酪氨酸酶抑制剂

关键词：

酪氨酸酶抑制剂（精选八篇）

酪氨酸酶抑制剂 篇1

关键词：酪氨酸酶,抑制剂,植物来源,人工合成

酪氨酸酶 (Tyrosinase) , 又称多酚氧化酶, 是一种含铜金属酶, 广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中, 并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为, 羽毛, 毛发, 眼睛, 昆虫表皮, 种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素, 都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能, 是生物体内参与黑色素 (melanin) 合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段:远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化, 由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌;远端步骤包括化学反应和酶反应, 最终合成黑色素。

酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用, 因此, 可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。

酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛, 不仅有天然产物, 而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列, 这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。

1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂

众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示, 很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用, 并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。

1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂

多酚类化合物, 如单宁酸, 广泛的存在于自然界中, 与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂, 另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物, 如4’, 5, 7-三羟基黄酮、槲皮素、苦参酮、苦参碱F均在植物中被分离出来。Kubo等人详细研究了天然产物对酪氨酸酶抑制的构效关系。研究发现, 文献中所有的黄酮类化合物之所以能够作用酶的活性中心来抑制酶的活性, 原因是3位上自由羟基的存在。但是, 进一步的研究发现, 对于另一些不含3位羟基的黄酮类衍生物, 如4’-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮和7-O-葡萄糖甙取代的四羟黄酮, 仍然对酪氨酸酶具有抑制性。Badria和el Gayyar发现含α-酮基的黄酮类衍生物对酪氨酸酶也具有抑制效果, 原因可能是L-DOPA和含α-酮基的黄酮类衍生物具有相同的二羟苯基。上述的结果揭示了天然产物中新的酪氨酸酶抑制剂, 这些化合物会被进一步研究以便将来用于治疗色素沉着。另一类重要的多酚类化合物是没食子酸及其衍生物, 以D-葡萄糖多酯的结构出现, 并且这类化合物在食品工业上作为添加剂应用非常广泛。各种没食子酸衍生物从绿茶和五倍子中被分离出来, 并且其中的一些对酪氨酸酶抑制作用很强。研究发现, 没食子酸在3位和黄酮成酯后对于酪氨酸酶活性具有很大影响。有趣的是从五倍子中分离而得的1, 2, 3, 4, 6-五-没食子酰-β-D-葡萄糖 (PGG) 抑制酪氨酸酶的活力并没有因为被苯环上酯化、羟基化、甲基化而下降。

1.2 醛类及其他类别化合物

大量的醛类及其他类别化合物在高等植物中被分离。这些化合物, 诸如肉桂醛、2-烯醛类、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、茴香醛、枯茗醛、3, 4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸等均是酪氨酸酶抑制剂。醛基和巯基、氨基、羟基一样, 是一种具有生物活性的亲核基团, 因此能够和酶的伯氨基形成席夫碱反应。比较各种醛类及其结构类似物, 如肉桂酸、茴香酸、枯茗醛、枯茗酸、安息香酸对酪氨酸酶的抑制能力, 其中枯茗醛最强, 因为枯茗醛的醛基受到异丙基和甲氧基这两种供电子基团的诱导效应的影响容易在酶的活性部位形成比较稳定的席夫碱。如2-烯醛类化合物, 亲油性烷基链的长短对抑制性会产生影响。因为酪氨酸酶的活性中心是疏水性的“口袋”, 随着碳链增长, 分子的亲酯性提高, 因此与酶的结合力增强。Kubo等人研究发现, 除了2-羟基-4-甲氧基苯甲醛之外, 芳香类的醛是酪氨酸酶的非竞争性抑制剂。大部分的抑制研究是通过衡量酶的半抑制浓度 (IC50) 来确定的, 当然, IC50是一个重要的指标, 但是不是唯一的指标, 它仅在于描述二酚酶活性抑制上比较准确。因此, 研究更多的酪氨酸酶单酚酶和二酚酶抑制动力学参数必要的。

1.3 真菌来源酪氨酸酶抑制剂

除了来自于高等植物, 从真菌中也发现了很多酪氨酸酶抑制剂。M a d h o s i n g h和Sundberg从圆生蘑菇分离、纯化得到了两种酪氨酸酶抑制剂, 通过Lineweaver-Burk双倒数方程发现, 抑制剂Ia为竞争性抑制剂, 而另个抑制剂Ib为非竞争性抑制剂。从黑曲霉中分离得到的金属硫蛋白对酪氨酸酶活性中心的铜原子具有很强的螯合性, 因此对酪氨酸酶的抑制性非常强。分析其抑制机理, 可能为蛋白所带的巯基能够和醌发生亲核反应, 生成无色的硫醚。经体外研究发现, 从圆蘑菇中分离的蘑菇氨酸不仅是酪氨酸酶二酚酶的非竞争性抑制剂, 而且是单酚酶的竞争性抑制剂。

2 人工合成酪氨酸酶抑制剂

表2列出了各种通过人工合成而来的酪氨酸酶抑制剂。有一些市售药物也是酪氨酸酶抑制剂, 尽管它们的结构比较简单。

2.1 药物

抗高血压药卡托普利通过不可逆的非竞争性抑制单酚酶和竞争性的抑制二酚酶活性, 从而阻止了黑色素生成, 机理为生产的醌受到亲核进攻形成无色的产物]。对单酚酶和二酚酶的抑制为正协同性。该药会和酶形成卡托普利-铜复合物以及能够与活性部位的半胱氨酸残基形成二硫键。抗甲状腺药物甲硫咪唑对单、二酚酶均有抑制作用。和卡托普利相比较, 和酶的作用机制类似, 但是抑制类型却不同。

2.2 合成化合物

很多文献报导了诸多化合物, 如过氧化氢、羟胺、钛铁试剂和芳香族羧酸均是酪氨酸酶抑制剂。另外一些文献报导了抑制剂与酶是慢结合型抑制机理。过氧化氢抑制酪氨酸酶可以分两个阶段, 并且第一阶段相对第二阶段迅速。酶的抑制程度大小取决于过氧化氢浓度及其环境的p H, 并且在限氧条件下抑制速度比供氧条件下要快。铜螯合剂 (如环庚三烯酚酮和叠氮钠) 和底物类似物 (如L-含羞草碱、L-苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、苯甲酸钠) 均能够阻止过氧化氢对酪氨酸酶的失活, 表明酶活性中心的铜原子对于失活至关重要。另一种酪氨酸酶抑制剂羟胺在低浓度 (33mmol/L) 时会缩短单酚酶的延滞时间, 而当浓度大于20mmol/L时, 羟胺将会抑制二酚酶酶活, 减少了黑色素的生成, 并且在限氧条件下的失活速率会加快, 原因为羟胺会和醌形成具有颜色的肟。羟胺和二酚酶作用导致了酶的抑制是由于有色产物引起的光谱变化和羟胺对酶的失活。在N-取代亚硝基胍类化合物中抑制能力最大的是N-环戊基-N-亚硝基胍, 其IC50值为0.6μmol/L, 去掉亚硝基或者羟基, 化合物对酪氨酸酶没有抑制性, 说明这两个官能团是影响酪氨酸酶活性的必须官能团, 作用机理可能为化合物对活性中心的铜原子有影响。与L-DOPA相比, 钛铁试剂是一种弱的还原剂, 当酪氨酸在羟基化时, 少量还原剂的存在能够促进反应, 钛铁试剂只延长反应的延滞时间, 而几乎不会影响L-DOPA的生成。然而, 钛铁试剂在较高浓度下还原性增加, 而延滞时间会缩短。

