑制DNA的合成与损伤后的修复。DNA损伤导致P53激活,P53可以促进凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-X、MCL-1等释放,进而线粒体释放细胞色素C增加,激活Caspase3、6、7,细胞发生凋亡。P53也可以激活死亡相关受体,经过死亡受体途径导致肿瘤细胞的凋亡。DDP能增强PC3-TR对TRAIL的敏感性可能与以上2个途径有关,研究结果已经证实DDP能诱导前列腺癌细胞DR5增加[7],TRAIL与DDP联合应用能明显的增强TRAIL对前列腺癌细胞的杀伤作用,同时能明显减少化疗药物的剂量[8]。

笔者在研究中发现DDP与TRAIL联合使用对PC3-TR细胞的抑制作用明显增强,这种结果的产生可能与TRAIL-R2/R5受体的表达水平升高,从而逆转了PC3-TR对TRAIL的耐受并提高了对TRAIL的敏感性有关。DDP与TRAIL之间存在明显的协同效应,其调节机制可能与以下几个方面有关:DDP导致死亡受体TRAIL-R1/R4或TRAIL-R2/R转录活性增高;下调抗凋亡蛋白及上调促凋亡因子;激活线粒体凋亡途径中Caspase级联反应。随着人们对DDP及TRAIL研究的不断加深,DDP、TRAIL及其相关抗体必将在肿瘤治疗方面发挥非常重要的作用。

参考文献

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凋亡相关因子 篇7

关键词：乳腺癌,曲妥珠单抗,新辅助化疗,凋亡相关分子

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,新辅助化疗是局部晚期乳腺癌患者常用的治疗方式。新辅助化疗又称术前化疗,是指恶性肿瘤在应用局部治疗(手术或放疗)前进行全身性、系统性的细胞毒性药物治疗,可以降低肿瘤细胞活力,减少播散,利于消除全身微小转移灶,延长患者生存期,并可使原发病灶降期,为手术创造有利条件[1]。曲妥珠单抗是一种人源化抗人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor-2,Her-2)单克隆抗体,对非靶细胞杀伤性小、副作用少[2]。有学者认为在手术局部切除病灶前,联合使用曲妥珠单抗和新辅助化疗可以有效优化病情,故本次研究主要分析术前应用曲妥珠单抗联合新辅助化疗对乳腺癌患者血清中血管新生因子及乳腺组织中凋亡相关分子的影响。具体报道如下:

1资料与方法

1.1一般资料

选择于2011年12月 -2013年12月在本院接受住院治疗的II~III期可手术的,经空心针穿刺活检,病理及免疫组化明确的Her-2阳性的原发性乳腺癌患者116例作为研究对象,按照随机数表法将所有入组患者分为观察组及对照组,每组各58例。 观察组患者年龄32~71岁,平均(59.27±6.33)岁; 对照组患者年龄33~70岁,平均(58.79±6.05)岁。 两组患者的基线资料差异无统计学意义(P >0.05), 具有可比性。

1.2治疗方法

两组患者均接受新辅助化疗:多西紫杉醇75 mg/m2,静脉滴注,60 min内滴完,每隔21 d重复1次。给予多西紫杉醇前均常规给予地塞米松及5-HT受体阻断剂预防副作用。每2周常规检查肝肾功能及心电图。观察组患者在新辅助化疗基础上加入曲妥珠单抗治疗:首次剂量4 mg/kg,第2次及以后维持剂量2 mg/kg,溶于生理盐水中90 min内滴完,首次应用后观察至少6 h,若首次用药后无不良反应,第2次用药观察时间可缩短至2 h,每隔7 d 1次。

1.3观察指标

1.3.1治疗效果两组患者接受不同治疗后1年内,判断疗效,包括完全缓解(complete remission, CR):目标病灶完全消失;部分缓解(partial remission,PR):治疗后目标病灶的最大直径及最大垂直径乘积缩小50%以上;疾病进展 (progression disease,PD):治疗后目标病灶的最大直径及最大垂直径乘积增加≥25%,或者出现新病灶;疾病稳定(stable disease,SD):病灶长径之和缩小但未达PR,或者增加未达PD。

