关键词： 养殖
原位杂交（精选八篇）
原位杂交 篇1
生肌调节因子MRFs是脊椎动物早期发育中重要的调控基因,其作用是调控和决定肌肉的生成,该家族均具有一个保守的碱性螺旋- 环- 螺旋结构( bHLH)[6 -7]。生肌调节因子MRFs家族共有4个主要成员,分别是MyoD、Myf - 5、myogenin、Mrf - 4。 MyoD基因是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主要调控基因,它的主要作用是促进骨骼肌的形成和分化, 缺少MyoD基因可导致成肌细胞无法正常增殖和分化[8]。静止期肌肉卫星细胞向成肌细胞转化需要MyoD基因的参与,其他类型细胞转化成肌细胞也同样离不开MyoD基因的参与,它能促进肌细胞进一步融合,分化成成熟的肌纤维。在肌肉发育过程中, Myf - 5和MyoD是生肌过程所需要的转录因子中最先起作用的。李永平等[9]研究表明,敲除小鼠的MyoD、Myf - 5基因,会导致成肌细胞形成失败,因此使得小鼠头和躯干的骨骼肌发育不健全。
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交( ISH) 是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、 细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位[10]。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了方法,为从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效工具。
1材料
试验所用鲤鱼胚胎,均来自中国水产科学院黑龙江水产研究所,取发育完整的24 h去膜鲤鱼胚胎,设计合成的MyoD引物,见表1。体外转录法标记的MyoD探针,1年生鲤鱼,受精后6,12,24,48 h鲤鱼胚胎。
2方法
2. 1试验前的处理
取发育24 h的鲤鱼受精卵,用4%多聚甲醛固定后去卵膜,将胚胎浸泡在甲醇中-20 ℃保存。
2. 2 RNA的提取
取鲤鱼肌肉组织,加入液氮充分研磨,加入55 ℃ 预热的Tripure( Roche) 1 mL使骨骼肌组织充分裂解,移出上清液,加入氯仿抽提,异丙醇沉淀RNA, 75% 乙醇洗涤后沉淀的RNA用适量无RNA酶水溶解,变性凝胶电泳检测RNA质量,测量总RNA浓度和纯度,-80 ℃冰箱中保存,备用。
2. 3 MyoD基因的克隆
设计MyoD基因引物,以鲤鱼肌肉cDNA为模板,对其进行扩增,将扩增片段与载体连接后转化,经测序,克隆片段为所需MyoD基因片段。
2. 4体外转录法标记MyoD探针
通过测序结果判断片段插入方向,用T7/SP6引物对片段大量扩增,最后利用探针标记试剂盒( Roche) 标记MyoD基因探针。
2. 5鲤鱼整体的原位杂交
杂交第1天: 受精24 h的鲤鱼胚胎分别用25% 、50% 、75% 的甲醇复水,之后经过氧化氢和蛋白酶K处理,重新用4% 多聚甲醛固定,在杂交液中70 ℃ 杂交至少16 h以上。
杂交第2天: 杂交后胚胎分别在溶液Ⅰ( 50% 甲酰胺,5 × SSC pH值为4. 5,1% SDS) 、溶液 Ⅱ [0. 5 mol/L NaCl,10 mmol/L三羟基氨基烷( Tris) - Cl pH值为7. 5,0. 1% Tween20]、溶液Ⅲ( 50% 甲酰胺pH值为4. 5,2 × SSC) 中顺次洗涤,之后室温封闭60 ~ 90 min,加入地高辛抗体( 1 ∶ 2 000 ) ,4 ℃ 孵育16 h。
杂交第3天: TBST( 8 mg/mL NaCl,0. 2 mg/mL KCl,25 mmol / L Tris - Cl pH值为7. 5,0. 1% Tween20) 彻底洗涤后,4 ℃ 过夜。
杂交第4天: 室温下洗涤胚胎3次,加入显色液中室温避光显色,显色完成后PBS洗涤胚胎终止反应,并用50% 甘油透化30 min,显微镜下观察并拍照。
3结果与分析
3. 1 MyoD基因的克隆
从4个不同1年生鲤鱼样品的肌肉中提取RNA,并反转录为cDNA,用GAPDH引物检测cDNA样品,见图1。利用Primer Premier 5. 0软件设计MyoD特异性引物,对反转录的cDNA进行特异性扩增,根据电泳结果可知,特异性片段长度约为250 bp, 与目的片段长度( 219 bp) 相近,可初步确定其为所需目的片段,见图2。选择条带较好的2号cDNA作为模板,大量扩增MyoD片段,并利用胶回收试剂盒回收特异片段,经检测回收片段大小符合预期结果, 见图3。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR阳性产物;2~5.PCR产物;6.PCR阴性产物。
M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。
3. 2 MyoD基因的检测
M. DL - 2 000 Marker plus; 1. 胶回收片段。
将胶回收片段与T3载体连接后转化,挑取4个单菌落,用LB液体培养基扩大培养,并提取质粒。 以质粒为模板,用MyoD特异引物扩增目的条带,其中阳性模板是1年生鲤鱼肌肉cDNA,扩增片段长度与阳性产物一致,初步显示扩增片段即为所需片段, 见图4。选择3号质粒送基因公司测序,并将测序结果在NCBI Blast上与已发表的参照序列进行比较分析,结果显示,所克隆的MyoD基因片段与NCBI上鲤鱼MyoD基因参照序列的同源性达100%,说明试验所克隆的基因片段确实为MyoD基因片段,见图5。 测序结果表明,目的片段的连接方向是正向插入,利用T7/SP6引物检测测序方向是否正确,其中上游引物/SP6( 上/SP6) 和下游引物/T7( 下/T7) 能扩增目的片段,而上游引物/T7 ( 上/T7) 和下游引物/SP6 ( 下/SP6) 不能扩增目的条带,见图6。符合预期要求,说明片段确实为正向插入。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR阳性产物;2~5.挑取的4个单菌落扩大培养后所提取的质粒;6.PCR阴性产物。
3. 3鲤鱼整体原位杂交的显色结果