半胱氨酸和大量的芳香族羧酸是酪氨酸酶的抑制剂。通过抑制剂的本身属性和酶的测活途径来判断是竞争性、非竞争性、混合型、还是反竞争性类型。但是, 半胱氨酸和谷胱甘肽这类含巯基的化合物在较高浓度时, 氧气变得无关紧要, 都能够使酶失活。研究发现二甲硫醚是蘑菇酪氨酸酶的竞争性慢结合抑制剂, 是研究的第一个挥发性的酪氨酸酶抑制剂。二甲硫醚在植物组织中有一定的生理作用, 高浓度的二甲硫醚会抑制酪氨酸酶的表达, 因此可以抑制植物的褐变。

参考文献

[1]陈清西, 宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J], 厦门大学学报:自然科学版, 2006, 45 (5) :731-737.

[2]李韶勇, 孙命, 曲娜, 等.黑色素的合成及其常见抑制剂的作用机理, 天津师范大学学报[J], 2002, 22 (1) :17-21.

酪氨酸酶的研究进展 篇2

酪氨酸酶的研究进展

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中,与生物体合成色素直接相关.在人体中,它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关.因此对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控,以及酪氨酸酶的抑制剂和激活剂的研究,引起国内外的广泛重视.目前,对酪氨酸酶活性中心及其催化功能的.研究比较透彻,但对酪氨酸酶蛋白的立体结构尚不清楚.

作 者：陈清西 宋康康 CHEN Qing-xi SONG Kang-kang 作者单位：厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建,厦门,361005刊 名：厦门大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：200645(5)分类号：Q356.1关键词：酪氨酸酶 黑色素 色素障碍性疾病 基因 活性中心

红葱提取物对酪氨酸酶的抑制作用 篇3

酪氨酸酶（Tyrosinase，ECI.14.18.1）是一种多酚氧化酶，广泛存在于动植物和人体内，是动植物体酶促褐变、体内色素合成的关键酶。它能将酪氨酸羟化，产生邻位二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，进而产生黑色素。因此，其代谢产物黑色素决定皮肤颜色深浅，其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，如雀斑、黄褐斑、老年斑等，因此酪氨酸酶活性是化妆品行业皮肤美白和治疗皮肤色素沉着性疾病的药物作用研究靶点。近年来，酪氨酸酶抑制剂的研究非常活跃，有关植物提取物对酪氨酸酶的抑制作用也越来越受到研究人员的重视。endprint

酪氨酸酶（Tyrosinase，ECI.14.18.1）是一种多酚氧化酶，广泛存在于动植物和人体内，是动植物体酶促褐变、体内色素合成的关键酶。它能将酪氨酸羟化，产生邻位二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，进而产生黑色素。因此，其代谢产物黑色素决定皮肤颜色深浅，其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，如雀斑、黄褐斑、老年斑等，因此酪氨酸酶活性是化妆品行业皮肤美白和治疗皮肤色素沉着性疾病的药物作用研究靶点。近年来，酪氨酸酶抑制剂的研究非常活跃，有关植物提取物对酪氨酸酶的抑制作用也越来越受到研究人员的重视。endprint

酪氨酸酶抑制剂 篇4

酪氨酸酶 (Tyrosinase) 是广泛存在于人体、动物、植物及微生物中的含铜氧化还原酶[5], 具有奇特的催化作用, 是生物体内黑色素合成的关键酶, 与皮肤的衰老及恶性黑色素瘤的发生有着紧密的关系[6]。酪氨酸酶的活性受到酪氨酸酶抑制剂的抑制, 使生物体内不能正常地合成黑色素。因此, 在医学和化妆品领域中常采用酪氨酸酶抑制剂来预防和治疗色素沉积、黑色素瘤等。此外, 酪氨酸酶抑制剂还可用作果蔬的防腐及害虫的调控剂[7]。当前对酪氨酸酶抑制剂的研究已经引起相关研究学者的高度重视。丝胶蛋白具有抑制酪氨酸酶的活性是由日本学者Kato[8]首先发现。自此之后, 尽管也有丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的报道, 但是绝大多数所研究的丝胶蛋白都是利用有机溶剂从工业废水中进行提取, 很大程度上制约了丝胶蛋白在皮肤护理产品、食品添加剂等领域的应用[9]。安徽省农业科学院蚕桑研究所陈复生等[10]根据多年的家蚕遗传育种工作, 选育得到全天然丝胶茧, 其天然活性物质—丝胶蛋白不仅含量丰富, 而且对皮肤的刺激性小、乳化性能优良、安全性高, 因而在化妆品和保健食品等行业中具有广阔的发展前景。

本研究以育成的天然丝胶茧为材料, 从中提取丝胶蛋白, 采用多种蛋白酶进行酶解, 从中选取最佳蛋白酶;通过测定丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性, 并以多巴为底物, 分析其对酪氨酸酶活性的抑制作用, 为发掘丝胶蛋白这一优质蛋白质的应用潜能提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

天然丝胶茧品种:绿S, 由本单位选育并饲养。饲养温度在25℃左右, 常规桑叶育, 化蛹后取茧壳作为实验材料。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶 (南宁庞博生物工程有限公司) , 十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、低标准蛋白质分子量 (Takara公司) , 蘑菇酪氨酸酶、L-多巴 (美国Sigma公司) , 其他试剂均为分析纯。

1.2 丝胶蛋白粉的制备

温水洗涤蚕茧, 60℃烘干后剪碎。准确称取5.00g碎茧壳, 加入到含250mL去离子水的烧瓶中, 于高温灭菌锅中125℃煮沸2.5h。室温冷却后采用四层纱布过滤, 将所获得的丝胶溶液进行真空抽滤, 于60℃旋转蒸发至约100mL。将丝胶蛋白浓缩液在-40℃下预冻2h后于-33℃, 压强1Pa条件下进行冷冻真空干燥, 所得丝胶粉末即为丝胶蛋白粉[11]。

1.3 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果

参照文献[12]的方法选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对提取的丝胶蛋白进行酶解。在pH 7.0、反应温度50℃、酶浓度为0.5%、底物浓度10%、反应时间1h的条件下进行酶解。反应结束后立即加热至95℃, 保持5min, 进行灭酶活处理。待溶液冷却至室温, 即可将获得的丝胶蛋白酶解产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法 (SDS-PAGE, 10%分离胶, 5%浓缩胶) 测定其分子量大小。将所得的丝胶蛋白酶解产物浓缩、冷冻干燥, 研磨成粉末状备用。

1.4 丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性

准确称取1.00g丝胶蛋白及酶解产物, 配成质量百分比为10%的悬浮液, 于95℃水浴锅中振荡保温2.5h后, 5000r/min转速下离心30 min, 然后将上清液置于平面皿中烘干 (60℃) , 称取溶出物的质量, 根据以下公式计算溶解率。

