关键词：
激活蛋白（精选六篇）
激活蛋白 篇1
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验在四川省烟草公司宜宾市公司试验基地进行,试验田块土地平整,肥力均匀,排灌方便,pH值5.62。
1.2 供试材料
激活蛋白,由河南省恒隆态生物工程股份有限公司提供。
1.3 试验设计
试验设5个处理。即处理1:只在苗床烟苗移栽前7 d左右使用,即按照1∶800倍的浓度稀释激活蛋白后液体喷雾,喷于苗床;处理2:在烟苗移栽前7 d左右和移栽期都使用激活蛋白,即在处理1的基础上,移栽成活后10 d,采用稀释(1∶800)后的激活蛋白喷施在烟叶上;处理3:在烟苗移栽前7 d左右、移栽期和团棵期都使用激活蛋白,即在处理2的基础上,于团棵期采用稀释(1∶800)后的激活蛋白喷施烟叶;空白对照(CK1):喷施相应量的清水。常规对照(CK2):宁南霉素药剂防治。3次重复,随机区组设计,4行区,四周设保护行。行株距126 cm×53 cm,每小区种烟80株,共栽烟1 200株。
1.4 田间栽培管理措施
试验区内各项农艺措施均严格遵照宜宾市优质烟叶生产技术管理方案进行,大田管理措施及时一致,同一管理在同一天内完成。
1.5 观察记载项目与方法
1.5.1 病情调查。
在烟草花叶病发病盛期调查各处理发病情况,按照《烟草病虫害分级及调查方法》[8]最新标准(9级分级法)调查发病株数、病情级别,计算发病率、病情指数及防治效果。计算公式如下:
1.5.2 农艺性状调查。
在封顶期选择每个重复每个小区5株有代表性烟株测量株高、有效叶片数、最大叶长和叶宽、茎围、节距等。
1.5.3 烟叶经济性状测定。
不同试验处理烤后原烟单独存放,按国家42级分级标准分级和当地烟叶各等级收购价格计产、计质,分别计算各试验处理的产量、产值、均价、上等烟比例、上中等烟比例等。
1.5.4 烟叶品质测定。
各处理各取初烤烟叶X2F、C3F、B2F1 kg,进行烟叶常规化学成分测定,采用王瑞新[9]《烟草化学》测定方法进行。
1.5.5 数据分析方法。
数据采用SPSS10.0[10]进行科学统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理对烟株主要农艺性状的影响
从表1可以看出,在烟株封顶期,各处理烟株主要农艺性状(包括株高、有效叶片、茎围、节距、最大叶长、最大叶宽等)均基本遵循处理3>处理2>处理1>CK2>CK1的规律性。差异显著性结果表明,打顶株高,处理1、2、3分别与CK1,处理3与CK2达极显著差异;有效叶数,处理3与CK1达极显著差异,处理3与CK2达显著差异;茎围,处理2、3分别与CK1、CK2达极显著差异;节距,处理1与CK2达显著差异;最大叶长,处理2、3分别与CK1、CK2达极显著差异,处理1分别与CK1、CK2达显著差异;最大叶宽,处理1与CK2达显著差异,处理2、3分别与CK1、CK2达极显著差异。
注:表中小、大写字母分别表示0.05、0.01水平上差异显著性。
2.2 不同处理对烟叶花叶病病情的影响
从表2可以看出,各处理烟雾叶花叶病发病率为2.7%～3.5%,病情指数为1.21～1.44。与CK2比较,防治效果达-16.13%～2.42%;与CK1比较,防治效果达42.86%～51.98%,处理3防治效果稍优于CK2。
2.3 不同处理对烟叶经济性状的影响
从表3可以看出,产量比较,处理1、2、3分别比CK1增加0.93%、1.44%、3.02%,分别比CK2减少1.40%、0.91%,增加0.63%;均价比较,处理1、2、3分别比CK1增加1.91%、1.91%、3.18%,分别比CK2减少0.62%、0.62%,增加0.62%;产值比较,处理1、2、3分别比CK1增加2.86%、3.38%、6.30%,分别比CK2减少2.02%、1.53%,增加1.26%。上等烟比例比较,处理1、2、3分别比CK1增加0.9、1.0、1.9个百分点,分别比CK2减少0.4、0.3个百分点,增加0.6个百分点;上中等烟比例比较,处理1、2、3分别比CK1增加0.8、1.1、3.2个百分点,分别比CK2减少1.7、1.4个百分点,增加0.7个百分点。
2.4 不同处理对烟叶常规化学成分的影响
从表4可以看出,水溶性总糖含量比较,处理1、2、3分别比CK1降低1.80、1.80、4.67个百分点,分别比CK2降低0.66、0.66、3.53个百分点;还原糖含量比较,处理1、2、3分别比CK1降低1.13、1.03、3.53个百分点,分别比CK2降低0.2、0.1、2.6个百分点;淀粉含量比较,处理1、2、3分别比CK1降低0.17、0.29、1.6个百分点,分别比CK2增加0.91、0.79个百分点,降低0.52个百分点;总植物碱含量比较,处理1、2、3分别比CK1降低0.16、0.07、0.19个百分点,分别比CK2增加0.34、0.57、0.31个百分点;总氮含量比较,处理1、2、3分别比CK1增加0.11、0.12、0.28个百分点,分别比CK2增加0.13、0.14、0.30个百分点;氧化钾含量比较,处理1、2、3分别比CK1增加0.41、0.46、0.52个百分点,分别比CK2增加0.16、0.21、0.27个百分点。
(%)
3 结论与讨论
(1)该试验研究结果表明,烟株农艺性状表现以施用激活蛋白处理较优,其中以苗床期、移栽期和团棵期3个时期都喷施激活蛋白的效果最好。分析认为,这可能与激活蛋白的作用有关,激活蛋白添加了天然生物氨基酸、植物生长促进因子,提高了土壤肥料利用率,促进了烟株的生长发育。