通过鲤鱼胚胎整体原位杂交试验可以清楚地观察到受精后24 h鲤鱼胚胎中MyoD基因的表达情况,试验结果显示,与未加入探针的阴性对照相比( 见图7A) ,在鲤鱼近轴部位的体节中,MyoD基因表达非常明显,成条带状贯穿背部至尾后缘。另外,在鲤鱼早期胚胎的头部及眼睛周围,MyoD基因也有明显表达,同时心脏部位及下腹部也发现少量MyoD基因表达,但表达并不如体节中强烈,而且在早期鲤鱼胚胎的脑部后缘也发现有MyoD基因的表达,但其显色较微弱,表达不明显( 见图7B、C、D) 。
M. DL - 2 000 Marker; 1. T7 / SP6; 2. 上 / T7; 3. 下 / T7; 4. 上 / SP6; 5. 下 / SP6。
A.鲤鱼整体原位杂交阴性胚胎;B,C,D.鲤鱼整体原位杂交结果。
3. 4检测MyoD基因在鲤鱼早期胚胎中的表达
从受精后6 h、12 h、24 h、48 h鲤鱼胚胎中提取RNA,并反转录为cDNA,通过GAPDH表达调平后, 检测MyoD基因在早期鲤鱼胚胎中的表达。经检测发现,鲤鱼胚胎内MyoD基因的表达量随发育时间的延长逐步增加,在24小时时达到最高,而在48小时时表达量下降,见图8。
M.DL-2 000 Marker;1.6 h;2.12 h;3.24 h;4.48 h。
4讨论
MRFs基因家族的发现及其生理功能的研究不仅揭示了肌肉发育的分子生物学机制,也为在动物生产中同时获得高净肉率和高肉制品品质提供可能。 其中MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族4个成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因, 对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行[11 -12]。1987年, Devis首次发现并获得MyoD基因cDNA,对生肌调节因子的研究越来越受到人们的重视[13],目前已克隆获得包括人、大鼠、小鼠、牛、鸡、绵羊、扬子鳄、爪蟾、 鲤鱼、虹鳟、斑马鱼、奥利亚罗非鱼、鳕鱼、文昌鱼等多种脊椎动物的MyoD基因,但对于该基因的研究主要集中在基因的结构和医学诊断上,而对于该基因在肉用动物生产中肌肉发育调控的研究还未受到重视[14 -17]。因此,试验选择鲤鱼为研究对象,对鲤鱼MyoD基因进行克隆和序列分析,以期为鲤鱼肌肉发育调控的机理及肉质改良奠定基础。
试验以受精24 h的鲤鱼胚胎为试验材料,提取RNA,反转录为cDNA; 并以cDNA为模板,设计特异性的MyoD上、下游引物,进行大量扩增,根据电泳比对结果,特异性片段长度约为250 bp,与设计引物长度相符,可以代表MyoD基因,同时对目的片段进行回收,并标探针。用标记后的MyoD探针对受精后24 h鲤鱼胚胎整体原位杂交,可以直观地观察到MyoD基因在鲤鱼胚胎中脊髓两侧近轴细胞对称表达,在心脏部位及下腹部也有表达。说明MyoD基因在鲤鱼早期胚胎发育过程中就开始表达并发挥作用, 对鲤鱼的生长发育具有重要意义。为了检测早期鲤鱼胚胎中MyoD的表达,试验提取不同发育时期鲤鱼胚胎的RNA,并反转录为cDNA,检测MyoD基因的表达,发现在6 h、12 h、24 h、48 h各时期均有表达, 表达量随发育时间的延长而增加,在24小时时表达量最高,到48小时时开始下降。
综上所述,为了进一步探索MyoD基因对鲤鱼肌肉发育的具体调控机制,应当对不同发育时期鲤鱼MyoD基因的表达进行进一步研究,建立鲤鱼MyoD基因表达的时间谱,并参考模式生物斑马鱼中MyoD基因的研究进展,对鲤鱼中MyoD基因的作用机制进行研究,为改良鲤鱼肉质品质和质量奠定基础。
摘要：为了研究成肌分化因子(MyoD)基因在鲤鱼发育中的功能,采用鲤鱼完整早期胚胎作为试验材料,通过对MyoD基因的克隆,利用整体原位杂交技术,从个体水平研究其在鲤鱼早期发育中的表达情况,明确该基因在鲤鱼胚胎早期的表达部位。结果表明:MyoD是生肌调节因子MRFs家族(MyoD、Myf-5、myogenin、MRF4)的重要成员,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD基因的表达不仅能促进肌细胞的发育,还能使其他类型细胞转化成肌细胞,并能促进肌细胞进一步融合,分化成成熟的肌纤维。
原位杂交 篇2
荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用
介绍了荧光原位杂交技术的基本原理,讨论了该技术的操作程序及其在微生物生态学领域的应用.
作 者：夏铁骑 XIA Tie-qi 作者单位：濮阳职业技术学院,生物系,河南,濮阳,475000刊 名：新乡学院学报(自然科学报)英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：200926(2)分类号：Q938.1关键词：荧光原位杂交 寡核苷酸探针 16SrRNA 微生物生态学 fluorescence in situ hybridization oligonucleotide probe 16S rRNA microbial ecology ?
荧光原位杂交技术的研究进展和应用 篇3
1 FISH技术的产生
荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的.1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来, 提高了基因定位的准确性。1975年, Manning等人最先在溶液的分子杂交中, 使用非放射性标记, 通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。1981年Roumam首次报道了荧光素标记的cDNA作原位杂交。同年, Langer等用生物素标记核苷酸制备探针。1986年, Cremer与Lieher等分别证实了荧光原位杂交 (FISH) 技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性, 从而开辟了间期细胞遗传学研究。
2 FISH技术的发展
在20世纪90年代, FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势, 灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。以下简单介绍近年来FISH技术的发展。
2.1 染色体描绘 (chromosome painting)
是用全染色体或区域特异性探针, 通过多彩色FISH使中期细胞特异染色体和间期核呈现不同荧光颜色的条带, 从而分析染色体的方法, 常用于识别染色体重组、断裂点分布、鉴别染色体外核物质的起源[2]。