其中m为溶出物的干质量, m0为样品的干质量。每个样品平行测定3次。

1.5 酪氨酸酶活性的抑制率测定

在黑色素合成的过程中, 酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴。多巴又被酪氨酸酶催化为多巴醌。多巴醌是体内黑色素合成的一个中间体, 也是一种有色物质, 可用分光光度计在475nm处测定其含量[13]。

准确吸取丝胶蛋白或酶解产物溶液、磷酸缓冲液 (pH 6.8) 、L-多巴溶液 (0.5mg/mL) 比色管中混合均匀, 25℃下放置约10min, 缓慢加入适量的酪氨酸酶液, 迅速转移到石英比色皿中, 于475nm处测第10min的吸光度。pH6.8的磷酸缓冲液为参比, 总反应体系为5mL。具体各组分含量见表1。

酪氨酸酶活性的抑制率 (%) =[1- (OD3–OD4) / (OD1–OD2) ]×100%

2 结果与分析

2.1 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果

在蛋白酶 (木瓜/中性/碱性蛋白酶) 浓度为0.5%, pH 7.0, 50℃, 底物浓度10%, 反应时间1h的条件下, 分析这3种蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果。由图1可以看出, 丝胶蛋白的分子量在14~97.2kDa均有分布;丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后, 其酶解产物的分子量集中分布在14~29kDa;而中性蛋白酶和碱性蛋白酶对丝胶蛋白的水解作用与对照组 (无蛋白酶) 相比几乎没有差别。显而易见, 木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的酶解功效优于其他两种蛋白酶。因此, 选取丝胶蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物进行下一步研究。

1—对照组 (无蛋白酶) 2—木瓜蛋白酶3—中性蛋白酶4—碱性蛋白酶M—蛋白标准

2.2 丝胶蛋白及酶解产物的溶解性

如表2所示, 酶解产物的平均溶解率 (68.83%) 高于丝胶蛋白 (52.77%) 。猜想原因可能是丝胶蛋白的肽链被木瓜蛋白酶切断, 蛋白质的高级结构受到损坏, 从而使水解产物本身含有的亲水性基团暴露出来, 与外界的水更易结合, 最终使其溶解性增强[14]。

2.3 丝胶蛋白及其酶解产物抑制酪氨酸酶的活性

丝胶蛋白及其酶解产物都具有不同程度的抗酪氨酸酶活性的能力 (图2) 。在相同的浓度下, 酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率要高于丝胶蛋白, 可能是因为酶解产物的分子量较小。随着质量分数的增加, 丝胶蛋白对酪氨酸酶活性的抑制率也随之提高, 说明丝胶蛋白的浓度与酪氨酸酶活性的抑制作用成正相关关系。酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率也出现类似现象, 呈剂量依赖性。

3 讨论

采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性白酶降解高分子量的丝胶, 结果显示木瓜蛋白酶降解能力高于其他两种蛋白酶。SDS-PAGE结果显示使用木瓜蛋白酶在反应条件为反应温度50℃、底物浓度10%、pH 7.0、酶浓度0.5%、反应时间为1h, 可以获得在14~29kDa范围的酶解产物 (图1) 。这是因为木瓜蛋白酶隶属于巯基蛋白酶, 首先分解精氨酸、赖氨酸的羧基端[15]。而丝胶蛋白含有较为丰富的精氨酸, 经木瓜蛋白酶酶解后, 释放出小分子的多肽和游离氨基酸[14]。这就说明了丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产物的分子量大幅减少。

丝胶蛋白中含有大量的亲水性氨基酸, 其中绝大多数都能够被人体吸收, 并且含有类黄酮等活性物质[16]。而黄酮类物质已经被证实具有抑制酪氨酸活性的作用[17]。这从理论上阐明了丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的机制。本研究及前人的研究结果也进一步证明丝胶蛋白能够抑制酪氨酸酶活性[18]。

在本研究中, 丝胶蛋白的酶解产物对酪氨酸酶同样具有抑制作用, 且随着酶解产物浓度的增加, 其对酪氨酸酶的抑制率也随之提高, 呈现一定的剂量依赖性。这是因为丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产生了小分子量的丝胶多肽。这些多肽中又含有丰富的羟基、羧基等官能团, 使其与微量元素如铜、铁络合的几率大大提高, 最终抑制了酪氨酸酶的活性[7,8]。

丝胶及其水解产物可以根据其分子量大小应用到不同的领域中。10~70kDa的丝胶多肽与胰岛素共轭结合后添加到糖尿病小鼠中, 结果发现这种经过改良后的药物能够起到缓释作用[19];4~60kDa的丝胶多肽能够头发护理产品中常用的添加剂—水溶性的壳聚糖衍生物以及三甲胺衍生物发生相互作用, 更好地发挥产品的优良性能[12];平均分子量为30kDa的丝胶多肽可以取代哺乳类动物、昆虫细胞培养基中的胎牛血清, 从而大幅度地降低成本[20];低于20kDa的丝胶多肽还可以应用到包括皮肤和头发护理产品的化妆品、保健品和药物中[21]。

孕妇丙氨酸氨基转移酶偏高的原因 篇5

因为转氨酶是从胆管排出的，如果有胆管、胆囊及胰腺疾患，胆管梗阻，也可使转氨酶升高。临床常见的有胆囊炎、胆管蛔虫、肝胆管细石、胆囊及胆管肿瘤、壶腹周围癌、先天性胆管扩张症、急慢性胰腺炎、胰头癌及出血坏死性胰腺炎。

药源性或中毒性肝损害，以及药物过敏都可引起转氨酶升高，并常伴淤胆性黄疸和肝细胞损伤。临床有报告在用药12～48小时即可引起转氨酶升高，4～10日可达高峰，及时停药者多在3周内恢复正常。

其它内科疾病，如患系统性红斑狼疮、甲状腺功能亢进、糖尿病、恶性网状细胞病、心力衰竭、风湿热、消化性溃疡、急慢性胃肠炎及尿毒症等均可发生转氨酶升高。

正常妊娠、妊娠中毒症、妊娠急性脂肪肝等也是转氨酶升高的常见原因。

另外，剧烈运动后亦可引起转氨酶增高。运动后乳酸含量增加，在体内积聚，乳酸代谢使机体相对缺氧及低血糖，造成肝细胞膜通透性增加，引起转氨酶升高。

酪氨酸酶抑制剂 篇6

关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶,信号转导,靶标

蛋白酪氨酸磷酸化是细胞用来调控信号传导的一个最主要的手段。在细胞内,酪氨酸磷酸化是同一个动力学可逆的过程,并且该磷酸化过程可以抑制蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的活性 (图1)。 PTKs是用来催化酪氨酸磷酸化,而PTPs控制着去磷酸化过程。因此,PTKs、PTPs及它们相应的底物都属于可调节信号传导网的一类化合物,它们在体内的细胞生长、分化、代谢、细胞周期、细胞间通讯、细胞迁移等这些基本活动中起着极为重要的信号传导调节作用。这一信号转导网的缺陷和不适当则会导致酪氨酸磷酸化的异常,进而引发许多人类疾病如癌症和糖尿病等[1]。

