再生体系（精选十篇）
再生体系 篇1
作为三大能耗用户之一的建筑, 在其全寿命周期内的节能、降耗、减排任务十分艰巨, 加快转变传统建筑粗放式的发展模式, 已经成为建筑领域亟待解决的重大问题。为此, 住房和城乡建设部发布了一系列相关政策法规, 强制性建筑能耗指标调整到65%, 节能建筑、绿色建筑、低碳建筑、可再生能源建筑等新型建筑概念纷纷提出。可再生能源在建筑领域的应用, 成为转变建筑发展方式的重要方向。
一、文件的范畴
可再生能源政策文件的范畴涉及文件级别、发布机构、文件性质、文件概念和文件内容等 (见表1) 。
1. 文件级别:指中共中央文件、人大常委会文件、国务院文件和地方政府文件。
(1) 中共中央文件 例如《高举中国特色社会主义伟大旗帜, 为夺取全面建设小康社会新胜利而奋斗》 (中国共产党第十七次全国代表大会报告) 、《中共中央关于在全党开展深入学习实践科学发展观活动的意见》 (中发[2008]14号) 、《胡锦涛在全党深入学习实践科学发展观活动总结大会上的讲话》等。
(2) 人大常委会文件 例如《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》等。
(3) 国务院文件 例如《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《节能减排综合性工作方案》、《民用建筑节能条例》等。
(4) 地方政府文件 例如《北京市加快太阳能开发利用促进产业发展指导意见》、《天津市建筑节能管理规定》、《河北省节约能源条例》、《山西省节能专项资金管理办法》、《呼和浩特市光伏产业发展规划纲要 (2010—2020年) 》、《辽宁省人民政府关于加快发展新兴产业的意见》、《吉林省节能减排综合性工作方案》、《黑龙江省农村可再生能源开发利用条例》、《关于促进上海新能源产业发展的若干规定》、《关于加强太阳能光电建筑应用示范项目管理的通知》等。
2. 发布机构指发展改革委、城乡住房建设部、财政部、科技部、能源委和电监会等。
(1) 发展改革委 例如《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》等。
(2) 城乡住房建设部 例如《民用建筑节能管理规定》、《关于加快推进太阳能光电建筑应用的实施意见》、《可再生能源建筑应用城市示范实施方案》、《加快推进农村地区可再生能源建筑应用的实施方案》等。
(3) 财政部 例如《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》、《可再生能源建筑应用专项资金管理暂行办法》、《太阳能光电建筑应用财政补助资金管理暂行办法》等。
(4) 科技部 例如《金太阳示范工程财政补助资金管理暂行办法》、《绿色建筑技术导则》等。
(5) 能源局 例如《关于做好金太阳示范工程实施工作的通知》等。
(6) 电监会 例如《电力业务许可证管理规定》、《电网企业全额收购可再生能源电量监管办法》等。
3. 文件性质指文件的法律性质, 包括法律、法规和部门规章。
(1) 法律 例如《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》等。
(2) 法规 例如《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《电力体制改革方案》、《电价改革方案》等。
(3) 规章 例如《上网电价管理暂行办法》、《可再生能源发电有关管理规定》、《民用建筑节能管理规定》、《北京市加快太阳能开发利用促进产业发展指导意见》、《天津市建筑节能管理规定》、《四川光伏产业发展建设规划》等。
4. 文件概念指文件说明的对象的概念, 包括节约能源和可再生能源。
(1) 节约能源 例如《中华人民共和国节约能源法》、《节能减排综合性工作方案》、《民用建筑节能条例》、《建设部建筑节能“十五”计划纲要》、《民用建筑节能管理规定》、《北京市“十一五”时期建筑节能发展规划》、《河北省节约能源条例》、《上海市节能减排工作实施方案》等。
(2) 可再生能源 例如《中华人民共和国可再生能源法》、《可再生能源产业发展指导目录》、《可再生能源发电有关管理规定》、《可再生能源建筑应用示范项目评审办法》、《太阳能光电建筑应用财政补助资金管理暂行办法》、《关于做好金太阳示范工程实施工作的通知》、《关于促进上海新能源产业发展的若干规定》、《江苏省新能源产业调整和振兴规划纲要》等。