2.2 多彩色原位启动标记 (multicolor primedin situ labeling mulficolorPRINS)
是用寡核苷酸作为引物, 原位PCR扩增待测序列, 并在此过程中掺入荧光素直接或间接标记的核苷三磷酸, 使扩增出的序列都得以标记。通过几轮这样的扩增, 使待检的几个序列的原位扩增产物标记上不同荧光素, 实现同时对多个微小缺失和突变等染色体微小改变的检测。这方法已常规用于检测特异性a卫星序列在染色体和间期核内的定位。
2.3 比较基因组杂交 (comparative genomic hybridization, CGH)
是在荧光原位杂交基础上结合消减杂交技术于9O年代发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术[3], CGH以不同荧光标记待测和参照细胞群的等量基因组DNA, 并用加入一定量的人竞争DNA ( Cot-1 DNA) 抑制分散重复序列 (interspersed repetitive sequence, IRS) 。不同标记的DNA同时与正常中期染色体杂交, 结果正常染色体每个位点上的两种荧光强度之比反映待测与参照基因组DNA序列的拷贝数之比。这个方法最大的优点是:在一个实验中完成一个样本全部染色体丢失和获得的检测, 并且不需要分裂细胞。主要的缺点是分辨率不高, 可以检出的缺失大小约5~10 Mb;另外, 不能检测出没有基因组拷贝数明显变化的染色体平衡易位、倒位及全基因组的整倍体改变。与FISH相比, CGH在一次实验中能对肿瘤样品中整个基因组中的DNA扩增和缺失等变异获得整体认识, 并描绘出相应的CGH核型图[4,5], 可在物种间进行染色体同源性比较, 从而弥补了常规FISH只适于小部分肿瘤的不足。
2.4 在DNA纤维上的荧光原位杂交
游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构。但它仍是DNA和蛋白质的复合大分子。其染色质的基本结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏.在Heng等人的思路的基础上, Wiegant、Parra和Windle进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理[6,7]。让DNA分子完全从蛋白质中分离出来, 制备出DNA纤维。Wiegant等用一种含高浓度盐和一定量的变性剂的碱性缓冲液对间期细胞核进行处理后.得到一种被称为Halo的DNA纤维结构围绕在细胞核周围.这是一些环状DNA分子片段.通常有400~500kb长, 可以用来作为高分辨率的FISH的靶DNA, 就是最初的纤维-FISH。纤维-FISH具有高分辨率, 能进行定量分析, 模板要不高, 只需分析少量的DNA分子, 灵敏度高等优点。由于纤维-FISH的这些优点, 使得它在染色体图谱绘制, 基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用。
2.5 FISH其他的相关技术
ring-FISH它利用多聚核苷酸探针, 第一次允许检测质粒上的单个基因或基因片段以及单个细胞中的核酸, 这种方法的杂交信号特征包含一个像光晕、圆圈形状的荧光聚集在细胞周边[8]。
荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学是一种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法, 这种方法可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表现型和一定的基因改变。这种方法和形态学有关, 可以对档藏材料作回顾性研究。其优点是诊断快速, 可以再现, 适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的细胞学样本。
3 FISH技术的应用
3.1 FISH用于病源微生物诊断
Hogardt[9]等利用FISH技术直接检测临床标本, 使用成套设计的针对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、洋葱假单胞菌等痰标本中常见菌的寡核苷酸探针, 较传统培养法相比, 可达90%的敏感性和近100%特异性。这提示我们FISH成套探针可用于特定疾病相关性病原体的检测。Poppert[10]等用电子显微镜、直接荧光染色和FISH检测感染了沙眼衣原体和肺炎衣原体的HeLa 229细胞, 发现在感染后6 h可用电子显微镜观察到细胞内有衣原体形成;FISH在感染后12小时至第6天, 均能检测到衣原体;而直接荧光染色检测到衣原体时间要晚于FISH。这提示FISH可快速且准确的检测衣原体感染。而Kapur等[11]则联合应用PCR和FISH直接检测泌尿生殖道拭子标本128份, 其中FISH的阳性率为21.8% (28/128) , PCR的阳性率为25.7% (33/128) , 说明FISH在检测衣原体感染方面具有高度的特异性和较好的敏感性。
3.2 FISH用于产前诊断
FISH的优势是不仅适用于分裂中期的染色体, 也适用于间期核及细胞周期的所有阶段。FISH分析无需作细胞培养及显带分析, 仅做细胞计数;而常规的细胞遗传学检查, 常受分裂相数量、质量、显带技术及个人技能的影响。FISH的突出优点是可以快速得出结果。与历时7~12 d的传统染色体显带分析相比较, FISH分析可在24 h内完成, 让医生尽早做出诊断, 制定诊疗方案。与放射性原位杂交相比较, FISH技术无放射性同位素污染, 不需要特殊的安全防护, 且敏感性与同位素检测相当。 FISH探针特异性在于FISH探针可以有针对性地检测小的单一序列、着丝粒特异序列和整条染色体, 并用已验证核型分析的推断和进一步鉴定显带法未能确定的标记染色体, 对嵌合型的诊断, FISH比传统的显带法核型分析更可靠[12]。FISH杂交信号明亮, 灵敏度高, 特异性强, 与传统的细胞遗传学核型分析的符合率高达99.8%[13], 是一种灵敏准确的分子细胞遗传学技术。
3.3 重复序列与染色体分带