1.3.2血清血管新生因子水平两组患者接受不同治疗后,抽取外周静脉血5 ml,采用酶联免疫吸附法检测其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 水平 , 具体包括VEGFA、 VEGFB、VEGFC 3亚型,测定时严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3.3乳腺组织凋亡相关分子水平两组患者接受不同治疗后,采集外周静脉血5 ml,离心后取上清保存于 -80℃。取适量血清,加入上样缓冲液,100℃加热变性后进行western-blot检测,孵育Caspase-3、捕获受体3 (Dc R3)、Livin、Survivin、 环氧合酶 -2 (COX-2)第一抗体,过夜后孵育第二抗体,按照目的蛋白灰度值 / 内参蛋白 β-actin灰度值计算蛋白含量。两组间比较时,设置对照组目的基因的蛋白含量为100,计算观察组目的基因的蛋白含量。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析,计量资料采用t检验,等级资料采用非参数秩和U检验, P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1治疗效果

观察组患者接受曲妥珠单抗联合新辅助化疗后的CR和PR比例高于对照组,PD和SD比例低于对照组患者(P <0.05)。具体见表1。

例(%)

(pg/ml,±s)

2.2血清血管新生因子水平

观察组患者接受曲妥珠单抗联合新辅助化疗后的血清VEGFA、VEGFB和VEGFC水平均明显低于对照组患者(P <0.05)。具体见表2。

2.3乳腺组织凋亡相关分子水平

观察组患者接受曲妥珠单抗联合新辅助化疗后的乳腺 癌组织Caspase-3、Dc R3、Livin、Survivin和COX-2表达水平均低于对照组患者(P <0.05)。具体见表3。

(±s)

3讨论

新辅助化疗于20世纪70年代首次应用于局部晚期的乳腺癌治疗,迄今为止大量研究已经证实新辅助化疗在改善患者长期生存率方面具有积极意义,且新辅助化疗具有使肿瘤降期、增加肿瘤体内化疗敏感性等优势,使原先不能手术的乳腺癌患者后期可以接受根治性手术治疗,新辅助化疗已经成为晚期乳腺癌治疗的标准治疗方式[3]。Her-2在20.00%~25.00%的乳腺癌患者中呈过表达,在乳腺癌的发生发展过程中均起到重要作用。曲妥珠单抗是人源化的Her-2单克隆抗体,可以有效杀灭乳腺癌肿瘤细胞,同时对非靶细胞的杀伤性小,成为其有别于其他化疗药物的一大优势[4]。临床研究显示去曲妥珠单抗与多西紫杉醇具有协同作用,两药联用有望提升临床治疗效果。本次研究中重点分析了曲妥珠单抗联合新辅助化疗术前应用对乳腺癌患者血清血管新生因子和乳腺组织中凋亡相关分子水平等方面影响[5,6]。

患者肿块消失及复发情况是判断一种治疗方式有效与否最为直观的标准,本次研究中患者治疗1年内,观察组患者的CR和PR比例高于对照组,PD和SD比例低于对照组患者(P <0.05),提示术前应用曲妥珠单抗联合新辅助化疗在杀灭肿瘤细胞活性以及抑制治疗后复发方面具有显著优势。VEGF是促血管新生能力最明确的细胞因子,可以结合相应受体激活信号通路、促进血管内皮细胞增殖迁移并生成新血管[7]。VEGF包括VEGFA、VEGFB、VEGFC等多种亚型,其促发的新生血管是恶性肿瘤生存及增殖的基础,较多研究显示恶性肿瘤患者血清中VEGF含量大幅上升,成为治疗失败或者肿瘤复发的重要标志[8]。本研究发现观察组患者接受治疗后的血清VEGFA、VEGFB和VEGFC水平均明显低于对照组患者(P <0.05),提示联合治疗后大幅降低肿瘤细胞血管新生活性,有助于降低治疗后复发。

人体凋亡相关分子的表达异常是导致肿瘤发生发展的关键因素,Caspase是含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶,分为启动型、效应型和炎症型3类,其中Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶, 属于效应型,在细胞凋亡蛋白酶级联反应中处于核心地位。在正常情况下机体中Caspase-3在胞质中以无活性形式存在,只有当细胞凋亡时才被激活为活性形式。近年发现Caspase-3参与了肿瘤细胞的异常凋亡过程,其过度表达促进了肿瘤细胞的生长。 Dc R3是20世纪发现的存在于多种恶性肿瘤组织中的肿瘤坏死因子受体,其表达产物可以与相关配体结合阻断细胞凋亡过程。有研究显示Dc R3的高表达可以抑制肝癌组织中的癌细胞凋亡发生。Livin与Survivin主要通过拮抗死亡受体来抑制细胞凋亡发生,有研究发现Livin同Survivin一样在乳腺癌病例中存在过度表达[9]。COX-2是前列腺素合成过程中的重要限速酶,近年发现乳腺癌组织中存在COX-2表达,且与乳腺癌的发生发展关系密切。目前已知COX-2在人类多种恶性肿瘤中均呈高表达。观察组患者接受治疗后的乳腺癌组织Caspase-3、Dc R3、 Livin、Survivin、COX-2表达水平均低于对照组患者 (P <0.05),提示曲妥珠单抗联合新辅助化疗有助于促进肿瘤细胞凋亡。