5. 文件内容指文件涉及的相关内容, 包括发展规划、上网电价、财政补贴、税收优惠和贷款支持。
(1) 发展规划 例如《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》、《北京市“十一五”时期能源发展及节能规划》、《呼和浩特市光伏产业发展规划纲要》、《青海省太阳能产业发展及推广应用规划》等。
(2) 上网电价 例如《电价改革方案》、《上网电价管理暂行办法》、《可再生能源电价附加收入调配暂行办法》、《电网企业全额收购可再生能源电量监管办法》等。
(3) 财政补贴 例如《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》、《可再生能源建筑应用专项资金管理暂行办法》、《太阳能光电建筑应用财政补助资金管理暂行办法》、《金太阳示范工程财政补助资金管理暂行办法》、《山西省节能专项资金管理办法》、《上海市可再生能源和新能源发展专项资金扶持办法》等。
(4) 税收优惠 例如《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》、《节能减排综合性工作方案》、《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》等。
(5) 贷款支持 例如《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》、《节能减排综合性工作方案》、《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》等。
二、文件的从属关系
可再生能源政策文件内容概念之间的从属关系, 涉及科学发展观、可持续发展战略、三种经济形态、两个能源概念、太阳能利用、光伏建筑等 (表2) 。
1.科学发展观 是中国共产党的指导思想之一, 在政策体系中具有统领作用。文件包括《高举中国特色社会主义伟大旗帜为夺取全面建设小康社会新胜利而奋斗》 (中国共产党第十七次全国代表大会报告) 、《中共中央关于在全党开展深入学习实践科学发展观活动的意见》 (中发[2008]14号) 、《胡锦涛在全党深入学习实践科学发展观活动总结大会上的讲话》等。
2.可持续发展战略 在科学发展观的指导下, 各级政府部门制定的发展规划。文件包括《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》、《北京市“十一五”时期能源发展及节能规划》、《呼和浩特市光伏产业发展规划纲要》、《青海省太阳能产业发展及推广应用规划》等。
3.三种经济形态 是继农业文明、工业文明之后的新型经济形态, 包括低碳经济、循环经济和绿色经济。文件包括《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》、《中华人民共和国循环经济促进法》等。
4.两个能源概念 节约能源和可再生能源是三种经济形态的核心问题。文件包括《中华人民共和国节约能源法》、《中华人民共和国可再生能源法》等。
5.太阳能利用 是可再生能源的重要组成部分。文件包括《中华人民共和国可再生能源法》、《可再生能源产业发展指导目录》、《可再生能源中长期发展规划》、《可再生能源发展“十一五”规划》等。
6.光伏建筑 是太阳能发电在建筑领域的应用。文件包括《太阳能光电建筑应用财政补助资金管理暂行办法》、《关于加快推进太阳能光电建筑应用的实施意见》、《太阳能光电建筑应用示范项目申报指南》等。
三、政策体系的构成
通过对此类政策文件所涉及的要素范畴的分析, 以及对此类政策文件统领与从属关系、内容之间的相关关系的分析, 把此类文件确定为可再生能源政策文件, 能够更好地反映此类文件的内容实质, 能够更准确地把握转变经济发展方式的方向。通过此种分析, 把可再生能源政策文件的作用和内容作为体系分类的依据, 可以比较清晰地理解文件, 可以更加准确地运用文件。
枣不定芽再生体系的研究 篇2
枣不定芽再生体系的研究
以枣优良品种骏枣为试材,研究了多种因素对其离体叶片及大田幼嫩茎段再生效率的影响.结果表明,幼嫩茎段再生较容易.叶片再生与生长调节物质种类和浓度及叶片成熟度有关.枣叶片不定芽再生的最佳培养基为1/2MS(大量元素减半)+TDZ0.5mg/L+IBA0.2m/L.不定芽再生率以上部叶片最高.