基因的染色体定位是FISH技术在分子生物学上的重要应用。应用高分辨FISH结合CCD相机的计算机图像分析研究A1u (短散布元件short interspersed element, SINE) 和Ll (长散布元件long interspersed element, LINE) 序列在人中期染色体上的布分, 发现Alu序列主要在R带, Ll序列主要是O/Q深染带。FISH技术与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点。表明DNA序列与带型有关。用FISH技术对人类基因组中编码基因分布的研究揭示, 基因主要集中在染色体上G+C (占金基因组35%) 最丰富的DNA区段。
3.4 端粒序列的定位
FISH可以直接观察染色体端粒, 简化了对其在核内的结构和功能究.Werner等用FISH证实在普通小麦等物种中所有缺失染色体的断裂端都存在端粒序列, 认为在小麦中可能存在染色体重新修复机理, 在断裂端添加端粒序列, 而“端粒捕获”则可以稳定染色体的损伤, 从而解释了人类恶性肿瘤中亚端粒易位的高发生率的原因, 这种相互易位最初认为是亚端粒缺失。
3.5 基因图谱绘制
原位杂交 篇4
EBER原位杂交检测步骤
标本与试剂:从临床手术中切除的淋巴瘤组织中选取其中的一部分作为标本。试剂盒选用EBER原位杂交试剂盒,其中包含EBER探针(地高辛标记)、抗地高辛抗体(HRP标记)、胃酶、DAB浓缩液等试剂。
标本固定:标本固定的目的是为了保持标本组织形态结构的完整性,在最大程度上保证细胞内核酸水平的稳定性。标本固定使用的材料一般使用缓冲马尔福林,其溶液浓度10%,其最佳固定时间8～12 h。
切片制备:使用酒精对切片机进行清洗,在清洗后的切片机上对组织进行切片处理,切片的厚度3～4μm,将经过切片处理之后的薄片黏附在经过APES处理的载玻片上,之后将切片放在60～70℃的温度下进行烘烤,烘烤的时间>60 min。
组织常规脱蜡及水化:对切片组织进行常规脱蜡和水化处理的目的是将内源性过氧化物酶消除,将背景染色降低最小。其方法为使用浓度3%的甲醇H2O2在室温下处理5 min。
消化:对切片组织进行消化处理的目的是提升组织的通透性,增强探针的穿透力,提升检测方法的敏感性。使用的试剂为蛋白酶K,因为蛋白酶K相较于其他蛋白水解酶来说,在孵育时能够实现所有核酸酶的消化[2]。消化处理的流程是:将蛋白酶K与TBS按照1:25的比例进行配置,消化处理5 min,之后使用蒸馏水洗涤2 min,使用100%无水乙醇I和Ⅱ分别进行2 min的脱水处理,之后放置在空气中进行自然干燥。
杂交处理:在每张切片上滴加适量的探针杂交液,使用耐热膜或者硅化盖玻片对切片进行覆盖,将湿盒中的温度控制在55℃左右,在其中进行1h孵育;如湿盒中的温度为37℃,孵化时间>3 h。孵化之后使用TBS溶液进行冲洗,2 min/次,共冲洗3次。之后在切片上滴加EBER-抗、A液和B液,孵育时间分别为60 min、10 min和10 min,孵育完成后均使用TBS溶液进行冲洗,2 min/次,共冲洗3次。在冲洗之后,进行DAB显色和常规苏木素复染,最后进行封片处理。
失败原因分析
失败的原因主要有以下几点:①消化环节:消化不足,使得核酸暴露不充分;消化过度,使得核酸周围的蛋白结构遭到破坏,在后续步骤中导致核酸丢失,使得观察目标不清晰。②探针施加环节:在组织切片上加探针之前,组织切片未干透,探针施加失效。③杂交环节:在杂交环节,杂交液失效,或者杂交液的滴加量,杂交时间、杂交温度控制失当;在试验过程中使用的缓冲液pH过低或者过高;一抗溶液或者二抗溶液被稀释得过于严重,浓度过小;DAB失效。
EBER原位杂交检测问题
虽然EBER原位杂交检测的使用方法较为简单,但对其结果产生影响的因素也较多,其中主要表现在以下几个方面:标本取样不规范,所取得的肿瘤成分过少;组织固定不及时,固定液使用不规范,使得核酸组织受到破坏;在切片环节中,由于石蜡保留的年份过长或者操作失误,影响切片质量,影响杂交效果;在脱蜡环节脱蜡不彻底,消化失误(不足或者过度),探针质量不佳,影响切片质量;杂交、孵育的温度和时间控制失误,使得结果呈现出假阴性;探针质量不佳使得杂交显色定位不清,影响判断;DAB沉渣附着不佳[3],导致结果判读失误。
EBER原位杂交检测对策
完善标准取样:在进行标本取样时,要控制样本大小和肿瘤成分的多少,保证切片的完整性。
完善组织固定:在对组织进行固定时,要使用规范的固定液,保证核酸的完整性。
组织消化:在对组织进行消化时,若需要消化的组织量较大,要进行分批消化[4],严格控制消化时间。在消化的过程中,同一批组织滴加蛋白酶K的时间要<30 s。
滴加探针:在滴加探针时,要注意探针的量,以组织大小为依据,一般情况下,每张切片滴加探针的量5～10μL[5]。在更换探针时,要对其进行质量控制,检测新探针是否有效。
缓冲液配置:对于新配制的缓冲液,要进行充分溶解混匀,在每次使用之前都要对其pH进行测试,确定该溶液为中性缓冲液之后才能使用。
组织切片干燥处理:在进行EBER原位杂交检测之前要对组织切片进行干燥处理,保证切片的干燥性,以免组织上的水分对探针产生稀释作用,使得信号减弱或者使得信号不能有效地被表达出来。
抗体滴加:在对组织切片滴加抗体时,要把组织周边的水分拭干,以免对抗体产生稀释,在此过程中要保证组织不能干片。
样本对照:为了保证每个检测样本均能被有效地判读,要保证每一批EBER实验样本均有阳性样本作为对照[6]。
小结
对于初学者而言,在检测失败的情况下,要善于分析,逐项排除可能导致失败的原因。本实验室EBER原位杂交曾因更换了探针和中性缓冲液,连续出现失败,在确定操作步骤无误的情况下,取阳性对照片两张,以阳性探针、新探针做质控,同时测试了新配制的缓冲液的pH,发现新配制的缓冲液未充分混匀,液体上段为强碱,下段为酸性,充分混匀后pH 7.0～7.5,再次进行EBER原位杂交实验,结果:两张阳性对照片片均呈阳性。总之,EBER原位杂交技术的关键重在细节,要排除任何可能导致杂交失败的原因,以保证实验的准确性和成功性。
参考文献
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原位杂交 篇5