(2)该试验研究结果表明,烟草花叶病防治效果以苗床期、移栽期和团棵期3个时期都喷施激活蛋白的处理稍优于常规对照,与空白对照比较,防治效果达42.86%～51.98%。分析认为,这可能与激活蛋白的作用有关,喷施的激活蛋白通过诱导植物体内抗病基因的表达,激发植物对病毒性病害的抵抗能力,同时通过促进植物的新陈代谢,增强烟草预防花叶病能力。
(3)该试验研究结果表明,初烤烟叶各经济性状以苗床期、移栽期和团棵期3个时期都喷施激活蛋白的处理稍优于常规对照,分析认为,这可能与激活蛋白的作用有关,喷施的激活蛋白能促进烟株的形态建成,增强烟株花叶病抗性,从而提高了烟叶各经济性状。
(4)该试验研究结果表明,初烤烟叶化学成分各处理与对照比较,水溶性总糖、还原糖、淀粉含量降低,总植物碱、总氮、氧化钾含量升高,符合优质烤烟化学质量指标,各成分间更加协调,具有明显改善烟叶品质的作用,并且以苗床期、移栽期和团棵期3个时期都喷施激活蛋白的处理为最优。
(5)激活蛋白是利用生物技术从微生物中分离提取的一种新型结构蛋白[11,12]。已有研究表明[13,14],激活蛋白能调节植物的新陈代谢,启动植物体内的一系列代谢反应,激活植物自身的免疫系统和生长系统,同时通过诱导和激活植物体内的抗病基因而增强抗病能力,从而增加农作物抵抗病虫侵害和不良环境的能力。该文研究结论与前人研究结论基本一致,同时得出了激活蛋白在烟草上的应用方法。
(6)减轻烟草危害、降低化学农药“3R”(Residue,Resistance,Resurgence)问题是现代烟草农业可持续发展的必由之路。因此,研发既能控制病害发生又能避免化学农药过量应用对人、畜及环境产生负面效果的新型生物制剂,是国际上农药研发的一个新的方向,具有广阔的应用前景。
摘要：为探索防治烟草花叶病和提高烟叶产质量新方法,以激活蛋白为材料,开展生物制剂在烤烟生产上的应用研究。结果表明:在烤烟不同生育期喷施激活蛋白能有效促进烟株生长,抑制烟叶花叶病发生,提高烟叶经济性状和改善烟叶品质。其中以苗床期、移栽期和团棵期3个时期都喷施激活蛋白的处理效果最优。
激活蛋白 篇2
PCR 扩增小鼠朊蛋白(prp23-231)基因,克隆入诱饵载体pSos,将重组质粒与对照质粒共转化酵母菌cdc25H,成功地构建了小鼠朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体PSos-prp23-231,并证实该段基因表达的.蛋白对酵母菌cdc25H既无毒性,也没有自激活作用.
作 者：徐静 万家余 高宏伟 XU Jing WAN Jia-yu GAO Hong-wei 作者单位：徐静,XU Jing(吉林大学,畜牧兽医学院,吉林,长春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062)
万家余,高宏伟,WAN Jia-yu,GAO Hong-wei(军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062)
激活蛋白 篇3
1 材料与方法
1.1 方法
1.1.1 实验动物
新生7日龄Wistar大鼠, 雌雄不限, 体重 (14±1) g, 120只。由山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 模型制备
将120只Wistar大鼠随机分为A组 (假手术组) 、B组 (缺氧缺血组) 、C组 (激活素A治疗组) 。每组根据处死时间不同又分为5个亚组:6 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组。HIBD模型制备:A组给予麻醉后切开颈部皮肤, 不结扎左侧颈总动脉;B组和C组麻醉后切开颈部皮肤, 结扎左侧颈总动脉并置于缺氧仓中 (含8%氧气和92%氮气) 2 h, 控制氧浓度在 (8±0.5) %, 舱温为 (37±1) ℃。
1.1.3 治疗 ACT A由美国Peprotech INC提供。
C组于缺血缺氧后即刻腹腔注射ACT A (0.005 μg/mL) 1 mL, 其他各组均腹腔注射生理盐水1 mL。
1.2 标本采集及监测
1.2.1 标本采集
各组于缺氧缺血结束后不同时间点断头取脑, 每次8只, 肉眼观察比较各组脑组织淤血、水肿, 以及萎缩情况, 然后取左侧脑组织做病理学检查, 免疫组化测巢蛋白变化 (nestin兔抗鼠多克隆抗体及SP系列试剂盒均购自北京博奥森公司) 。
1.2.2 组织固定切片及病理观察
脑组织经4%多聚甲醛溶液固定24 h后以视交叉和其后4 mm处石蜡包埋 (包括完整的海马) , 冠状连续切片, 行相关检测。
1.2.3 HE染色
常规石蜡切片, 二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水;中性树胶封片, 显微镜下观察。
1.2.4 免疫组化测巢蛋白 (nestin)
切片常规脱蜡至水, 3%H2O2室温孵育15 min;枸橼酸缓冲液中抗原修复2 min;滴加封闭用正常山羊血清工作液, 室温中孵育20 min;滴加一抗nestin (1∶300) , 湿盒置于4℃冰箱中过夜, PBS液洗2 min, 3次;滴加生物素化二抗, 室温下孵育15 min, PBS液洗2 min, 3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (S-A/HRP) , 室温下孵育15 min, PBS液洗2 min, 3次;用DAB显色剂显色, 自来水终止;苏木素复染, 脱水, 透明, 中性树胶封片。