作 者：王国平李晓梅 陈秋芳 Wang Guoping Li Xiaomei Chen Qiufang 作者单位：山西省农业科学院果树研究所,太谷,030815 刊 名：中国农学通报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN 年，卷(期)：2006 22(4) 分类号：Q94 关键词：枣 再生体系 不定芽萝卜离体再生体系的建立 篇3
关键词：萝卜；愈伤组织；不定芽；不定根；激素
中图分类号：S631.104+.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0021-03
萝卜（Raphanus sativus L.）又名莱菔，是十字花科萝卜属的二年生草本植物。作为一种以肉质根为主要食用部位的蔬菜作物，萝卜深受广大群众喜爱，在我国南北各地普遍栽培。随着生活水平的提高，人们对萝卜品质的要求也日益增长，这就对尽快育成优质抗病的萝卜新品种提出了迫切要求。建立高效的离体再生体系是亲本无性快繁和基因工程育种的基础环节，然而萝卜一直以来被认为是一种再生顽拗型植物，再生难度大、广泛适应性不强。本试验选用不同基因型萝卜为材料，从培育无菌苗到诱导愈伤组织、不定芽、不定根，再到最后炼苗移栽，拟建立起完整的具有广泛适应性的萝卜离体再生体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿萝卜8个萝卜品种。
1.2 试验方法
1.2.1 无菌苗培育 将萝卜种子于超净工作台上用75%酒精处理30s，再用4%次氯酸钠溶液灭菌3min，最后用蒸馏水冲洗3遍，接种于1/2MS培养基上，室温25℃、光照时间16h·d-1条件下培养，得到无菌苗。
1.2.2 愈伤组织和不定芽的诱导 取生长3～5d的无菌苗，切取子叶，留叶柄并将生长点去除干净，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d-1条件下培养15～20d，统计愈伤组织和不定芽的诱导率。通过记录每种培养基内萝卜带柄子叶的再生情况，确定适宜的愈伤组织和不定芽诱导激素配比和诱导天数。
1.2.3 不定根的诱导 取诱导出的不定芽，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d-1条件下培养15～20d，统计不定根诱导率。通过记录每种培养基内不定芽的生根情况，确定适宜的不定根诱导激素配比和诱导天数。
1.2.4 炼苗移栽 将不定根诱导成功的再生植株培养瓶的盖子揭开，注意适当保湿，使再生苗的生长环境接近于田间，进行炼苗培养。2～3d后将再生苗移栽于营养钵中，于炼苗室内缓苗培养15d左右，再移栽到大田中。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导培养基的筛选
以MS培养基+30g·L-1蔗糖+0.7%琼脂+不同配比激素，在pH5.7左右诱导萝卜带柄子叶再生愈伤组织效果明显，8个萝卜品种分别经由2，4-D、IBA和NAA配合6-BA均能诱导出愈伤，其中，2，4-D配合6-BA诱导愈伤组织的效果最佳（表1）。
虽然8个萝卜品种的带柄子叶均诱导形成了愈伤组织，但是愈伤进一步分化形成不定芽却极其困难。在各种激素的诱导下，愈伤组织极易先生根，却难以诱导出芽，仅喜诺晓青和翠绿萝卜在NAA配合6-BA诱导培养基中不仅再生出了愈伤组织，还再生出了不定芽，但诱导率却很低。
2.2 不定芽诱导培养基的进一步筛选
以喜诺晓青和翠绿萝卜为试材，进一步细化NAA和6-BA激素配比进行不定芽的诱导。发现随激素浓度的增加，萝卜不定芽诱导率有先增加后降低的趋势（表2）。6-BA和NAA浓度比值为100时，不定芽的诱导率较高，比值过高或过低会导致不定芽的诱导率下降。综合比较，5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定芽较适宜。翠绿的不定芽诱导率明显高于喜诺晓青，说明翠绿的基因型易再生培养。
2.3 不定根诱导培养基的筛选