肺癌是致死率最高的人类恶性肿瘤之一[1],造成肺癌患者高死亡率的原因之一是早期诊断技术的缺乏。科学研究显示,很多肺癌患者出现临床症状就诊时已处于中晚期,其5年生存率不到15%[2]; 而肺癌的早期特别是Ⅰ期的确诊将显著提高患者5年生存率至80%[3]。基因变异是肿瘤发生的早期事件, 对肺癌发生发展中特异基因的监测成为早期诊断的潜在方法。目前ALK基因重排检测已经用于肺癌的临床诊断 中,但是单基 因诊断的 准确率有 待提升[4,5,6]。近年来的研究发现,RBM5 ( RNA - binding motif protein 5) 在肺癌的发生发展中具有重要的作用。RBM5位于人3号染色体短臂2区1带3亚带( 3p21. 3)[7],在人肺癌组织中存在缺失现象,在人肺癌细胞系A549和裸鼠中具有抑制肺癌细胞生长和转移的功能[8,9,10]。RBM5很可能成为肺癌分子诊断的潜在基因,RBM5的缺失检测能在较早阶段预示人罹患肺癌的风险。目前尚无RBM5探针制备及应用RBM5进行肺癌分子诊断的报道,RBM5探针的制备及应用方法的建立将为应用RBM5诊断肺癌提供应用基础。
本实验对RBM5进行荧光标记,并对标记的探针应用肺癌组织石蜡切片进行荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization,FISH) 实验,以验证探针标记的有效性并建立RBM5荧光探针检测肺癌的原位杂交技术体系,为以RBM5为分子探针建立肺癌的FISH诊断标准提供技术基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
菌株RP11 - 493K19( Life Technologies) ; 人肺癌组织石蜡切片为华中科技大学附属同济医院胸外科术后新鲜肺癌组织经固定包埋而得。
1.1.2试剂
Plasmid Midi Kit ( Qiagen ) ; 氯霉素、蛋白酶K ( Sigma) ; PCR引物( 上海生工生物工程有限公司) ; Green d UTP、CEP - 3探针、Nick translation kit、DAPI ( Abbott) ; Histo - ClearⅡ( National Diagnostics ) ; 琼脂糖等其他试剂均为分析纯。
1.1.3仪器设备
PCR仪( Bio - Rad PTC - 200 ) ; 荧光显微镜 ( Olympus BX51) 。
1.2方法
1.2.1RBM5的提取
将RP11 - 493K19菌株划线培养于含25μg /ml氯霉素的LB固体培养基上,单菌落形成后转入含25μg / ml氯霉素的LB液体培养基中培养。3 000r / min离心10min收集菌液,用Plasmid Midi Kit提取RBM5,0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测RBM5的浓度和纯度,PCR扩增验证RBM5基因。PCR上游引物为3' AATCCCAGCCTCAGTAGTATCCA 5',下游引物为3' GCACCCTACACTTTATCACAGCA 5',反应条件 为94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,35个循环。
1.2.2RBM5的荧光标记
应用缺口平移法对RBM5进行荧光标记,在无酶PCR管中加入RBM5 DNA 1μg,0. 1 mmol / L d NTP 10μl,0. 1 mmol / L d TTP 5μl,0. 2 mmol / L Green d UTP 2. 5μl,10 × buffer 5μl,Nickase 10μl,补加H2O至总体积为50μl,15℃ 标记12h,乙醇沉淀RBM5探针, 2% 琼脂糖凝胶电泳检测探针的长度和纯度。
1.2.3RBM5探针FISH实验[11,12,13]
将人肺癌组织石蜡切片常规脱蜡,10 μg/ml蛋白酶K消化100 min,再98 ℃水浴处理45 min,取出玻片自然干燥。将CEP - 3探针和RBM5探针避光加到玻片上的样本区域,75℃ 变性7min,转入杂交湿盒中37℃ 杂交16h。杂交后将玻片转入2 × SSC /0. 1% NP - 40洗液中室温5min去掉盖玻片,再转入72 ℃ 的2 × SSC /0. 3% NP - 40洗液中洗涤5min。取出玻片,干燥后加入10μl DAPI,用Olympus BX51荧光显微镜观察。依次用红色、绿色、蓝色激发光滤光片观察单色结果,再在三通位置观察结果。选择细胞边界清晰、杂交信号明亮的区域用FISH2. 0软件采图。
2结果与分析
2.1RBM5的提取
应用Plasmid Midi Kit提取质粒DNA,PCR鉴定质粒中是否含有RBM5基因,结果PCR扩增获得363bp的DNA片段,说明质粒DNA中含有RBM5( 图1) 。
M : DNA marker ; 1 : 空白对照; 2 : RBM5 PCR 扩增产物 。M : DNA marker ; 1 : black control ; 2 : PCR procuct.
2.2RBM5的荧光标记
使用缺口平移法用Green d UTP标记RBM5,使标记的RBM5探针大部分为300bp大小。结果表明, 15℃ 标记12h时,探针大小为200bp ~ 600bp,300bp大小的探针浓度最高( 图2) 。
M : DNA marker ; 1 : RBM5 质粒; 2 : RBM5 探针; 3 : Green d UTP。M : DNA marker ; 1 : RBM5 plasmid ; 2 : RBM5 probe ; 3 : Green d UTP.
2.3RBM5探针FISH实验
应用制备的RBM5探针与人肺癌组织石蜡切片进行FISH实验,结果表明,实验制备的RBM5探针与基因组内RBM5基因特异结合形成明亮的绿色荧光信号,探针灵敏度高、探针片段大小适宜。探针与样本杂交后,RBM5探针和CEP - 3探针都呈现出清晰的信号,胞外无非特异性信号点出现,细胞核型完整, 说明样本预处理良好、杂交程序及杂交后的洗涤程序适宜。本实验建立的FISH实验体系经过改良可以应用于非石蜡切片的样本类型( 图3) 。图3中,CEP 3探针呈红色信号,RBM5探针呈绿色信号,细胞内同时具有两个红色荧光信号点和两个绿色荧光信号点的细胞不存在RBM5的缺失,细胞内具有两个红色荧光信号点和一个绿色荧光信号点的细胞存在RBM5的缺失。
3讨论
RBM5位于3p21. 3区域,是RNA结合基序蛋白家族成员[14],参与机体内众多基因的表达调控,在肺癌组织中存在基因缺失和表达水平降低的现象[8]。 由于包括RBM5在内的3p21. 3区域的基因杂合性缺失是肺癌发生的早期事件,RBM5的检测有望成为肺癌早期诊断的潜在方法。