虽然PTPs是构成信号传导通路中很重要的部分,但是它们在人类健康和疾病中的重要性直到近二十年来才受到足够的重视。基于对PTKs的观察,PTP活性的失调是许多人类疾病的致病机理[2]。因此,PTPs在发展临床试剂中代表着一类新的分子目标物,下面我们首先介绍下PTPs结构和机理特性,之后我们将综述下PTPs在信号传导和人类疾病中的重要作用,举例说明特异性的PTP抑制剂的临床意义。最后我们将重点介绍近年来小分子PTP抑制剂方面的发展进程,讨论基于有选择性的PTP抑制剂临床疗效技术的发展。

1 PTP 家族化合物

最初的人类基因序列分析揭示了112种PTPs化合物[3]。与蛋白激酶不同,PTPs的氨基酸序列和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶是不相关的。

PTPs也可以被划分为三大类,即特异性酪氨酸PTPs(tyro-, sine-specific)、双重特异性PTPs(dual-specific)和低分子量的PTPs(图2)。特异性酪氨酸PTPs和低分子量的PTPs目标物必须是含有酪氨酸的蛋白,而双重特异性的PTPs目标物既可以是含有酪氨酸的蛋白,也可以是含有丝氨酸和苏氨酸的蛋白。一些双重特异性的PTPs也可以水解底物而不是水解磷酸蛋白。双重特异性的PTPs包括MAP磷酸酶激酶(MKPs),细胞循环调节器Cdc25磷酸酶和肿瘤干扰抑制器PTEN。

2 PTP结构和催化机理

几十种PTPs的晶体结构已经被确认。虽然氨基酸序列具有多样性和底物具有特异性,双重特异性的PTPs和低分子量的PTPs的晶体仍显示出与特异性酪氨酸PTPs的结构相似性。并且,对催化器重要作用的核心晶体结构部分如PTP活性位点的环状部位,H/V)C(X)R(S/T的序列模式在三类PTPs化合物中均得到了保留。对Yersinia PTP, PTP1B, VHR和小分子PTPs的机理研究表明所有的PTPs都有类似的催化机理,利用活性位点部位的半胱氨酸作为亲核试剂形成一个具有硫代磷酰共价结构的酶中间体,保持不变的精氨酸残基则起着稳定调控状态和保持底物配位亲和功能的作用。磷酸酶中间体第二步则是水解过程,它可以催化天冬氨酸残基。

3 PTPs和人类疾病

许多疾病都与信号传导有障碍有关,其特征就是酪氨酸磷酸化过度或者不能正常实现磷酸化(表1)。例如,SHP-1的突变可以引发人类免疫系统紊乱,导致老鼠中moth-eaten显性因子增多。SHP-1是一种重要的细胞因子信号传导的负调控因子,失去SHP1将会导致酪氨酸不断地磷酸化,继而导致细胞繁殖增生不断增强。这种调控模式增加了有丝分裂,导致了细胞转化。

一些PTPs已经与人类疾病联系在一起。例如: PTEN肿瘤抑制基因突变能够导致很多关键部位的癌症,如脑癌、胸癌和前列腺癌等[4]。遗传学和生化研究表明一些PTPs可以发展为有效的靶向药物,如PTP1B、LAR和PTPα等[5]。PTP活性的的增加或许是造成Ⅱ型糖尿病的一个因素,Ⅱ型糖尿病的典型特征就是胰岛素信号受阻或削弱胰岛素受体的信号传导。PTP1B在胰岛素信号中的负调控作用已被老鼠实验研究证实,可以推测,特异性的PTP1B抑制剂或许能够增加胰岛素的灵敏性,发展成为一种治疗Ⅱ型糖尿病、胰岛素受阻和肥胖症的有效方法。

PTPα抑制剂能够有效抑制肿瘤激酶的活性。Cdc25磷酸酶可以从控制细胞循环的激酶中的酪氨酸和苏氨酸残基上脱去磷酸化,因此在调控细胞循环中起着很重的作用,有证据表明Cdc25A和Cdc25B可能都是致癌基因[6]。抗癌药物就是针对抑制Cdc25磷酸酶的活性发展的。

综上所述,一些人类疾病的致病机理可归因于PTP活性紊乱,其中包括癌症、糖尿病和免疫紊乱等疾病。PTPs在不同的病理生理学上的重要性已经使它们成为研究药物靶点的焦点。因此,PTPs抑制剂也被预测有很好的治疗研究价值。

4 PTP抑制剂发展

酪氨酸磷酸酯(pTyr) 模拟化合物的设计是发现PTPs抑制剂的一条最主要的途径。在早期,pTyr 模拟化合物的设计主要是针对PTPs的催化活性区域,通常用磷酸、乙酸、丙二酸、磺酸和草酸等来取代磷酸酯基,因为所有的PTPs都拥有相同的磷酸化的酪氨酸活性位点,所以设计单一的,选择性的PTPs的抑制剂存在着不小的挑战。幸运的是,PTPs的特异性研究表明,单独的酪氨酸磷酸酯(pTyr)对没有足够的亲和力,与pTyr相连接的残基对PTPs的识别作用很重要。经证明,靠近PTPs活性位点的残基最有可能发展为抑制剂的靶点。这些研究对控制PTP抑制剂的能力和特异性提供了分子基础,也暗示了一种发展有效的特异性强的PTP抑制剂的范例,即发展能同时与活性位点和相邻近的外部位点(有强亲和力的二齿配体),因此独特的与PTP活性位点相临近的部位能够作为靶点增强抑制剂的亲和力和选择性。基于此原理人们已经发展了几种有效的选择性好的PTPs抑制剂,在下文中我们将做讨论。

4.1 无机化合物抑制剂[7]

研究发现,Zn2+、Ni2+和钒酸盐具有抑制PTPs的活性作用,其中钒酸盐的抑制效果最显著,钒酸根在结构上类似于酶的天然底物的磷酸根。最早发现的一类可逆的非特异性PTPs抑制剂是钒酸盐和过氧钒酸盐。其中钒酸盐能竞争性抑制活性位点中的半胧氨酸残基。在矾酸盐与PTP1B复合物的晶体结构中,矾原子与活性位点中的硫醇非常靠近,并与酶形成三角双锥形的过渡态结构,类似于磷酞基转移过程中形成的硫代磷酸盐过渡态。PTPs包含一个具有催化功能的半胱氨酸残基,因此一些碱性试剂和氧化试剂可能成为潜在的PTPs抑制剂。过氧矾酸盐则为一种强氧化试剂,它使活性位点中的半胱氨酸残基氧化成为磺酸,因此它对PTPs的选择性要强于矾酸盐;其它的无机类PTP抑制剂还有一氧化氮和苯胂化氧;这些无机化合物除了可以抑制PTPs外,还有其它的酶抑制活性,正是这种非专一性限制了其作为药物的可能性。

4.2 肽类抑制剂[8]