1.3 图像分析及数据分析
1.3.1 图像采集及分析
采用BI-2000医学图像分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 进行图像采集与分析。nestin免疫反应产物均用阳性细胞平均灰度值表示。平均灰度值越高, 阳性表达越弱, 而平均灰度值越低, 阳性表达越强。
1.3.2 统计学处理
数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 HE染色
假手术组脑组织结构层次清晰, 细胞排列整齐, 形态正常, 高倍镜下, 神经元核大而圆。HIBD组6 h～12 h左侧脑组织皮层细胞肿胀, 神经元排列紊乱, 细胞间隙增大, 海马区神经细胞稀疏, 72 h病灶周围神经细胞坏死增多, 胶质细胞明显增多, 炎性细胞增多, 7 d后病变主要集中在皮层和海马, 部分坏死区域小胶质细胞呈灶性和多灶性增生。14 d神经元大量消失, 皮层、海马形成胶质瘢痕。激活素A治疗组各时间点损伤程度较HIBD组明显减轻, 神经细胞存活数量多, 细胞排列尚规则, 少量神经细胞变性坏死, 多数神经细胞形态正常。
2.2 免疫组化染色观察
光镜观察发现, nestin阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积, 阳性细胞表达于大脑皮层和海马, 阳性着色主要位于胞质和突起。阴性对照片中未见nestin免疫反应产物。假手术组中nestin表达弱, HIBD组表达较之假手术组增加明显, 24 h表达增高, 3 d明显增加, 7 d达高峰, 14 d表达下降, 各时间点表达与假手术组比较差异有统计学意义 (P<0.01) ;激活素A治疗组较HIBD组各时间点表达增高 (P<0.01) 。
3 讨 论
NSC 是具有多种分化潜能的细胞, 脑损伤后NSC 可被激活并分化为不同的神经细胞移行到相应部位进行神经重建, 在脑损伤的修复中发挥重要作用。巢蛋白的表达始于神经胚形成, 随神经元的分化完成而停止表达, 因此巢蛋白可作为NSC的标志物[3,4]。生理状态下, 动物脑内的NSC 处于静息态, 当某些刺激发生时, 在细胞因子作用下, 静息态NSC被激活, 在损伤原位出现或异位增生后, 在趋化因子的作用下向损伤部位迁移并分化成功能细胞[5], 中枢神经系统损伤后机体可利用内源性NSC补充再生新的神经元细胞以修复损伤[6]。骆健明等[7]研究表明, 缺血缺氧性损伤激活并促使HIE大鼠皮质内源性神经干细胞增多, 增多的nestin阳性细胞可能是脑的自我修复的物质基础, 从而使损伤后的部分神经功能得以改善。
激活素 (activin, ACT) 是一种糖蛋白激素, 属于转化生长因 (transforming growth factor, TGF) β超家族成员, 具有促进垂体前体腺细胞分泌促性腺激素, 诱导中胚层发育以及抑制活化巨噬细胞分泌NO等作用。体外实验表明[1], ACT 在离体情况下具有神经保护作用和抗炎活性, 可以促进培养的中枢神经系统神经元存活及保护培养细胞不受神经毒损伤, 且有助于间质细胞修复。激活素作为影响神经细胞生存的因子, 具有维持神经细胞生存等神经保护作用[8]。 国外最新研究证实, ACT还参与神经元发育;外源性ACT可阻止亨廷顿舞蹈病纹状体神经元的变性。阐明ACT在这些过程中的作用, 不仅能够加深对神经损伤修复机制的理解, 而且为治疗开辟了新的思路。
激活素是一种调节组织细胞功能的基本介质, 参与全身多种组织细胞生长调节, 维持其正常功能。尤其是激活素A, 对机体多种组织细胞均有作用。ACTA可促进新生大鼠HIBD 后脑组织的修复, 推测其可能的机制有:①ACT可抑制急性期反应蛋白的分泌, 有助于防止机体因反应过度而造成损害[9];②ACT具有抗炎活性, 可有效抑制脑缺血再灌注后脑组织局部的过度炎症反应;③HIBD早期主要是细胞毒性脑水肿, 由于能量代谢衰竭, 钠、钾-ATP 酶对钠离子的转运发生障碍而形成细胞水肿[10];ACT可减轻细胞毒性脑水肿, 且不加重血管源性脑水肿;④ACT具有抗氧化作用, 可抑制HIBD后神经元和毛细血管内自由基聚集;⑤HIBD后, 神经元上谷氨酸和其他活性氨基酸受体兴奋, ACT通过稳定细胞内钙离子浓度[11], 可拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性;⑥激活素可使内源性FGF表达增加, 启动机体自我修复机制, 抑制细胞凋亡。
实验表明, 应用外源性激活素A对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用, 并上调nestin标记的NSCs细胞, 使其保持一个较高的水平, 并促进其分化进而起到神经再生和功能修复的作用, 其机制还有待于进一步探索。
摘要：目的探讨激活素A对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD) 脑组织巢蛋白的表达变化。方法将7日龄Wistar大鼠120只随机分为3组, 假手术组、缺氧缺血性脑损伤 (HIBD) 模型组和激活素A治疗组, 每组各40只。每组根据处死的时间不同又分为5个亚组:6h组、24h组、3d组、7d组、14d组, 每亚组各8只。HE染色观察神经细胞形态变化, 采用免疫组化的方法测定巢蛋白的表达。结果HIBD组缺氧缺血侧大脑组织巢蛋白活性逐渐增高, 3d显著增高, 7d达高蜂, 然后逐渐下降, 14d仍有少量表达;与HIBD模型组各时间点相比, 激活素A治疗组各时间点脑组织巢蛋白表达明显增高 (P<0.01) 。结论激活素A治疗增高缺氧缺血后巢蛋白的表达, 对缺氧缺血性脑损伤有保护作用。