目前基因探针已广泛用于癌症的诊断中,如应用HER - 2诊断乳腺癌、p53诊断胃癌、p16诊断膀胱癌等。FISH技术具有原位显示的优点,能反映特定细胞的病变,常用于癌症的基因诊断中,但是FISH技术应用的前提是特异探针的荧光标记。肺癌诊断中应用的荧光探针多购买于Abbott等公司,一些研究者采用缺口平移法制备了位点特异性探针[15]。目前有关RBM5荧光探针的制备和分子检测的方法尚未见报道。本实验采用缺口平移法对RBM5进行荧光标记,获得了300bp左右的探针片段。探针标记实验中最重要的因素是酶作用的时间,采用梯度时间多次标记有助于获得合适的探针。荧光探针和石蜡切片样本的FISH实验借鉴了现有的经验[11,12,13],样本的预处理尤其是蛋白酶K处理的效果对后续杂交试验的影响很大,会影响到杂交信号的强度。杂交后的洗涤影响实验背景的深浅,洗涤不充分会导致细胞外出现非特异的荧光信号。所有因素中,最关键的是探针的质量,探针的特异性和浓度直接影响实验的成败。
4结论
原位杂交 篇6
1 对象与方法
1.1 对象
2012年1月至2012年10月在本院流产的孕妇26例, 取其胎儿绒毛及皮肤标本进行FISH检测, 测定第13号、第18号、第21号及X、Y染色体数目。
1.2 方法
1.2.1 试剂
染色体数目检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。FISH检测用第13号、第18号、第21号及X、Y所用的5种探针, 其中13号染色体探针定位在13q14, 21号染色体探针定位在21q22, 18号染色体、X染色体、Y染色体探针分别定位在着丝粒区域, 其中GLP21/CSPX用四甲基罗丹明橘红色荧光标记, GLP13/CSPY用异硫氰酸荧光素绿色荧光标记, CSP18用二乙基氨基香豆素天蓝色荧光标记。
1.2.2 检测方法
(1) 流产儿绒毛或皮肤细胞提取:取流产或死胎后已污染无法进行体细胞培养的绒毛或皮肤组织, 用眼科剪剪至糊状, 加0.25 %EDTA胰酶37 ℃水浴消化30 min, 加入含血清的普通羊水培养基终止消化, 1 500 rpm离心10 min后收集细胞进行FISH操作。 (2) 绒毛或皮肤细胞FISH检测:①样本玻片制备:收集已提取绒毛或皮肤细胞, 加预热的0.075 M KCl溶液低渗, 绒毛细胞低渗30 min, 皮肤细胞低渗40~60 min;室温下预固定10 min, 离心后固定3次, 每次10 min;制备2~3张玻片, 75 ℃烤箱老化玻片60 min。②玻片预处理:室温下用2×SSC漂洗玻片2次, 每次5 min;室温0.1 M HCl中浸泡10 min;用37 ℃装有6 μg胃蛋白酶的40 mL 0.01 M HCl溶液浸泡玻片10 min, 室温下用2×SSC漂洗玻片2次, 每次5 min;-20 ℃预冷, 在70 %、85 %乙醇中各浸泡2 min, 无水乙醇浸泡10 min, 自然干燥;加热玻片至56 ℃。③标本杂交:73 ℃变性液浸泡玻片8 min进行变性处理, 分别置于预冷的70 %、85 %、100 %乙醇处理3 min, 自然干燥, 加热至47 ℃, 将杂交缓冲液、去离子水、探针按7∶1∶2比例配好后加入离心管, 73 ℃水浴锅变性5 min;变性后的杂交探针滴于玻片上, 盖盖玻片, 在湿盒中37 ℃过夜。④标本洗涤:避光条件下移去盖玻片, 47 ℃洗液洗3次, 每次5 min;47 ℃ 2×SSC浸泡10 min;47 ℃ 0.1 % NP-40浸泡5 min;室温下70 %乙醇浸泡10 min, 自然晾干;滴加适量DAPI荧光染料。⑤镜检:荧光显微镜下, 100×油镜观察染色体荧光信号。
1.2.3 诊断标准
每例样本计数100个细胞, 90 %以上的细胞正常提示为正常结果, 90 %以上的细胞异常提示为异常结果, 如果无法判断则扩大计数至200个细胞。
2 结果
在26例中, 检测出异常结果9例, 异常率34.6 %, 其中45X 2例、46XX/46XY 1例、47XN+18 2例、47XXY 1例、47XN+21 2例, 69XXY 1例。详见表1。
3 讨论
目前妊娠结局中自然流产、死胎现象普遍增多, 且大部分是由遗传因素引起, 胎儿染色体疾病主要表现在第13号、第18号、第21号及X、Y染色体数目异常与结构异常[4], 本研究通过13q14、21q22基因片段荧光标记和着丝粒荧光标记检测探讨流产儿或死胎儿发病原因, 为下一次妊娠提供更全面的参考数据。
孕妇流产后的绒毛或皮肤等标本由于胚胎停止发育而使细胞失去活性、取材不当导致标本被污染等原因, 导致这些标本很难培养成功。利用荧光原位杂交技术对这些标本进行检测, 可以弥补传统核型分析需要活细胞培养的严格条件。同时FISH检测还有检测时间短、方法简单, 对标本质量要求低、受外界影响因素少等优点[5]。
在本次检测的26例自然流产或死胎后的绒毛皮肤标本中, 检测出5种染色体异常9例 (34.6 %) , 说明在流产的原因中有30 %以上是由于胚胎的染色体数目异常所致, 属于染色体数目异常后母体对胚胎的自然淘汰, 比以往报道的早孕期流产50 %为染色体数目异常要少, 原因可能是: (1) 由于在以往的报道中, 标本的检测主要以细胞培养的方法为主, 可以检测所有的染色体数目异常, 而我们只检测了5种染色体数目异常, 所以会有一部分漏检。 (2) 我们检测的标本中皮肤标本主要是大月份的死胎标本, 大月份死胎原因染色体数目异常率较低。 (3) 我们检测样本量较少。需要进一步扩大样本量, 探索自然流产胎儿染色体异常患病率与孕妇年龄、孕周、流产次数等其他因素之间的关系。
本研究通过对流产组织标本的FISH检测, 为这些孕妇的流产原因寻找一种方便可行的判断方法, 为孕妇的下次妊娠提供可靠的遗传咨询信息。
摘要：目的:利用荧光原位杂交技术 (FISH) 快速检测流产儿是否患有染色体疾病, 为流产组织的遗传检测提供一种有效的检测方法。方法:选用13、18、21、X、Y无色探针对不明原因流产后的胎儿皮肤或绒毛等组织进行FISH检测。结果:26例标本中检测出异常染色体9例, 异常率为34.6%;其中45X 2例、46XX/46XY 1例、47XN+18 2例、47XXY 1例、47XN+21 2例、69XXY 1例。结论:荧光原位杂交技术可用于检测流产、死胎后的组织标本, 为无法进行细胞培养核型分析的胎儿标本提供一种有效的检测方法。
关键词：荧光原位杂交,自然流产,死胎,染色体疾病
参考文献
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[4]崔婉婷, 李婷婷, 刘彩霞, 等.应用荧光原位杂交技术检测自然流产组织染色体数目异常[J].中国优生与遗传, 2012, 20 (5) :48-50.