含有磷酸化酪氨酸残基(pTyr)的肽类底物与PTPs有较高的亲和性,保留pTyr而得到的肽类似物与酶有较高的亲和性,但事实上没有取得预期的结果。因为肽类化合物容易受到体内蛋白酶的降解作用,并且不易通过生物膜,故而肽类化合物一般不是优良的药物先导。正是由于肽类抑制剂代谢快,化学稳定性和生物稳定性差,使得人们寻找一些小分子。

4.3 醌类抑制剂[9]

S W Ham等发现许多PTPs抑制剂具有醌的结构,猜测其机理可能是醌类化合物具有氧化性,可以氧化PTPs活性位点中的半胱氨酸。从而形成了共价结合物,达到抑制酶活性的作用。

4.4 噻二唑烷酮类抑制剂[10]

噻二唑烷酮类是一类直接针对胰岛素抵抗的新药,该类药物通过增加靶器官内的胰岛素敏感性来改善血糖控制。该类化合物是酪氨酸磷酸酯的生物电子等排体。磷酸酯中的两个氧原子与砜基上的氧配适,而磷酸酯中的第3 个氧原子与2 位氮原子重叠。由于1 位砜基和3 位羰基均为吸电子基团,2 位氮上的质子具有弱酸性,可以模拟磷酸酯与催化活性区的碱性氨基酸形成静电作用,增加与酶的亲和力。噻二唑烷酮类抑制剂的开发为pTyr 模拟物设计提供了一条新思路,有望成为高活性、高选择性、药学性质适合的新药物。

4.5 磷酸酯类抑制剂[11]

经研究表明磷酸酯类化合物具有较强的抑制活性,一直作为PTPs 抑制剂设计的重点。在磷酸的α位引入负电性的卤原子后,降低了磷酸根的pKa 值,增强了磷酸与PTPs 催化活性区域的静电作用及氢键相互作用。拥有两个DFMP结构单元抑制剂分别与催化活性区及第二结合位点作用,其活性是单DFMP化合物的450 倍,并且对PTP1B 有一定的选择性。为了构建分子多样性的化合物库,采用平行合成技术,以不同的肽模拟物片段连接两个二氟亚甲基磷酸结构单元,筛选得到的化合物对PTP1B 具有很高的亲和力。

酪氨酸酶抑制剂 篇7

21世纪, 随着科学技术的不断发展, 人类已经战胜了一些以往难以治愈的疾病。但是, 被称为“世纪之魔”的癌症, 已经成为全球范围内的常见病和多发病[1], 其死亡率之高, 使其成为继心脑血管疾病之后的又一类杀手。癌症 (Cancer) , 亦称恶性肿瘤 (malignant neoplasm) , 为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控之外, 还会局部侵入周遭正常组织, 甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。

卫生部《中国卫生统计提要》的数字显示, 2003年以来, 癌症连续在城市居民死因中位居首位, 是严重危害居民健康和生命的疾病。自2006年6月起, 卫生部和科技部联合组织了第三次全国死因回顾抽样调查。20世纪70年代, 我国每年死于癌症的人口约70万。20世纪90年代, 我国每年死于癌症的人口约为117万。21世纪初, 我国每年死于癌症的人口约为150万。如不加以控制, 中国癌症死亡人数在今后20年中就将超过400万, 而癌症患者总数将达660万。

随着癌症在全球范围内的肆虐, 治疗方法也在不断更新, 其中包括外科肿瘤学的治疗、放射肿瘤学的治疗、癌症化疗、癌症的化学预防、大剂量化疗、癌症免疫治疗和综合治疗等。其中, 癌症的治疗方法一直是以外科手术、放射治疗、化学疗法为主的。药物治疗因其治疗范围有限——大部分癌症是无法用药物来治疗的, 只有有限的几种可以使用, 效果没有一线疗法好, 所以一直处于辅助的治疗地位。但是, 从癌症产生的那一天起, 人类就没有放弃过使用药物治愈癌症的希望, 但因为科学传统技术的制约问题, 一直没有长足的进步。随着近代生命科学和合成化学的发展, 出现了一批有代表性的常用抗肿瘤药, 其中包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物来源的抗肿瘤药物等, 多数是现今临床正在被使用的品种。传统的抗癌药也多是细胞毒药物, 不仅对癌细胞有杀伤作用, 而且对正常的人体组织细胞有极大的破坏作用, 产生很大的副作用, 患者生活质量明显下降, 人类对靶向给药的抗癌药有着急切的需求。

酪氨酸激酶抑制剂为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷 (ATP) 与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂, 也可作为酪氨酸的类似物, 阻断酪氨酸激酶的活性, 抑制细胞增殖, 已经开发为数种抗肿瘤药物。

二、文献综述

(一) 酪氨酸激酶抑制剂

现在研究较多的蛋白激酶抑制剂包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶、血管内皮生长因子受体抑制剂等。下面我们以表皮生长因子受体酪氨酸激酶 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 为例进行综述。

EGFR是原癌基因c-erb B1的表达产物, 是表皮生长因子受体 (HER) 的家族成员之一。该家族包括HER1 (erb B1, EGFR) , HER2 (erb B2, NEU) , HER3 (erb B3) 及HER4 (erb B4) 。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。

EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面, EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失、其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常, 均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。

EGFR是上皮生长因子 (EGF) 细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于Erb B受体家族的一种, 该家族包括EGFR (Erb B-1) , HER2/c-neu (Erb B-2) , Her3 (Erb B-3) 和Her 4 (Erb B-4) 。EGFR也被称作HER1, Erb B1, 突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白, 属于酪氨酸激酶型受体, 细胞膜贯通, 分子量170Da。

EGFR位于细胞膜表面, 靠与配体结合来激活, 包括EGF和TGFα。激活后, EGFR由单体转化为二聚体, 尽管也有证据表明, 但激活前存在二聚体。EGFR还可能和Erb B受体家族的其他成员聚合来激活, 例如Erb B2/Her2/neu。

EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路, 包括Y992, Y1045, Y1068, Y1148 and Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化, 包括MPAK, Akt和JNK通路, 诱导细胞增殖, 受体激活对于皮肤的免疫来说很重要。

研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关, 其可能机制有:EGFR的高表达引起下游信号传导的增强;突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化;自分泌环的作用增强;受体下调机制的破坏;异常信号传导通路的激活, 等等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用, 胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关, 一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在, 现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括:具有配体非依赖型受体的细胞持续活化;由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖, 它们的共表达往往预示肿瘤预后不良。例如, 在乳腺浸润性导管癌的研究中发现, TGFα与EGFR共表达, 且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。

此外, 对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究发现EGFR可以通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节而影响肿瘤血管生成。