凋亡相关因子 篇8

肾单位的形成是一个复杂的相互诱导的过程, 细胞凋亡在肾各个结构的发育中起着重要的作用[2,4,5]。目前, 有关肾发育中细胞凋亡的相关研究[6]国内外已有一定的报道, 但是发育中凋亡相关蛋白Apaf-1的表达及作用地系统研究还很少见, 其对肾发育的影响还有待进一步的完善。本研究应用免疫组织化学、免疫印迹技术系统的研究了大鼠肾发育中Apaf-1的表达规律, 探讨其对肾发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和抗体

选用成年健康SD大白鼠, 雌、雄 (2∶1) 同窝饲养, 每日3次观察受孕情况, 以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚0天 (embryonic days 0, E0d) 。孕鼠分笼饲养2周后, 每日2次观察生产情况, 以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0天 (postnatal days, P0d) 。选取E16、18、20 d的胎鼠和P1、3、5、7、14和21 d的仔鼠, 每组取6只。

抗体:兔抗Apaf-1单克隆抗体 (购于Abcam公司) ;PV试剂盒 (购于北京中杉试剂公司) 。

1.2 石蜡切片的制备

各龄孕鼠经腹腔注射水合氯醛, 麻醉后剖腹取出胎鼠, 各龄胎鼠剖腹取肾;生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后, 经4%多聚甲醛与1%戊二醛灌流固定, 剖腹取肾, 常规脱水透明, 石蜡定向包埋, 连续切片 (5μm厚) 。

1.3 PV法检测Apaf-1阳性表达细胞

将石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2阻断内源性过氧化物酶, 高温高压修复, 室温下冷却, 兔抗Apaf-1单克隆抗体 (1μg/m L) 湿盒内4℃过夜, 羊抗兔Ig G, 37℃20 min, DAB显色, 苏木精复染, 脱水, 透明, 封片;以PBS代替一抗作阴性对照, 光镜下观察。

1.4 免疫印迹法检测Apaf-1蛋白的表达

收集待用肾组织, 加入100μL蛋白提取缓冲液, 于组织匀浆机上匀浆后, 4℃, 10 000 r/min, 离心10min, 取上清, 置于-70℃备用。电泳前, 加入SDS样品缓冲液, 100℃煮沸5 min, 10%SDS-PAGE电泳分离, 然后将蛋白转至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭1h, 兔抗Apaf-1单克隆抗体 (1μg/m L) 4℃孵育过夜, TBST洗膜10 min 3次, HRP-羊抗兔Ig G (1∶2000) , 室温孵育2 h, TBST洗膜10 min 3次, ECL显影。扫描电泳条带, 用Gene Tools软件分析电泳条带吸光度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理, 实验数据用均数±标准差 (±s) 表示, 用单因素方差分析进行各组间比较, 组间两两检验用q检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Apaf-1蛋白的免疫组织化学显色

Apaf-1的阳性表达定位于细胞质上, 呈不同程度的棕黄色颗粒状, 其细胞核则被苏木精染成蓝紫色。

在肾发育的早期阶段 (E16d~E20d) , Apaf-1的表达主要位于近髓质区的近端小管和与其相伴行的远端小管内, 近端小管的表达强于远端小管, 肾小体内的阳性表达细胞极少见;髓质区的阳性表达少见, 若有表达也主要出现在与梯状间充质垂直排列的放射状小管内 (见图1A、D~E) 。随着发育的不断进行 (P1d~P5d) , Apaf-1的表达范围随着生肾区的变薄逐渐扩大, 主要表达在中层和深层的肾皮质区, 随着髓放线的出现, 其阳性表达细胞也随之出现, 并逐渐增多;而髓质区的阳性表达增多, 且集中在放射状小管上 (见图1B、F~I) 。到肾发育的后期 (P7 d~P21d) , 皮质区的阳性表达细胞扩展到皮质全层, 主要集中在皮质迷路中的近端小管与远端小管;髓质区的阳性表达细胞增多, 以外髓放射状走行的小管居多 (见图1C、G) 。

A~C标尺=100μm, D~I标尺=50μm。PT示近端小管, DT示远端小管, G示血管球, MR示髓放线, CL示皮质迷路。可见随着肾脏的发育, Apaf-1主要表达在皮质迷路的近端小管, 远端小管表达较弱