原位杂交 篇7
1 荧光原位杂交技术的发展与改进
荧光原位杂交是在放射性同位素原位杂交的基础上改进而来的, Manning等[3]在1975年最早用非放射性的生物素通过细胞色素C与RNA分子链接, 开创了非放射性标记, Rudkin等1977年在放射性同位素标记的基础上发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术, Langer等在1982年成功地实现了首例用生物素标记探针的原位杂交, 自此荧光原位杂交技术真正建立并不断发展改进。随着分子生物学技术的发展, FISH技术还衍生出了引物原位标记、间期核FISH、染色体原位抑制技术等, 并且还发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH以及近年来微阵列技术等这些更为完善的FISH技术。
1.1 FISH中探针的发展改进
特异探针序列的正确选择是FISH技术中的一个关键, 随着FISH技术发展, 针对不同的研究对象和目的, 探针的类型也有了许多改进, 主要有以下几种:1) 染色体特异重复序列探针:r DNA、端粒、着丝粒以及类似于α卫星、卫星Ⅲ等重复序列上重复元件可达106拷贝数, 其杂交靶位点大于1Mb, 杂交信号易于检测, 常用于检测非整倍体;2) 基因组探针:高等动物基因组DNA除过很小一部分的编码序列外有一些高频率的重复序列, 进化上的保守性使其具有物种特异性, 作为探针, 可分析多倍体的起源、进化、基因组成等;3) 单拷贝序列探针:针对靶片段中的单拷贝序列而选择的此类探针, 通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段;4) 染色体文库探针:此类探针由从基因组文库中的一条染色体或某一区域核酸片段组成, 片段较小, 因此被破坏的可能性小。用于鉴定染色体的易位与畸形以及分析中期染色体重组和间期核结构;5) RNA探针:RNA探针敏感性强, 不需要变性, 就可形成比DNA探针紧密的杂交体。RNA探针包括的ss RNA探针和寡核苷酸RNA探针两种。
1.2 FISH中靶的发展与改进
在FISH中根据不同目的不同对象确定靶片段的类型是提高分辨率的关键因素, 靶目标的类型有以下几类:1) 中期染色体:此时期染色体可以通过简单的染色体制片技术获得, 但因其高度凝缩, 分辨率只能达到1Mb~3Mb的水平;2) 粗线染色体:处于减数分裂的粗线期染色体浓缩程度比中期低得多, 而且Jiming等人证实用玉米粗线期染色体固定于4%福尔马林可以使染色体伸长到原来的20倍[4], 进而提高了FISH分辨率;3) 间期细胞核:处于间期的细胞核染色质浓缩程度比粗线期低, 因此其分辨率相对较高;4) 游离染色质:处理细胞核释放出游离染色质, 进一步降低DNA的浓缩程度, 这种方法能有效地将分辨率提高到1Mb范围内;5) DNA纤维:伸长的DNA纤维是裸露的DNA分子, 暴露出更多的杂交位点, 更大程度的提高了分辨率, 具有高效快速直接的优点。此外Valfirik等[5]发展了一种超伸展的流式分拣植物染色体FISH技术, 大大提高了FISH的分辨率。此方法可获得比中期染色体长100倍以上的伸展的染色体纤维, 同时保持了染色体的完整性, 用于某些方面的研究, 比DNA纤维荧光原位杂交更具优势。
1.3 探针标记方法的发展与改进
FISH中探针的荧光标记方法是由放射性标记方法改进而来, 可分为直接法和间接法两种。直接法是将荧光物直接与探针核苷酸的磷酸戊糖共价结合, 杂交后简单冲洗即可检测。间接法是先在探针DNA上结合诸如生物素或地高辛等半抗原, 杂交结束后再用标记有荧光素的相应半抗原的抗体进行检测, 间接标记可分为PCR法、不依赖序列的扩增法、缺口平移法三种。直接法虽然操作简单, 但信号放大程度不如间接法, 灵敏度差一些, 间接法灵敏度高, 应用较为广泛。早先的荧光标记只用一种颜色的荧光素, 随着FISH技术的发展, 在一次杂交种用多种探针多种荧光素的多彩FISH技术已成为可能。双标记的寡核苷酸探针荧光原位杂交可提高信号强度且不引起特异性问题还能增加r RNA可访问性。
2 FISH技术的应用
2.1 FISH在植物基因定位上的应用
由于FISH技术可在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位, 直接得到它们的相关位置和顺序, 因而已广泛应用于生物基因组和功能基因定位研究[6]。王永等[7]利用FISH技术研究发现羽衣甘蓝2号染色体上存在3个5Sr DNA串联重复位点, 并且这3个位点都位于2号染色体的长臂靠着丝粒处。杨学明等采用顺序基因组原位杂交和双色荧光原位杂交技术, 对普通小麦-簇毛麦6V代换系K0736的45Sr DNA和5Sr DNA基因位点进行了分析。结果表明, 该代换系2n=42, 有1对簇毛麦6V染色体, 为6V/6A代换系, 45Sr DNA位点有8对, 位于7对染色体上。5Sr DNA位点有6对, 分别位于6对染色体上[8]。周树军等[9]利用FISH技术对麝香百合、柠檬色百合、天香百合及豹纹百合染色体上的45Sr DNA进行了定位, 其结果显示45Sr DNA在这四种百合中都分布在染色体的着丝点附近, 但其位点数量、所存在的染色体和信号的强度有很大的变化。
2.2 FISH在植物起源进化及亲缘关系研究上的应用
利用荧光原位杂交技术通过对特定DNA序列特别是编码序列在染色体上分布位置的研究, 对探讨基因组起源、进化具有重要的理论意义[10]。宋国立[11]采用多种探针对8个二倍体或四倍体的棉种进行FISH研究, 通过对比信号出现的位置、数目、强度等, 探讨了棉属的起源与演化。
2.3 FISH在植物远缘杂种的鉴定及外源染色质检测上的应用
利用远缘杂交手段将有利基因的异源染色质渐渗到栽培植物中形成新的种质[12], 以达到增强栽培种生存及生产能力的目的。采用FISH技术可以快速、准确、灵敏地鉴定有利基因是否成功渗入。杨足君等[13]通过利用基因组原位杂交和FISH方法鉴定了多年生簇毛麦优异基因在小麦的导入结果。任贵玲等[14]利用FISH技术快速准确地研究出了亚洲百合、青岛百合及二者杂交后代的45Sr DNA的数目及其分布的染色体情况。
3 展望
FISH技术是生物学研究强有力的方法, 随着分子生物学技术、染色体制片技术的发展FISH技术也日趋完善, 限制FISH技术应用的关键因素是靶DNA的分辨率, 那么提高FISH分辨率对基因定位成功至关重要[7]。将FISH技术与蛋白质荧光染色技术结合, 用于研究染色体上与DNA序列结合的蛋白质。将FISH用于生物学基础研究, 探究基因的转录和翻译中尚未解的奥秘以及DNA序列中非编码序列的功能, 将FISH与电镜技术结合来研究植物超微结构。随着分辨率及灵敏度的进一步提高, FISH的应用将会越来越广泛。
摘要：荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization, FISH) 是在染色体上快速定位基因的有效方法, 此项技术已应用于植物学研究的很多方面。本文通过简要介绍荧光原位杂交探针类型、靶标本的类型、标记探针的方法概述了荧光原位杂交技术的原理与发展, 总结了该技术在植物学中的一些应用现状并提出展望。