激活蛋白 篇4
极细链格孢激活蛋白是从交链孢菌 (Alternaria) 中筛选、分离、纯化出的一类新型蛋白, 主要通过激活植物体内分子免疫系统, 提高植物自身免疫力;通过激发植物体内的一系列代谢调控, 促进植物根、茎、叶生长和提高叶绿素含量, 提高作物产量, 对多种植物病害有较高的防效。为了筛选出高效、安全的烟草病毒病防治药剂, 笔者于2011—2012年连续2年田间试验研究了7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂对烟草病毒病的防治效果和使用剂量, 旨在为有效防治烟草病毒病提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验安排在湖南省花垣县排料乡桃花村历年烟草花叶病重发地进行, 土壤p H值7.2, 有机质含量2.1%左右, 田间土壤肥力均匀一致。
1.2 试验材料
供试药剂:7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂 (浙江龙游东方阿纳萨克作物科技有限公司) 、10%宁南霉素可溶性粉剂 (黑龙江强尔生化技术开发有限公司) 、5%井冈霉素可溶性粉剂 (武汉科诺生物科技股份有限公司) 。供试烟草品种:云烟87, 种植密度为1.65万株/hm2, 按当地优质烟叶生产技术进行规范操作。
1.3 试验设计
试验共设7个处理, 分别为7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂1 200倍液 (A) 、1 000倍液 (B) 、800倍液 (C) 、600倍液 (D) , 10%宁南霉素可溶性粉剂105 g/hm2 (E) , 5%井冈霉素可溶性粉剂420 g/hm2 (F) , 以空白作对照 (CK) 。4次重复, 随机区组排列, 每个小区栽烟50株, 面积为30 m2。
1.4 施药方法
按照使用剂量称取适量供试药剂, 先加少量水调匀, 然后按药液量900 kg/hm2稀释并混合搅拌均匀, 把配制好的药液装入工农—16型背负式喷雾器, 施药时要细雾均匀喷施, 以叶片两面沾满药液但不下滴为宜。移栽后15 d烟草病毒病发生前施第1次药, 10 d后第2次施药, 间隔10 d后第3次施药, 共施药3次。
1.5 调查内容与方法
分别于第2次施药前和第3次施药后15 d进行2次调查。调查方法按照中华人民共和国烟草行业标准《烟草病害分级及调查方法 (YC/T 39-1996) 》的规定, 采用5点取样法, 每个小区随机调查5个点, 每个点调查5株烟草, 记录发病情况, 计算病情指数和防治效果, 数据结果采用DPS6.5软件中的邓肯氏新复极差 (DMRT) 法进行统计分析。
烟草病毒病的分级标准 (以株为单位) :0级, 全株无病;1级, 心叶脉明或轻微花叶, 病株无明显矮化;3级, 1/3叶片花叶但不变形, 或病株矮化为正常株高的3/4以上;5级, 1/3~1/2叶片花叶, 或少数叶片变形, 或主脉变黑, 或病株矮化为正常株高的2/3~3/4;7级, 1/2~2/3叶片花叶, 或变形或主侧脉坏死, 或病株矮化为正常株高的1/2~2/3;9级, 全株叶片花叶, 严重变形或坏死, 或病株矮化为正常株高的1/2以上。病情指数和防治效果计算公式如下:
2 结果与分析
由表1可知, 以处理D对烟草病毒病的防治效果最好, 2011年和2012年的防效分别为71.69%和72.37%;其次是处理C, 2011年和2012年的防治效果分别为64.43%和65.27%;处理B与处理E的防治效果相当, 烟草病毒病的防治效果最差。
3 结论与讨论
由于病毒是非细胞生物, 扩散、传播方式特殊, 与寄主的寄生关系及繁殖 (复制) 方式复杂, 使得烟草病毒病的研究和防治还不能达到预期的理想效果。
该试验结果表明, 7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂600倍液 (有效成分116.67 mg/kg) 和800倍液 (有效成分87.5 mg/kg) 对烟草病毒病有较好的防治效果, 防效在60%以上。建议在烟草病毒病发病前或发病初期连续施药2~3次, 每次间隔期10 d左右为宜, 即烟草移栽15 d左右施第1次药, 间隔10 d后再次施药1~2次。
摘要：连续2年对7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂不同用量、10%宁南霉素可溶性粉剂和5%井冈霉素可溶性粉剂防治烟草病毒病进行了田间药效试验, 结果表明:7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂600800倍液对烟草病毒病有较好的防治效果, 防效在60%以上。
关键词：烟草病毒病,防效,7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂
参考文献
[1]周建国, 肖启明, 刘双清, 等.烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学, 2013, 41 (1) :121-122, 138.