在配体与表皮生长因子受体 (EGFR) 结合后, 受体发生了二聚作用, 二聚作用既包括两个同种受体分子的结合 (同源性二聚作用) , 又包括人类EGF相关性受体 (HER) 酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合 (异源性二聚作用) 。二聚作用后是酪氨酸残基的自磷酸化作用。这些磷酸化的残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中相互作用刺激ras蛋白, 引起磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白 (MAP) 激酶的激活, 或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3 (PI3K) -Akt和应激活化蛋白激酶 (SAPK) 信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录, 同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。EGFR介导信号通路的特异性和强度取决于激活蛋白的性质和四种EGFR家族成员的水平。与HER2结合的配体不详, 但当HER2和EGFR共表达时, 前者经常与配体激活的后者结合形成二聚体。这种异源性二聚体与EGFR同源性二聚体相比, 往往具有更高的再利用率、稳定性和传导信号的能力。EGFR也能与HER3和HER4发生二聚作用, 其产物具有更高的持久性和更强的PI3K活性。EGFR信号传导通路一旦配体结合的EGFR被内吞入细胞, 信号就将终止, 受体将被降解或再循环到细胞膜表面, 这取决于配体的性质。例如, EGF结合的受体将被降解, 而TGF-α结合的受体则进入再循环。不同的生长因子会影响EGFR信号通路的数量和持续时间。EGFR信号通路有多重的生物学作用。例如, Ras-MAPK信号转导通路刺激细胞的分裂和迁徙。EGFR也是多种受体通路的重要介体, 起到信号会聚点的作用, 能够将信号整合和多样化。例如, 在应激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物 (包括氧化剂、放射线和烷化剂) 的反应中, 反向激活能诱导EGFR酪氨酸激酶的磷酸化并随后发生信号的转导。EGFR家族的成员在正常发育中起了重要的作用, 但在人类肿瘤中经常过度表达并失去控制。

(二) 吲哚衍生物

吲哚环化合物是重要的有机原料和化工产品, 近年来吸引了越来越多的化学家的关注。吲哚环化合物不仅可以合成染料、制备香料, 还可以用作植物生长素、饲料添加剂, 而且可以治疗心血管病、糖尿病及肺癌等多种疾病, 因此它在工业、农业及医药等领域中有着十分广泛的重要用途。随着人们对吲哚环化合物用途认识的深入, 对吲哚环化合物合成方法的研究也越来越多, 现在每年都有不少关于这方面的报道。褪黑素是典型的吲哚生物碱药物。褪黑激素 (Melatonin) 主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素, 化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。

N-乙酰基-5-甲氧基色胺

褪黑激素的生物合成:松果体在光神经的控制下, 由色氨酸转化成5-羟色氨酸, 进一步转化成5-羟色胺, 在N-乙酰基转移酶的作用下, 再转化成N-乙酰基-5-羟色胺, 最后合成褪黑激素, 从而使体内的含量呈昼夜性的节律改变。褪黑素每日分泌量极少, 但在昼夜调节、性成熟、生殖、免疫反应、肿瘤、衰老过程中起着重要的作用。

褪黑素的抗肿瘤作用:Vijayalaxmi等 (1995) 体外研究发现, 褪黑激素对137Cs的γ射线 (150c Gy) 所造成的人体外周淋巴细胞染色体损伤有明显的保护作用, 且呈剂量—效应关系;对自由基产生的物理和化学致突变性和致癌性有拮抗作用。体外试验表明, 褪黑激素对自力霉素C引起的致突变性也有保护作用。褪黑激素能降低化学致癌物 (黄樟素) 诱发的DNA加成物的形成, 防止DNA损伤。

(三) 吲哚药效团在酪氨酸激酶抑制剂中的应用

舒尼替尼是一种经典的酪氨酸激酶受体抑制剂, 其母核中就含有吲哚结构的重要药效团。

舒尼替尼

实验证明, 舒尼替尼能够抑制80多种酪氨酸激酶和多种生长因子受体, 如血小板源性生长因子受体 (platelet derived growth factor receptors, PDGFR) 、血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptors, VEGFR) ﹑I-型集落刺激因子受体 (colony stimulating factor receptor type 1, CSF-1) 、干细胞因子受体 (stem cell factor receptor, KIT) 等。

在酪氨酸激酶的肿瘤表达体系中, 舒尼替尼能够抑制多种酪氨酸激酶的磷酸化过程。通过实验性肿瘤模型证实, 舒尼替尼有抑制肿瘤细胞生长、退化、转移的作用。对于酪氨酸激酶调控失灵的肿瘤细胞, 舒尼替尼能够抑制其生长。

舒尼替尼的靶点, 如VEGF、PDGFR、raf、HIF等很多在肾癌细胞中都是高表达的。Ⅱ和Ⅲ期临床试验表明, 舒尼替尼可使肿瘤稳定, 受益率为70%—75%, 在相当多患者中延长PFS, 控制力、反应率比干扰素治疗显著提高, 生存率提高, 一线治疗有很好效果, 二线治疗效果也很好, 有非常好的应用前景。

舒尼替尼与索拉非尼治疗转移性肾癌都有很好的疗效, 都是抑制血管生成和细胞增殖, 靶位可能有所不同。

(四) 酪氨酸激酶抑制剂——贝雷文尼

随着分子生物学技术的发展和提高, 和从细胞受体及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步了解和认识, 人类开始了以关键基因、细胞受体和调控分子为靶点的治疗方法的研究, 称其为“靶向治疗”。贝雷文尼正是在这样的趋势下, 研究和发展起来的新一代靶向抗癌药物。

贝雷文尼Brivanib alaninate

贝雷文尼一种分子靶向新药, 是由百时美施贵宝公司 (BMS) 开发的。它通过抑制血管生成和诱导细胞凋亡起到抗肿瘤作用。前期临床研究表明贝雷文尼对肝细胞癌有较好的抗肿瘤效果。

贝雷文尼是一种选择性血管内皮生长因子 (VEGFR) 酪氨酸激酶抑制剂, 该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶, 能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化, 在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数属于致癌RNA病毒的癌基因产物, 也可由脊椎动物的原癌基因产生。

酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷 (ATP) 与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂, 也可作为酪氨酸的类似物, 阻断酪氨酸激酶的活性, 抑制细胞增殖, 已经开发为数种抗肿瘤药物。

贝雷文尼对索拉非尼和沙利度胺治疗失败的患者有效且耐受性良好。研究还发现血清Ⅳ型胶原下降与较长的PFS、OS相关, 可能是贝雷文尼治疗有效的一个生物标志物。

贝雷文尼与索拉非尼“头对头”比较一线治疗晚期HCC和贝雷文尼对照安慰剂治疗索拉非尼治疗失败或不能耐受的肝癌的两项Ⅲ期国际研究刚开展。贝雷文尼有望成为肝癌分子靶向治疗另一个可供选择的药物。

三、目标化合物设计

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 氯化苄, 四氢呋喃, 室温, 12小时; (3) 钯碳, 氯化铵, 四氢呋喃, 甲醇, 室温, 12小时。

路线一是本小组设计的第一条路线, 因为其在实验过程中收率较低, 产物在反应环境中不稳定, 故最后放弃。

旧路线从表面上看来比新路线步骤少而且操作简单, 但实验证明在氢气钯碳环境下吲哚产物不稳定, 最后一步关环反应产率很低, 所以在综合考虑已有文献和前期实验结果后, 我们最终确定了一条四步的新反应路线 (路线二) 。

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 碳酸钾, 甲醇, 回流, 2小时; (3) 吡啶盐酸盐, 180度, 5小时; (4) 保险粉, 室温, 19小时。