原位杂交 篇8
比较基因组原位杂交(comparative genomic in situ hybridization,cGISH)是一种新的基因组原位杂交分子显带方法,在没有封阻情况下,用一种植物的总基因组DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交,其杂交信号检出程序是专门用于检出重复DNA顺序的,因此可以直观地显示不同物种间共享的重复序列在染色体上的分布[9]。cGISH最初用于植物中检测杂交后代是否存在或渗入了原物种的基因组DNA,后来逐渐成为一种基因组进化分析的新手段。不同种间的比较基因组杂交在物种进化和亲缘关系的研究上有重要作用[10,11],是研究不同种基因组间重复序列的变异性和保守性的一种简便方法。
甚至可以用一种植物的总基因组DNA与广泛的远缘物种杂交,进行大范围的植物基因组比较分析[12]。如:Jutta等[9]以拟南芥总基因组DNA为探针,对10个其他物种的染色体进行比较基因组原位杂交,检测到种间保守的重复DNA序列的杂交信号,信号的分布特点在不同种或不同染色体上是不同的。
禾本科(Gramineae)高粱属(Sorghum)植物中的大多数种类为抗旱作物,在世界各干旱地区有广泛的种植,作为粮食、饲料、工业原料等具有很高的经济价值。栽培高粱(S. bicolor)、甜高粱(S. dochna )、拟高粱(S. propinquum)均为高粱属植物,染色体数均为2n=20。栽培高粱是古老的谷类作物之一,它具有抗旱、耐涝、耐盐碱、适应性强的优点,所以在现代的农业生产上一直占有重要的地位。甜高粱是栽培高粱的一个变种,因其含糖量高而得名。拟高粱是一种野生种质资源,对高粱品种的改良具有重要意义。已有的研究表明,栽培高粱与甜高粱亲缘关系较近,但它们与拟高粱亲缘关系较远[13]。本研究中,我们以拟高粱总基因组DNA为探针,对栽培高粱、甜高粱染色体上进行定位,以比较拟高粱与栽培高粱、甜高粱之间的基因组关系。
1 材料和方法
1.1 植物材料和染色体制片
供试材料栽培高粱(S. bicolor,2n=20)、甜高粱(S. dochna,2n=20 )、拟高粱(S. propinquum,2n=20),均由广西畜牧研究所李冬郁提供。
染色体制片参照Song等[14]的方法并略做修改。
1.2 基因组DNA提取及标记
拟高粱总基因组DNA提取采用CTAB法提取[15]。用抢头反复吹打将DNA打断为10 kb左右,用切口平移法对打断的DNA进行标记,适当增加DnaseI的比例并延长标记时间至4 h,0.5 mol·L-1 Na2EDTA终止反应,点印迹检测效果(华美生物公司)。
1.3 原位杂交及信号检出
参照Guatafaon等[16]方法并略作修改。
1.3.1 原位杂交
(1) 染色体制片在60 ℃烘片30 min。
(2) RNaseA(10 mg·L-1,用2×SSC 稀释)在37℃处理1 h。
(3) 2×SSC,75℃下处理5 min。
(4) 70% 甲酰胺75 ℃处理3.5 min。
(5) 于-20℃体积分数 70%、95%、100% 乙醇中各处理5 min。
(6) 置室温下约20 min,使染色体制片完全干燥。
(7) 沸水中变性杂交液(杂交液中含质量分数50%去离子甲酰胺,8%硫酸葡萄糖,鲑精DNA 2 μg,10%20×SSC,0.1%SDS)10 min,迅速置冰上5 min以上。
(8) 加入40 μL 杂交液至染色体制片上,盖24 mm×50 mm 的盖玻片,90 ℃共变性8～10 min,在37 ℃保湿皿中温育16～24 h。
1.3.2 荧光信号检测
1.3.2.1杂交后的片子依次在42℃2×SSC溶液、0.1×SSC溶液中各漂洗15 min;0.1% TritonX-100 室温下处理5 min;1×PBS 溶液室温下处理5 min。
1.3.2.2 每张制片加100 μL链亲和素-CY3(streptavidin-Cy3)(1g·L-1链亲和素-CY3 0.4 μL用1%BSA/PBS稀释成50 μL)或抗地高辛-FITC(anti-digoxigenin-FITC)3 μL 200 mg·L-1抗地高辛的抗体-FITC用1%BSA/PBS稀释成50 μL )37 ℃温育1 h。1×PBS 溶液室温下振荡处理3 次,每次5 min。
1.3.2.3每张制片加40 μL 含20%抗瘁灭剂(Vectashield)的DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole ) 复染(1 mg·L-1DAPI溶于含20%抗猝灭剂的1×PBS中;盖24 mm×50 mm的盖玻片。
1.3.2.4制片在Olympus BX51荧光显微镜下,红色、绿色、蓝色荧光分别用G、B、UV滤光观察,利用DP70成像系统和DPController、DPManager软件合成照片。Photoshop 软件进行图片处理。
2 结果
以生物素标记的拟高粱总基因组DNA对自身有丝分裂中期染色体杂交时,每条染色体大部分被涂染,显示很强的杂交信号,少部分显示较弱的杂交信号(图1:c)。这一结果表明,拟高粱基因组中重复顺序占很大比重。荧光原位杂交的信号与DAPI染色带型比较发现,在DAPI荧光亮度较大的着丝粒和近着丝粒区域荧光原位杂交的信号较强,而在DAPI浅染的常染色质区杂交信号相对较弱(图1:a、b)。与栽培高粱基因组杂交显示杂交信号集中分布在被DAPI深染的着丝粒附近,而染色体臂远端无散在分布的信号,表明两个品种间在染色体臂远端部分重复序列的同源性很低(图1:d、e、f)。与甜高粱基因组杂交时,从杂交信号分布看,信号的强弱分布不连续,某些染色体的着丝粒区、长臂内、短臂中部显示较弱的杂交信号,而在某些染色体的着丝粒区、长臂中部或远端、短臂内显示增强的信号,但信号强度要比拟高粱总基因组DNA对自身和栽培高粱染色体杂交时相对弱些(图1:g、h、i)。
3 讨论
为了研究物种基因组之间的同源性,人们主要利用RFLP、RAPD等各种分子标记进行基因组间的比较遗传作图,来揭示物种间染色体或染色体片段上基因的同线性(synteny)或共线性(colinearity)的存在[17,18]。然而,这一技术仅仅是用一部分标记来探测整个基因组的关系,难免有一定的局限性,不能全面地反映基因组之间的关系,特别是不能反应它们重复DNA的特点。在真核生物基因组中重复序列占有很大比例,它们比编码序列更容易发生变异,物种间重复序列的同源程度可以反应它们亲缘关系的远近。许多重复序列在近缘种甚至不同属间是共享的,但在不同基因组中分布模式是不同的,而有些重复序列是基因组甚至染色体特异的[19,20]。
比较基因组原位杂交可以直观地显示该物种及不同物种间共享的重复序列在染色体上的分布,它是研究不同种基因组间重复序列的变异性和保守性的一种简便方法。本研究以拟高粱总基因组DNA为探针,对栽培高粱、甜高粱基因组进行杂交,结果表明栽培高粱、甜高粱和拟高粱基因组中重复序列存在很大的同源性,基因组进化关系表现出保守性。甜高粱与拟高粱基因组间重复序列的同源性要比栽培高粱与拟高粱间重复序列的同源性低些。