[2]王凤龙.烟草病毒病综合防治技术[J].烟草科技, 2002 (4) :43-45.
[3]童雪霞.烟草病毒病的发生与防治措施探讨[J].现代农业科技, 2009 (22) :160-161.
激活蛋白 篇5
关键词：脑出血,电针,百会,蛋白酶激活受体-1,血脑屏障
头针(scalp acupuncture,SA)是指利用毫针去穿刺刺激头皮的特定区域,是在传统针灸理论的基础上,结合现代解剖学、神经生理学和全息生物学发展起来的[1]。有相关系统评价表明,SA可以有效改善急性脑出血病人的神经功能缺损症状[2]。其中,百会穴是督脉上最重要的穴位之一,它位于人头顶的最高点,所有的阳经汇集于此。最新磁共振3D重建技术显示,百会穴位于额叶中央前沟前部[3]。针灸百会穴能提神醒脑,滋阴补阳,补肾固涩,祛除内风,促进复苏。因此,针灸百会穴特别适用于治疗脑中风等神经系统疾病,且已有研究表明,百会穴(GV20)是SA治疗急性脑出血非常关键的穴位[4]。
蛋白酶激活受体(protease activated receptors,PARs),是一种经典的七次跨膜G蛋白偶联受体,有7个疏水的螺旋状跨膜区域,从而形成3个胞外环状结构和3个胞内环状结构。目前已知的PARs有四种:PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4[5]。其中PAR-1、PAR-2、PAR-3由凝血酶激活,PAR-2由胰蛋白酶或胰岛素样蛋白酶激活。其中PAR-1主要分布在神经系统中,以神经元、星型胶质细胞为主[6]。PAR-1被作为第一信号分子凝血酶激活后,启动胞内信号转导发挥作用。有脑出血后早期脑水肿可能是凝血酶激活PAR-1引起神经的轴突、树突和胶质细胞的突起回缩,造成细胞损伤; 后期脑水肿主要是由于凝血酶通过激活PAR-1使毛细血管内皮细胞发生收缩,细胞间隙增大,紧密连接开放导致血脑屏障(BBB)破坏,BBB通透性明显增高可使脑水肿明显加重[7]。因此,本研究旨在探讨电针百会透曲鬓穴治疗急性期脑出血大鼠的疗效及对PAR-1表达的影响,以期为针灸治疗脑出血提供实验依据。
1 材料与方法
1.1实验动物
成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠108只,体重250 g~300 g。采用完全随机的方法分为3组:假手术组、模型组、电针组。除假手术组外,每组依据不同时间点分为4个亚组,即6 h、1 d、3 d、7 d组,每个亚组取12只大鼠。
1.2脑出血模型的制备
参照Rosenberg方法[8],将大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上,头顶剪毛,常规消毒,正中切口,骨膜剥离器剥离骨膜,暴露前囟及冠状缝,以前囱为坐标原点,向右旁开2.9 mm,向后0.2 mm确定注射点坐标,用牙科钻在颅骨表面钻直径为0.8 mm的圆孔,穿透颅骨但不伤及脑组织,用固定在立体定向仪上的5μL微量注射器(针头直径0.7 mm)沿钻孔进针垂直插入脑组织6 mm,到达尾状核位置,10 min缓慢匀速注入含0.6 U/μL Ⅶ型胶原酶的生理盐水(nor-mal saline,NS)3μL,留针10 min,然后缓慢出针,用骨蜡封闭颅骨上的钻孔,缝合切口。假手术组:不注射胶原酶,其余操作同模型组。
1.3电针治疗方法
参照华兴帮等制定的《实验动物穴位图谱》,定位“百会”和“曲鬓”穴。将大鼠固定于实验架上,在百会穴位处常规消毒,选用30号2.5 cm不锈钢毫针,快速刺入皮下并斜向右下方达曲鬓穴,针刺方法参照《常用动物动物腧穴图谱》标准。将一块生理盐水湿润的纱布绑在大鼠尾巴根部,另一根毫针插在此纱布中。将G6805-2型电针治疗仪正极接百会穴毫针,负极接大鼠尾巴毫针,连续波,频率2 Hz,强度0.2mA,留针30 min。电针治疗组于造模后6 h开始治疗,每天进行电针治疗1次。模型组只是固定于实验架上30 min,不进行任何治疗。假手术组不进行任何电针处理。
1.4神经功能缺损评分
各组大鼠造模术后,待大鼠清醒,分别于术后6 h、1 d、3 d、7 d采用Longa五级评分法[9],进行神经功能缺损评分。术后6 h评分为1分~3分的视为成功模型。具体评分如下,0分:无神经功能缺损症状;1分:提尾时病灶对侧前肢不能完全伸展,为轻度缺损症状;2分:行走时向病灶对侧转圈,为中度缺损症状;3分:行走时向病灶对侧跌倒,为重度缺损症状;4分:无自发性活动,伴意识障碍。
1.5 伊文思蓝(evans blue,EB)测定血脑屏障通透性
在各个时间点处死的前90 min,进行腹腔麻醉大鼠,经股静脉注射2% EB生理盐水溶液(4 mL/kg),注射成功后可见大鼠眼睛及四肢迅速变蓝,90 min后开胸,分离心包膜,从左心室插管,插管成功后用动脉夹固定,进行生理盐水快速灌注,剪破右心耳,直到右心耳流出清亮的液体后停止灌注,每只模型需200 mL~250 mL生理盐水。迅速断头取脑,将脑组织分成左右两半,称重后分别放入3 mL的甲酰胺溶液中,60 ℃恒温水浴箱中放置24 h,脑组织显现为无色透明状,各管甲酰胺溶液为深浅不同蓝色,取出脑组织后5 000r/min离心甲酰胺溶液2 0 min,取上清液再1 0 0 0 0r/min离心10 min,取上清液用多功能酶标仪在632nm波长测甲酰胺中EB的OD值,用纯甲酰胺溶液作对照组。计算脑组织中EB含量公式:脑组织中EB含量(μg/g脑湿重)=标准品EB含量(μg/mL)×甲酰胺量(mL)÷脑湿重(g),其中标准品EB含量(μg/mL)用标准曲线直线回归方程求出。
1.6 PAR-1检测
1.6.1免疫组化