四、化学合成

(一) 合成路线

合成路线与条件: (1) 乙酰乙酸乙酯, 钠氢, 浓硫酸, 室温, 12小时; (2) 碳酸钾, 甲醇, 回流, 2小时; (3) 吡啶盐酸盐, 180度, 5小时; (4) 保险粉, 室温, 19小时。

(二) 实验讨论

在反应步骤a中要注意原料加入的顺序, 应当先加入乙酰乙酸乙酯和氢化钠拔氢, 再加入原料三氟硝基苯。同时, 在此步中要控制反应系统的温度不能过高。

在反应步骤b中要注意加入碳酸钾的作用是中和生成的HF, 使反应不断向右进行, 使反应产率变高。同时要注意加热的温度, 使甲醇充分回流。

在反应步骤c中要注意吡啶盐酸盐的脱甲基作用, 可用软硬酸碱理论解释。同时注意此步的后处理过程较为困难繁琐, 可用优化萃取的方式, 获得较高的产率。

在反应步骤d中要注意加入保险粉时需分批加入, 防止强还原性的低亚硫酸钠和水大量放热, 此处可用用冰水浴控温。

五、实验操作

MS用HP1100LC/MSD质谱仪测定。薄层层析 (TLC) 板采用硅胶GF254 (烟台江民硅胶开发有限公司生产) 与浓度为0.8%的CMC-Na蒸馏水溶液搅拌均匀后铺板, 经100-110℃活化一小时后放置于干燥器内保存备用, 于紫外灯下 (波长254nm) 显色;柱层析采用200-300目硅胶 (烟台江民硅胶开发有限公司生产) , 干法装柱。试剂均为市售化学纯或分析纯产品, 除特别说明外, 不经处理直接使用。

(一) 2-丙酮基-3, 4-二氟硝基苯2-acetone and 3, 4-fluorine nitrobenzene

将钠氢 (10.1g) 混溶 (混悬) 于四氢呋喃 (480m L) 中, 加入2L的四颈瓶, 室温搅拌, 随后缓慢滴加乙酰乙酸乙酯 (47g, 0.36mol, 至反应液, 内温上升至27℃后下降, 此时置于冰水浴中降温, 温度维持在22℃左右。溶液变为淡黄色澄清溶液。滴加三氟硝基苯 (32g, 0.18mol, 约105滴/分钟) , 撤去冰浴, 恢复室温, 溶液呈现澄清酒红色, 内温22℃, 继续搅拌3小时, 内温在20℃至22℃之间波动。反应结束后加氯化铵溶液调节p H值至4, 溶液的红色逐渐变淡直至消失。反应液用乙酸乙酯萃取三次, 有机层用饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 滤液浓缩得油状物66.3g, 随后加入浓硫酸50m L和乙酸62m L, 70℃下反应过夜。反应结束后, 加水稀释反应液, 用乙酸乙酯萃取三次, 有机层用饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 滤液浓缩得油状物, 快速硅胶柱层析得红色油状物Briva-1共27.2g, 收率70.24%。

(二) 2-丙酮基-3-氟-4-甲氧基硝基苯2-acetone-3-fluorine-4-hydroxy nitrobenzene

将Briva-1 (5g, 23.24mmol) , K2CO3 (2.73g, 19.75mmol) 溶于甲醇溶液 (3m L) , 加热至70℃。回流速度大约40滴/分钟, 溶液深红色。2小时后回流变慢, 约10滴/分钟, 点板观察发现未完全反应完, 将外温上调至73℃。共反应5小时, 将反应液用乙酸乙酯水萃取, 取乙酸乙酯层旋蒸, 得棕黄色固体3.6g。收率72.67%。

(三) 2-丙酮基-3-氟-4-羟基硝基苯2-acetone-3-fluorine-4-oxhydryl nitrobenzene

将Briva-2 (3g, 13.2mmol) 和吡啶盐酸盐 (6.1g, 52.82mmol) 放入三颈瓶中, 180℃加热, 固体融化为黑色液体。5小时后, 溶液用乙酸乙酯和水萃取, 取乙酸乙酯层旋干得棕黑色固体1.81g。用洗脱剂 (石油醚:乙酸乙酯=6:1) 柱层析得黄色的纯品1.50g, 收率56.86%。

(四) 2-甲基-4-氟-5-羟基-吲哚2-methyl-4-fluorine-5-hydroxyl-indoles

取Briva-3 (1.524g, 7.15mmol) 和水 (33.48ml) 加入50ml三颈瓶, 黄色固体不溶, 室温搅拌。分配加入Na2S2O4 (保险粉6.9g, 39.6mmol) , 温度逐渐上升至36℃, 冰浴降温至17℃, 溶液内有黄色絮状物, 20min内保险粉加完, 溶液逐渐由黄色变为乳白色, 内温8℃。反应过夜 (19h) 。溶液最终呈乳黄色, 乙酸乙酯和水萃取, 最终得固体 (1.054g) 。产率89.25%。

参考文献

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酪氨酸酶抑制剂 篇8

慢性髓细胞白血病 (CML) 是一种造血干细胞疾病, 其特征是带有9号和22号染色体易位的造血干细胞克隆性扩增, 这种染色体易位称为费城染色体 (Ph) 。t (9;22) 导致BCR-ABL融合基因的产生, 该融合基因产生融合蛋白p210BCR-ABL。p210BCR-ABL使细胞从良性向恶性转化。酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 是有效的、特异的BCR-ABL抑制剂, 现在已经是CML的首选治疗措施, 笔者依据2010 NCCN指南详细阐述了TKI在治疗CML中的应用。现总结如下。

1 CML的酪氨酸激酶抑制剂

1.1 甲磺酸伊马替尼

甲磺酸伊马替尼 (前称STI571) 是一种有效的、特异的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂。2001年5月伊马替尼首先获得FDA (美国食品和药品监督管理局) 的批准, 用于CML进展期的治疗。2002年12月根据IRIS研究结果, FDA批准伊马替尼用于CML患者的一线治疗。IRIS试验的长期随访结果已经获得中位随访期为60个月。接受伊马替尼治疗的患者12个月时累计完全细胞遗传学缓解率 (CCyR) 为69%, 60个月时为87%。只有7%患者进展到CML加速期或者急变期。以伊马替尼为初始治疗的患者60个月的总生存率为89%。证实伊马替尼在大部分患者中可获得很高持久缓解率。但是, 因为在研究1年内从α干扰素组进入伊马替尼组的交叉入组率很高占90%, IRIS试验无法证明伊马替尼相对于干扰素的生存获益。但是, 在历史对照研究中, 伊马替尼相对于干扰素有显著的生存获益。统计显示, 7年无事件生存率 (EFS) 、疾病无进展率 (FFP, 未发生向加速期或急变期的转化) 和总生存率分别为81%、93%和86%。而主要细胞遗传学缓解率 (MCyR) 和CCyR分别为89%和82%。对于持续起效的患者, 5～6年的主要分子学缓解率 (MMR) 为85%～90%。