在诱导不定芽的基础上，进一步试验不同浓度6-BA与NAA配比对喜诺晓青和翠绿萝卜不定根再生的影响，发现不定根的诱导与NAA浓度密切相关，NAA浓度过低时无法生成不定根，而NAA浓度过高时，生根率也会降低。总体来看，以5mg·L-16-BA+0.10mg·L-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定根比较适宜（表3）。翠绿比喜诺晓青更易于再生出不定根，说明易于诱导出不定芽的基因型也同样适宜进一步诱导不定根，萝卜的再生频率高低和其基因型密切相关。
3 结论与讨论
植物组织培养过程中，不定芽有通过外植体直接诱导出芽和经愈伤组织诱导出芽两种途径，2，4-D、IBA和NAA配合6-BA诱导愈伤组织、再经愈伤组织诱导出芽在番茄、黄瓜等蔬菜作物中均有报道。关于萝卜的离体培养，仅有诱导出愈伤组织和直接诱导出不定芽的报道，并没有从愈伤组织再诱导出芽的报道，所以，萝卜离体再生诱导的关键是直接诱导不定芽的分化和增殖。
本试验选用潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿共8份试验材料，多数材料仅能再生出愈伤组织，难以进一步分化再生出不定芽，其中仅有喜诺晓青和翠绿萝卜诱导出了不定芽并进而形成不定根。说明萝卜的再生能力较弱，其再生能力在不同基因型间差异十分显著。
外植体的选择也是影响萝卜再生诱导效果的关键因素之一。本试验初期选用了下胚轴、子叶、子叶横切、子叶纵切和带柄子叶这几种外植体材料，其中再生效果最差的是下胚轴，效果最好的是带柄子叶，所以后期试验都采用带柄子叶作为外植体。本研究发现萝卜带柄子叶离体培养的再生方式相对特殊，在不定芽诱导过程中先是子叶叶柄基部膨大产生少量愈伤组织后再生成大量不定芽，若外植体接种后产生大量愈伤组织就不能有效产生不定芽，说明诱导愈伤组织的多少对不定芽再生有重要影响，这可能与其再生顽拗有所关联，关于产生愈伤组织的多少对于有效诱导不定芽的影响机制有待进一步深入研究。
生菜组织培养再生体系的建立 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为“四季耐热抗抽薹”生菜,种子购买于昆明市小板桥种子市场。
1.2 实验方法
1.2.1 生菜无菌苗的培养
分别采用3种消毒方法比较消毒效果:第1种方法75%的酒精表面消毒30 s,无菌水冲洗2次,再用0.1%升汞消毒8 min,无菌水冲洗4~6次。第2种方法2%次氯酸钠消毒15 min,无菌水冲洗3~4次;第3种方法10%过氧化氢消毒10 min,无菌水冲洗3~4次。
将消过毒的种子在无菌条件下接种到MS固体培养基中,放入4~5℃冰箱中催种24 h,再放入温度为25℃,每日光照16 h,光照强度为2000 lx的培养室中培养。1~2 d后种子萌发,观察3种消毒方法的消毒效果,待真叶长出后10 d,取无菌真叶作为外植体进行诱导培养。
1.2.2 不同激素浓度组合对生菜真叶诱导效果
以MS培养基为基本培养基,附加30 g/L的蔗糖,6.5 g/L琼脂粉,设6-BA质量浓度梯度为0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L,NAA质量浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L,共20个处理组合。真叶切成约0.5 cm×0.5 cm大小,接种到上述不同培养基中,每次处理接种10个外植体,设3次重复,放入25℃光照培养箱中培养,3周后统计不同处理愈伤组织的再生率及芽的质量,1个月后统计分化出芽的数量,按公式计算出愈率和出芽率:出愈率(%)=产生愈伤组织块数/外植体总数(30块);出芽率(%)=出芽块数/外植体总数(30块)。
1.2.3 生根培养
当叶片外植体分化的芽长到1~2 cm时,切下不定芽,转移到生根培养基中。生根培养以1/2 MS培养基为基本培养基,添加的NAA质量浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方式的消毒效果
分别采用3种消毒方式对生菜种子消毒,种子萌发1~2 d后观察效果,结果见表1。以75%酒精消毒30 s,无菌水冲洗2次,再用0.1%升汞消毒8min,无菌水冲洗4~6次效果最好。