各组大鼠在出血后不同时间点给予水合氯醛深度麻醉,迅速打开胸腔,经左心室灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS 0.01 mol/L,pH7.4)50 mL冲洗血管,继之以200 mL磷酸缓冲液(PBS 0.01 mol/L,pH7.4)配制的含4% 多聚甲醛固定液灌注固定脑组织,断头取脑,置于中性甲醛溶液中固定。标本经脱水,石蜡包埋,在切片机上连续切片,片厚3μm,作免疫组化染色。按试剂公司推荐三步法操作。为确保实验结果的真实性和客观性,染色结果判定由专人单盲阅片。PBS代替一抗作空白对照,用已知阳性标本作阳性对照。在用OlympusCH2 型显微镜(10×20 倍)下,随机取每张脑片6 个不重叠视野,计数PAR-1 阳性细胞数。
1.6.2荧光实时定量PCR
采用Trizol一步法从血肿周围脑组织中提取总RNA,行琼脂糖凝胶电泳检测,用紫外分光光度仪检测RNA纯度。然后取4μL总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20μL体系,42 ℃ 15 min,95 ℃ 2 min反转录成cDNA,随后进行实时荧光定量RCR反应,大鼠PAR-1 引物序列:上游引物5′-CTCAGCCTGTGCGGTCCT-3′,下游引物5′-AAGTAGACTGCCCTGCCCTC-3,扩增片段206 bp;以大鼠β-actin基因为内参照,引物序列为:上游:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游5′-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′,扩增片段206 bp。实时荧光定量PCR产物利用公司自带的系统软件分析,可观察扩增曲线,并对cDNA的含量进行定量分析,计算样本的△△Ct值。
1.7统计学处理
计量资料以均数±标准差( ±s)表示,两组间均值的两两比较采用SNK法,多组间均值比较方差齐时进行单因素方差分析,方差不齐时采用秩和检验(Keuskal-Wallis法等)。
2 结果
2.1大鼠神经功能缺损评分
模型组大鼠神经功能缺损评分6 h即开始升高,1 d达到高峰,随后开始降低,在术后7 d仍高于正常水平。电针治疗组大鼠神经功能缺损评分与模型组呈相同的变化趋势,1 d神经功能缺损评分最高,随后开始降低,7 d稍高于正常水平。模型组与电针治疗组大鼠在脑出血后6 h、1 d、3d、7d比较,差异有统计学意义(P <0.0 5)。详见表1。
分
2.2脑出血后大鼠血脑屏障通透性
假手术组、电针治疗组与模型组大鼠相比,术侧脑组织EB含量在脑出血后6 h、1 d、3 d、7 d时间点差异均有统计学意义(P <0.05);电针治疗组与假手术组EB含量在脑出血后6 h、1 d时间点比较有统计学意义(P <0.05)。详见表2。
μg/g
2.3免疫组化检测PAR-1的表达
PAR-1蛋白的表达阳性细胞染色主要在胞膜、胞浆,可清楚分辨胞核的形态。 正常大鼠大脑PAR-1 蛋白表达轻度阳性,模型组6 h时PAR-1表达强度开始增强,24 h时PAR-1表达进一步增加,3 d时表达亦较为强烈,然后开始下降,7 d时明显下降,向假手术组水平靠近。在6 h、24 h、3 d及7 d各时间点,模型组和电针组的PAR-1阳性细胞数与假手术组比较差异均有统计学意义(P <0.05),电针治疗组与假手术组的PAR-1阳性细胞数比较差异有统计学意义(P <0.05)。详见表3。
2.4荧光实时定量PCR测定PAR-1mRNA的表达变化
PAR-1模型组在6 h表达开始上升,1 d时进一步表达增加,3 d仍处于较高水平随后又下降,7 d时仍高于正常水平。模型组与假手术组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P <0.05),电针治疗组与模型组比较在各时间点比较差异有统计学意义(P <0.05)。详见表4。
3 讨论
1990年,Rosenberg等[8]第一次采用注入胶原酶方法在SD大鼠身上成功制成脑出血动物模型。胶原酶是一组可以特异降解基底膜和间质胶原成分的金属基质蛋白酶,分Ⅰ型~Ⅷ型,最常使用来制备脑出血动物模型的是Ⅳ型及Ⅶ型胶原酶。RoSenberg模型,利用脑立体定位仪,9 min内向大鼠尾状核内注入2μL含有0.01~0.1单位Ⅺ型或Ⅶ型胶原酶的生理盐水,注射10 min即可观察到脑出血及水肿的形成。此方法制造的模型很好地模拟了自发性脑实质内出血的发生和血肿的扩大,以及脑水肿的形成[10]。本实验研究中采用胶原酶诱导法制造脑出血大鼠模型,利用脑立体定位仪向模型大鼠脑尾壳核注入Ⅶ型胶原酶。大鼠脑内最大的核团是尾壳核,立体定位非常容易,尾壳核最容易发生自发性脑出血,因此选用尾壳核定位。术后的大鼠都出现了不同程度的神经功能缺损症状,证明动物模型成功。大鼠脑出血模型制作成功后,会出现病灶对侧肢体不同程度偏瘫、无力等神经功能缺损症状。本实验采用经典的Zea Longa五分制评分方法[9],结果显示:模型组在脑出血后6 h神经功能缺损评分即开始升高,在1 d达到高峰,随后开始下降。电针治疗组与模型组相比差异有统计学意义,说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能改善神经功能缺损症状,有明显的治疗效果。