2.2 免疫印迹分析结果

免疫印迹结果显示, 大鼠肾发育中Apaf-1的蛋白表达从E16~P1d逐渐升高, P1d时达到高峰, 以后则逐渐降低, 在P7d后表达微弱 (见图2、3) 。

与前一组比较, P<0.05, n=6

3 讨论

肾单位的形成是一个复杂的相互诱导的过程, 包括一系列的细胞增生和细胞凋亡。细胞凋亡是肾发育过程中的重要事件, 其凋亡机制是复杂而多样的[6]。线粒体是细胞生命活动的控制中心, 它不仅仅在信号传导中起关键作用, 是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心, 同时也是细胞凋亡发生的核心。与线粒体相关的一些重要蛋白如细胞色素C (cytochrome c, Cyt-c) 和Apaf-1等在细胞凋亡过程中各司其职, 共同调控着凋亡的发生、发展。Cyt-c所介导的线粒体通路是细胞凋亡的重要通路之一, 其所诱导的细胞凋亡必须经过Apaf-1的激活, 也就是Apaf-1在线粒体细胞凋亡途径中起着中心控制作用[7]。本研究通过检测Apaf-1在大鼠肾发育中的定性和定量表达, 来探讨线粒体通路所介导的细胞凋亡在大鼠肾发育中的重要作用是切实可行的。

Apaf-1是一个水溶性蛋白质, 以单体的形式存在于细胞内。当发生细胞凋亡时, 在凋亡信号的作用下, Cyt-c释放到细胞质并与凋亡蛋白激活因子Apaf-1聚合, 聚合的Apaf-1募集并活化半胱胺酸天冬氨酸酶9前体 (Procaspase-9) , 半胱胺酸天冬氨酸酶9 (Caspase-9) 激活下游的效应酶Caspase-3, 最终引发线粒体途径介导的细胞凋亡[8]。Apaf-1是线粒体凋亡途径中一个重要的促凋亡因子, 是凋亡体的核心。因此, 本文通过Apaf-1阳性细胞在肾发育的表达可以反映肾发育过程中细胞凋亡的状态。

本研究显示, Apaf-1主要表达在近端小管与远端小管中, 近端小管的表达强于远端小管, 而通过对肾缺血缺氧的研究显示, 肾损伤及修复的主要部位为近端小管[9,10], 这或许表明近端小管在肾发育及肾损伤修复中有较强的分裂及修复更新能力, 他们可能控制了新生肾小管的数量及细胞分化。

本研究通过免疫组织化学检测显示, Apaf-1的阳性细胞随着肾发育的不断进行广泛分布于肾皮质和髓质的各种结构, 这提示以Apaf-1介导的线粒体凋亡途径是肾发育过程中细胞凋亡的重要事件, 是肾单位结构不均一性形成的基础。

本研究通过免疫印迹测量显示, P1d时Apaf-1的表达达到高峰, 这可能是因为大鼠肾发育的早期以增殖为主, 发育中的肾小管通过Apaf-1介导的线粒体凋亡途径来清除因过度增生而过剩的细胞。P7d之后肾发育以细胞分化为主, 细胞分化时凋亡是主要的细胞清除机制, 而此时Apaf-1的表达微弱, 这或许表明Apaf-1介导的线粒体凋亡途径已不是肾发育中细胞凋亡的主要事件, 可能由其他途径的细胞凋亡来主导肾发育的正常进行。

肾发育中的细胞凋亡途径是复杂的, 本文通过对肾发育中Apaf-1的表达进行定性及定量的研究, 将有助于揭示肾发生发育的机制, 并为肾疾病的预防及治疗提供新思路[11]。

摘要：目的 探讨大鼠肾发育中凋亡活化因子-1 (Apaf-1) 的表达规律。方法 应用免疫组织化学与Western blotting技术, 对大鼠肾发育中的Apaf-1的表达进行定性和定量观察。结果 免疫组织化学结果显示在肾发育的早期, Apaf-1的阳性细胞主要表达在深层皮质区的近端小管和远端小管, 随着发育的不断进行, Apaf-1的表达逐渐扩展到整个肾皮质区;免疫印迹结果显示Apaf-1的蛋白表达从E16dP1d逐渐升高, P1d达到高峰, 以后则逐渐降低。结论 在大鼠肾发育的早期, Apaf-1介导的线粒体凋亡途径成为主要的清除过度增生细胞的原因, 而肾发育的后期则由其他途径的细胞凋亡来主导肾发育的正常进行。

关键词：Apaf-1,线粒体,发育,肾,大鼠

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