2.2 不同激素浓度组合对生菜真叶再生率的影响
以MS培养基为基本培养基,附加不同浓度的6-BA和NAA,每个处理均接种3瓶,每瓶接种真叶外植体10片,培养3周后统计芽的再生情况。
结果表明,“四季耐热抗抽薹”生菜最佳分化培养基为MS+0.15 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,“四季耐热抗抽薹”生菜培养中,NAA浓度为0.2mg/L时,芽分化率明显高于NAA浓度为0.5 mg/L时的,说明NAA浓度适中能够促进愈伤组织分化成芽。不同生长素和细胞分裂素配比组合中,虽然各处理之间出愈率和出芽率在5%水平上差异不显著,但观察实验数据可知,0.15 mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA对生菜芽分化有利,即处理12的芽的分化率最高,每块愈伤组织上成芽的数目也最多。
2.3 生根培养
设计浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L的NAA,添加到1/2 MS培养基进行生根培养,不同NAA条件下均能生根,以NAA为0.05 mg/L时生根较好,根较多且粗壮。NAA浓度过高时,培养基表面生长毛状须根较多,茎基部伴随有愈伤组织;当浓度低时,生根较细,植株不强壮。
3 讨论
生菜的再生率主要受其基因型的影响,不同基因型生菜芽再生所需激素种类和浓度不同[1]。刘凡等[5]的研究中,生菜“大湖366”以MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA诱导芽的效果最好;那杰等[6]采用的生菜品种是“马莱克”,诱导效果最佳为MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。实验中使用的生菜品种为“四季耐热抗抽薹”生菜,最佳分化培养基为MS+0.15 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,研究为该品种的遗传转化奠定了基础。
试验所设计的16组激素组合,试验品种在低浓度下苗长得较瘦弱、细长,高浓度又容易玻璃化,或易长成畸形苗。在设计的16组浓度配比培养基中,以处理12效果最好。
实验中,外植体接入培养基时间过长,易出现褐变,影响褐变的因素复杂[7],而且往往是多种因素共同作用的结果,应加强对褐变发生的原因、影响因素以及控制方法的研究,为解决褐变问题提供理论依据。
参考文献
[1]赵吉强,李霞,李丽霞,等.生菜遗传转化受体系统的建立及鲑鱼降钙素基因的导入[J].烟台大学学报,2004,17(2):116-121.
[2]陈筑,刘建国,张燕,等.转基因防龋生菜叶片转化体系的优化[J].种子,2012,31(8):5-9.
[3]乔旭,刘玲,高洋,等.罗马生菜的组织培养及无性系建立[J].现代农业科技,2008(4):5-6,9.
[4]朱春燕,雷建军,周浩,等.正交设计优化皱叶生菜离体再生体系[J].热带医学杂志,2008,8(4):313-316.
[5]刘凡,李岩.高频率生菜植株再生及转化体系的建立[J].华北农学报,1996,11(1):109-113.
[6]那杰,方宏筠.结球生菜基因转化组织培养受体系统的建立[J].辽宁师范大学学报(自然科学版),1995,18(3):228-232.
玉米愈伤组织再生体系的研究 篇5
用玉米胚性愈伤组织作为转化受体时,不同基因型在相同2,4-D浓度的培养基上诱导,其诱导率有较大差别,齐319最高;胚龄对诱导率的影响也较大,10 d左右最易诱导,过大或过小均不易诱导胚性愈伤;培养基中2,4-D的浓度对玉米愈伤组织的诱导率有极大影响,不同基因型的最大胚性愈伤组织诱导率所需的`2,4-D浓度也不相同,一般为0.5～1.0 mg几.愈伤组织分化时不同基因型所需最适6-BA浓度不同,齐319、515的愈伤组织最适合分化成苗的6-BA浓度为1 mg/L,鲁原341愈伤组织最适6-BA浓度为0.5 mg/L.