BBB存在于脑组织与血液之间,是由无窗孔的毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞的足突和基底膜组成的复合体,结构复杂。生理情况下,BBB对水分子高度通透,使脑脊液以自由扩散方式与脑、脊髓进行持续交换,维持中枢神经系统内环境稳定和大脑功能的正常行使。伊文思蓝是一种偶氮基荧光染料,作为常用的BBB的示踪剂,分子量为960.81,可以结合血清蛋白,形成蛋白质复合物,在血脑屏障破坏时或通透性增加时,通过间隙渗入到组织。有研究报道[11],在组织间隙中EB的量与BBB通透性成正比,即BBB破坏越严重组织间隙中EB的量越多。因此,目前已有不少实验研究采用测量脑组织EB含量的方法来了解脑出血后BBB通透性改变的情况,且研究表明,脑组织EB含量在脑出血后明显升高,并在脑出血后1 d达到高峰期[12,13,14]。本课题用多功能酶标仪测脑组织中所含EB的OD值,从而算出EB的含量。实验结果显示,脑出血后6 h脑组织EB含量即明显升高,并在脑出血后1d达到高峰期。电针治疗组与模型组相比在各个时间点差异均有统计学意义,说明电针百会透曲鬓穴在脑出血急性期能降低BBB通透性,减轻BBB损伤。
激活蛋白 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象
成年SD大鼠,雄性,体重180~200 g,购自成都达硕动物有限公司;实验动物使用许可证号:SCXKC川22008-23。
1.1.2 主要实验试剂
链脲佐菌素(Streptozotoxin,STZ),总RNA提取试剂TRIzol(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒Reverse Transcription System(成都博瑞克生物公司),小鼠抗人Actin单抗(美国Santa Cruz公司),兔抗人KCNMA1(BKCAα)多抗,批号:Lot#A1455,兔抗人KCNMB1(β1)(英国Abcam公司),荧光定量PCR试剂(日本Takara公司),批号:Lot No.1131801,膜蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物研究所),聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物研究所),Taq酶PCR试剂(北京TIANGEN生物公司),批号:K9104琼脂糖(美国进口分装公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物研究所),蛋白预染Marker(美国Fermentas公司),增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)发光液(美国millipore公司)批号:Lot No.1131801。
1.1.3 主要实验仪器
BIORAD电泳仪、电转仪(美国BIORAD生物公司),ABI实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),血糖监测仪,ND-100核酸蛋白检测仪(美国Nanodrop公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立[4]
将大鼠随机分成对照组10只、模型组40只,模型组大鼠喂养高糖高脂饲料(10%猪油、2.5%胆固醇、20%蔗糖、1%胆酸盐和66.5%的普通饲料)4周,腹腔注射STZ(25 mg/kg)1次,1周后以空腹血糖≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖≥11.0 mmol/L且伴有胰岛素敏感性降低者(P<0.05)为成模指标,筛选出成模鼠20只继续高脂高糖饲养至12周,对照组大鼠普通饲料喂养12周,腹腔注射同体积柠檬酸缓冲液。
1.2.2 标本的采集
于8周、12周对照组、模型组大鼠分批腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉,开腹取肠系膜动脉,分离血管周围的结缔组织及脂肪,然后放入RNA保存液,-80℃冰箱保存。
1.2.3 免疫印迹法测定α和β1亚基蛋白表达量
取大鼠肠系膜动脉,RIPA法冰上匀浆、消化,12 000r/min离心1 min,收集上清液,BCA法蛋白定量。等量的蛋白(15 L)经SDSPAGE电泳分离后,电转印到硝酸纤维素膜上,用含50 g/L脱脂奶粉的三乙醇胺缓冲盐水溶液室温封闭1 h。然后分别用兔抗大鼠Kca1.1抗体、兔抗大鼠sol-1抗体、兔抗大鼠β-actin抗体4℃孵育过夜。过氧化物酶标记抗兔二抗,室温孵育1 h。ECL试剂盒化学荧光显像。以β-actin为内参,计算蛋白的相对表达量。
1.2.4 实时定量PCR测定α和β1亚单位m RNA的表达
取出冷冻保存于-80℃冰箱中大鼠肠系膜动脉,Trizol法提取总RNA,逆转录成c DNA,然后用SYB Rgreen法进行PCR反应,GAPDH为内参照。实时定量PCR扩增仪检测。扩增参数:95℃预变性10 s;95℃变性5 s、60℃退火15 s、72℃拉伸15 s,进45个循环。以GAPDH为参照基因,计算模型组与对照组的相对基因拷贝数。相对基因拷贝数用2-△△ct表达。采用软件Beacon Designer 7.0设计α和β1亚单位的PCR引物,保证相关引物的GC含量40%~60%,Tm值在55~65℃,且引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列以及正反向引物间尽量避免出现互补序列。见表1。
1.3 统计学方法
采用SPSS l9.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 T2DM大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹血胰岛素测定结果