1.2 达沙替尼

达沙替尼 (前称BMS-354825) 是一种口服的ABL激酶抑制剂, 与伊马替尼相似, 但是有更多的优势, 它可以同时结合ABL激酶区活化和非活化的构像。体外实验显示, 达沙替尼几乎对所有耐伊马替尼的BCR-ABL突变都有效。在Ⅰ期剂量递增研究中, 达沙替尼可以诱导对伊马替尼不耐受或者耐药的CML患者或者Ph阳性急性淋巴细胞白血病 (ALL) 患者产生血液学和细胞遗传学缓解。这一结果促使几项达沙替尼Ⅱ期研究[Src/abl 酪氨酸激酶抑制活性:达沙替尼研究实验 (START) ]在伊马替尼耐药或者不耐受Ph阳性白血病患者中开展。伊马替尼耐药定义为3～6个月内未达完全血液学缓解, 或者12个月时未达主要细胞遗传学缓解或在缓解后疾病进展。达沙替尼用量为70mg, 每天2次, 持续治疗。START-A研究评价了达沙替尼治疗伊马替尼耐药或不耐受的CML加速期患者的安全性和疗效, 报道了最初107例患者的结果, 在随访8个月时, 64%的患者达到了主要血液学缓解 (MaHR) , 33%达到MCyR, 76%患者维持疾病无进展状态。全部患者随访证实了达沙替尼治疗伊马替尼耐药或者不耐受的CML加速期患者的安全性和疗效。12个月的无进展生存率和总生存率分别是66%和82%。在最近的剂量最优化随机研究中, 对于伊马替尼耐药或不耐受的慢性期CML患者, 达沙替尼100mg, 每天1次的疗效和70mg, 每天2次相同, 而胸腔积液、血小板减少和与毒性相关的停药的发生率更低。3年的随访数据证实对慢性期患者来说, 100mg每天1次相对于70mg每天2次来说是更有效的剂量。第36个月时, 无进展生存期率 (PFS) 和整体生存率 (OS) 分别是73%和87%。第6、12 和24个月的CCyR分别是39%、45%和50%。FDA批准将达沙替尼100mg, 每天1次, 作为慢性期CML患者的起始剂量。对于加速期或者急变期患者, 推荐起始剂量为140mg, 每天1次。

1.3 尼洛替尼

尼洛替尼 (前称AMN107) 是一种新型的、高选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂, 作用强于伊马替尼。Ⅰ期研究发现, 尼洛替尼对伊马替尼耐药的CML有效, 并且具有良好的安全性。在这个研究之后, 一项Ⅱ期开放性研究评估了尼洛替尼在伊马替尼耐药或者不耐受的慢性期和加速期患者中的安全性和疗效。尼洛替尼用量为400mg 每天2次。慢性期的疗效终点是MCyR, 加速期的疗效终点是MaHR。最近报道了对280例慢性期患者随访6个月的中期分析结果。48%的患者观察到MCyR, 31%的患者观察到CCyR。长期随访结果证实其长期安全性无变化。在19个月的随访中, CHR 和 MCyR 分别为94%和59%。达到的MCyR中位时间为2.8个月。并发现其疗效持久, 在24个月时, 78%患者能维持MCyR。随访24个月的OS为88%, 18个月的PFS为67%。在加速期患者中, 47%的患者观察到血液学缓解, 29%患者观察到MCyR。119例患者随访12个月后的OS为79%。长期随访结果证实了尼洛替尼在治疗伊马替尼耐药或者不能耐受的患者时, 可以更快速起效并能获得更持久的缓解。中位治疗时间为272d。并观察到56%患者MaHR, 31%患者达到完全缓解 (CHR) 。第1次血液学缓解中位时间为1个月, 24个月的随访中有54%患者达到持续血液学缓解。MCyR和CCyR分别为32%和20%。24个月的OS为67%。2007年10月FDA批准尼洛替尼 (400mg 每天2次) 用于既往伊马替尼耐药或者不耐受的成人Ph染色体阳性CML慢性期和加速期的治疗。现在FDA尚未批准尼洛替尼用于急变期的患者。

2 TKI治疗相关毒性

2.1 心脏毒性

据报道, 长期伊马替尼治疗可以引起充血性心力衰竭 (CHF) 和心脏毒性。但是, 根据M.D.Anderson癌症中心接受伊马替尼治疗的176例患者的最新分析显示, 这种不良反应非常罕见, 笔者认为, CHF发生率和普通人群的发生率相近。对于既往有心脏病史的患者建议给予积极治疗。

2.2 遗传学毒性

动物实验中发现伊马替尼具有致畸性和胚胎毒性, 但是有资料证实怀孕的患者服用伊马替尼不影响正常妊娠。Pye等最近报道了在妊娠期接受伊马替尼治疗的180例患者的妊娠结果。已知妊娠结果的患者中有50%正常, 10%有胎儿异常。自然流产导致妊娠终止18例。在最近报道的10例因妊娠而中止伊马替尼治疗的患者中, 6例患者Ph阳性中期分裂相增多。在重新开始治疗18个月后, 只有3例患者获得CCyR。

2.3 其他

在动物实验中发现伊马替尼对精子有一定损伤。并且有些孤立病例显示, 患者因为接受伊马替尼治疗而出现了少精症。达沙替尼已经被证实有动物胚胎毒性。但在人类方面, 伊马替尼对受孕和妊娠期的影响还不清楚。尼洛替尼也具有动物致畸性和胚胎毒性。现在还无妊娠期妇女服用尼洛替尼的资料。

3伊马替尼的耐药

3.1 原发耐药

在Ph染色体阳性的慢性期CML患者中, 原发伊马替尼耐药非常罕见 (3～6个月治疗未达到血液学缓解) , 其中有15%～25%患者有原发性细胞遗传学耐药 (6个月内未达到任何水平的细胞遗传学缓解, 12个月内未达到MCyR, 18个月内未达到CCyR) 。有资料显示, 血药浓度不够可能是伊马替尼原发耐药的一个主要原因。多药耐药基因 (MDR1) 可以降低伊马替尼在细胞内的聚集, 这可能导致伊马替尼的原发耐药的另一重要因素。有机阳离子转运蛋白 (OCT-1) 是影响伊马替尼细胞内摄入的另一主要因素。White等人发现, 使用伊马替尼效果不佳的患者都发现了OCT-1活性水平低, 并发现OCT-1活性水平高的患者可以达到很好的分子学水平的缓解而且与剂量无关, 而OCT-1活性水平低的患者要获得缓解就必须使用大剂量的依马替尼。另一方面, 达沙替尼和尼洛替尼似乎与OCT-1的表达水平无关。

3.2 继发性耐药

继发性耐药的主要机制包括ABL激酶区基因的点突变、BCR-ABL基因扩增及其表达增加、其他的蛋白酪氨酸激酶 (如Src、Hck、Lyn) 及其调控通路的激活等。在BCR-ABL激酶区基因点突变中, T315I突变表现出对伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼的高耐药性。还有报道指出, T315I突变和疾病进展和低生存期密切相关。ATP磷酸结合环的突变也与低生存期相关。另有研究发现Ph阴性患者在使用伊马替尼过程中, 出现了细胞遗传学克隆异常, 但还不清楚到底有哪些染色体异常参与其中, 但是最常见的染色体异常为+8。

3.3 耐药的对策