作 者：徐立华 张举仁 周柱华 许方佐 阴卫军 邢燕菊 XU Li-hua ZHANG Ju-ren ZHOU Zhu-hua XU Fang-zuo YIN Wei-jun XING Yan-ju 作者单位：徐立华,周柱华,许方佐,阴卫军,邢燕菊,XU Li-hua,ZHOU Zhu-hua,XU Fang-zuo,YIN Wei-jun,XING Yan-ju(山东省农业科学院原子能农业应用研究所,济南,250100)
张举仁,ZHANG Ju-ren(山东大学生命科学学院,济南,250100)
再生体系 篇6
关键词：蒙菊；组织培养；再生体系；叶片；培养基
中图分类号： S682.1+10.4+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0076-02
收稿日期：2014-12-18
基金项目：国家自然科学基金（编号：30970207）。
作者简介：谢菲（1990—），女，硕士研究生，主要从事花卉资源育种研究。E-mail： shelffy02@gmail.com。
通信作者：赵惠恩，博士，副教授，主要从事花卉资源育种研究。E-mail：zhaohuien@bjfu.edu.cn。蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）是菊科春黄菊族菊属多年生草本植物。蒙菊从我国内蒙古地区分布至北极地区，耐寒性显著，冬季能耐-40 ℃的低温。蒙菊生于贫瘠的石质山坡和亚高山地带，海拔1 500～2 500 m[1]，耐旱性较好，可以应用于屋顶绿化、荒坡绿化、岩石园绿化等方面。但蒙菊在我国分布区狭小，较难采集，引种后越夏困难，不易成活。通过建立蒙菊的再生体系可实现大规模扩繁，保存种质资源，提高引种成功率。蒙菊的再生体系研究至今未见报道，因此，系统深入研究其再生能力及获得再生植株，建立专门针对蒙菊的高效稳定的再生体系，可为菊花耐寒基因工程和转基因育种工作提供理论基础和试验依据，将有效推进高等植物抗性生物技术育种进程。本试验研究目的在于探究蒙菊在组织培养过程中各因素的作用及相互影响，建立出蒙菊的再生体系，为蒙菊的分子生物学研究、细胞学特性和基因工程中遗传受体系统的建立奠定理论基础，同时有利于实现蒙菊组培苗大规模的工厂化生产。
1材料与方法
1.1材料
本试验所用外植体为蒙菊组培无菌苗的叶片。
1.2方法
1.2.1愈伤组织的诱导从生长健壮的蒙菊组培苗上剪取0.5 cm2的叶片（图1-A），将叶片接入MS培养基中，植物生长调节剂选用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），2，4-D（0.1、0.2、0.3 mg/L），NAA浓度为0.01 mg/L [2]，采用2因素3水平完全随机试验设计[3]，每个处理重复3次。30 d后观察愈伤组织形态（图1-B），统计叶片的出愈率：出愈率=发生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%。
1.2.2愈伤组织分化培养将增殖后的愈伤组织接入分化培养基中，诱导其分化出芽点，形成幼小植株（图1-C）。试验采用2因素3水平的完全试验设计，植物生长调节剂选用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）。每个处理接种20个0.5 cm3的愈伤组织，重复3次。在30 d后统计分化率，分化率=已分化的愈伤组织/接种愈伤组织总数×100%。
1.2.3壮苗由于长期生长在含有植物激素的培养条件下，继代培养所得到的部分芽苗形态细弱，营养不足，为了提高组培苗的生根率，需要将这些组培苗进行壮苗培养（图1-D）。将不足3 cm的芽苗移入MS培养基，含蔗糖35 g/L，培养30 d后转入生根培养。
1.2.4生根选择长约3 cm健壮的组培无根苗接入生根培养基中，含15 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，每个处理接入20个组培苗，重复3次。试验采用2因素3水平完全试验设计，培养基分别设为MS、1/2MS、1/4MS，NAA分别为0.1、0.2、0.3 mg/L，分别在20 d后观察生根情况（图1-E），统计生根率和平均根数。生根率=生根的芽苗数/接种芽苗总数×100%；平均根数=总的根数/生根的苗数。
1.3数据分析