腹腔注射STZ8周、12周测定空腹血糖、餐后2 h血糖、血胰岛素,与对照组比较明显升高,血胰岛素敏感指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.2 T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα、β1亚基蛋白的表达
免疫印迹结果,在8周和12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα蛋白相对表达量分别为(1.093±0.251)和(0.921±0.153),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为1.172和1.633,查t界值表P>0.1,与对照组比较差异无统计学意义;β1亚基蛋白相对表达量分别为(0.334±0.200)和(0.193±0.310),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为10.530和8.232,查t界值表P<0.01,与对照组比较差异有统计学意义。见图1~4。
2.3 T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα、β1亚基m RNA在血管中的表达
实时定量PCR结果显示,在8、12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα亚基m RNA的表达分别为(1.15±0.13)和(0.92±0.14),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为1.9464和1.807,查t界值表P>0.05,与对照组比较差异无统计学意义;β1亚单位m RNA的表达分别为(0.47±0.10)和(0.37±0.12),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为16.772,16.623,查t界值表P<0.01,与对照组比较差异有统计学意义,见图5~6。
3 讨论
糖尿病是心脑血管疾病的独立危险因素,其血管病变主要累及心、脑和外周血管,导致动脉粥样硬化、高血压等疾病,糖尿病患者发生相关血管意外事件的风险是非糖尿病人群的2~4倍[5],可见2型糖尿病是一种以血管病变为主要致死致残病因的疾病。
血管平滑肌BKCa由孔道形成蛋白α亚基和辅助蛋白β亚基组成,现已鉴别的β亚基有β1-β4个家族成员,其中β1亚基主要分布于动脉平滑肌中。生理条件下,BKCa持续激活可以使细胞膜超极化,抑制电压依赖性钙离子通道的活性,从而导致钙内流减少,对抗平滑肌收缩,阻断BKCa可以使平滑肌收缩。所以BKCa通道是调控血管紧张度的主要离子通道,其通道活性的改变将影响血管的舒缩功能,血管的舒缩异常与通道功能缺陷有关。近年来有关糖尿病与BKCa通道的相关性研究已受到关注[6]。
WANG等[7]发现,T2DM大鼠脑血管平滑肌BKCa活性降低,与其β1亚基的表达下调有关。本研究主要运用免疫印迹法和实时定量PCR技术力图从分子水平阐明T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道是否存在异常,实时定量PCR结果表明β1亚基m RNA在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中表达明显降低,而α亚基m RNA表达无明显变化;免疫印迹结果显示,在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道的β1亚基蛋白表这两种实验技术所得到的结果是一致,即在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道β1亚基发生基因和蛋白水平的明显下调(P<0.05),而α亚基在基因和蛋白水平无明显变化(P>0.05)。这提示作为血管平滑肌细胞舒缩功能的重要调节因素,BKCa通道的功能与β1亚基密切相关,β1亚基的低表达可能是导致T2DM血管并发症的一个重要基础。
总之,随着对糖尿病及其离子通道功能异常认识的深入,人们可能对糖尿病血管病变的机制有更新的认识,这将为预防糖尿病的心血管并发症提供新的策略和方法,为糖尿病的综合治疗提供新的靶点,为特异性针对此环节的药物研发提供实验依据。
参考文献
[1]叶春玲,袁振宇,沈兵.糖尿病小鼠胸主动脉环对血管收缩剂和内皮依赖性舒张剂反应的变化[J].中国病理生理杂志,2005,21(4):788-792.
[2]李尚俭,艾文婷,梁磊,等.胰岛素抵抗对大鼠血管平滑肌细胞BKCa功能的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2011,32(2):145-150.
[3]张敏敏.2型糖尿病大鼠血管反应性与血管平滑肌上BKCa的相关性研究[D].四川:泸州医学院,2011.
[4]陈嘉,张永斌,桑传兰,等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立及相关指标的测定[J].动物医学进展,2012,6:91-95.
[5]中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中国医学前沿杂志:电子版,2015,3:26-89.
[6]吴宾,陶凌,易甫.糖尿病对冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的影响[J].国际心血管病杂志,2015,4:245-247.