试验数据采用Excel和DPS（data processing system）软件进行数据统计、方差分析与多重比较，对百分率等数据进行方差分析时，先将数据进行反正弦转换。2结果与分析
2.1叶片愈伤组织的诱导试验
在蒙菊叶片的初代培养试验中，接种1周后，叶片开始卷曲，在切口边缘处产生团状愈伤组织，随着时间延长，愈伤组织的体积逐渐增大。从表1可以看出，A8处理MS+6-BA 2.00 mg/L +2，4-D 0.30 mg/L显著优于其他处理，出愈率87.50%，出愈时间较短，产生的愈伤组织为绿色，较致密，表面有小突起。A5处理的出愈率仅次于A8，但产生的愈伤组织颜色较浅，产愈量少。愈伤诱导率较低的是A1处理，出愈率42.50%，产生的愈伤组织呈透明状，含水量较高，质地较疏松，在接下来的试验中几乎不能分化。
2.2愈伤组织分化试验
对蒙菊愈伤分化过程进行观察，发现愈伤组织上的突起会逐渐分化成很多绿色的不定芽。由表2可见，B8处理 MS+6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L的分化效果最好，分化率为67.50%，愈伤表面有丛生芽形成。分化效果最差的处理为B6，分化率仅为15.00%，愈伤组织褐化严重。由此可见，褐化现象的防治对愈伤的增殖和分化有着积极的促进作用。
2.3生根培养
无根苗转入生根培养基中1周左右，多数处理中的蒙菊幼苗开始生根，根系呈辐射状，有白色、浅绿色、褐色几种不同类型。从表3可以看出，C6处理1/2MS+NAA 0.30 mg/L显著优于其他处理，生根率为92.50%，平均根数5.33条，根系健壮，白色，生长速度较快。生根情况较差的为C1处理，生根率为32.5%，根系细弱，呈浅绿色，部分根尖变褐，可能是由于培养基中大量元素浓度较高，对根系发育产生抑制作用。
在生根培养中观察到，当NAA浓度过高时，根部愈伤组织较多，形成的根短粗；当NAA浓度较高时，根部愈伤组织不多，形成的根辐射状，粗细适中，根毛较多；当NAA浓度较低时，愈伤组织较少，形成的根细长，数量较多，根毛较少。
2.4炼苗与移栽
首先选择较为健壮、高7 cm左右、根长1～3 cm的组培苗进行驯化。在出瓶之前，将培养容器置于较强光下，打开瓶盖增加通气，同时在培养基上加入1层无菌水。在开口3 d后进行组培苗的出瓶移栽。先将试管苗在40 ℃左右的温水中洗去黏附于组培苗根部的培养基，再放入1% KMnO4 溶液中浸泡5 min，冲洗干净，栽入经过高温灭菌的基质中，基质选用1/2珍珠岩+1/2草炭。
将移栽后的苗置于人工气候箱1周，调节湿度保持在70%以上、温度20 ℃左右，待生长稳定后放到阳光下让其生长[4]。每次移栽30株苗，重复3次试验，30 d后观察（图1-F），统计移栽成活率为87.50%。
在试验中发现形成新根的状态与炼苗的成活率有着密切的关系。当根健壮、根毛较多、整体呈白色、长度在1～3 cm、直径1 mm左右时炼苗成活率最高。而根细长、根数较多、根毛很少、根末端呈褐色、长度大于3 cm的植株炼苗成活较低。所以，选择根系最适的幼苗进行炼苗可以提高成活率。
3讨论与结论
研究表明，使用不同种类、不同浓度和不同比例关系的植物生长调节剂，可以调节培养物的生长发育进程、分化的方向和器官发生。当细胞分裂素/生长素的比值高时，利于芽的分化；而细胞分裂素/生长素的比值低时，有利于根的形成；当二者比值适中时，则愈伤组织处于旺盛的生长状态，没有器官分化[5]。在蒙菊的愈伤分化培养中采用 MS+NAA 0.20 mg/L+
6-BA 0.50 mg/L处理的培养基有少数愈伤组织出现先分化出根的现象，可能是由于6-BA/NAA的比值较低，促使根器官先发生。
本次试验采用的植物生长调节剂有6-BA、NAA、2，4-D 3种。试验结果表明，在初代培养中，适当添加6-BA、NAA、2，4-D可以有效促进芽的萌动和愈伤组织的诱导。其中2，4-D对愈伤组织的诱导有着明显的促进作用，但用量过高会产生毒害作用，使形态畸变，诱导率降低。在继代培养中6-BA对不定芽的增殖有较好的促进效果，但在试验观察中发现高浓度的6-BA培养基中长期培养会出现较多玻璃化现象。在生根培养中，NAA的运用有利于植株根系萌动，当NAA浓度较高时，形成的根粗壮，根毛较多；当NAA浓度较低时，形成的根细长、数量较多、根毛较少。
在本试验中，出现了叶片诱导时出愈率较高，但愈伤组织增殖系数不高、分化较少的现象，即使愈伤组织能分化出少量芽，也会因培养时间过长无营养而生长缓慢甚至死掉。分析原因，一方面可能是初代培养使用的激素浓度不当，虽然出愈率较高，但所诱导的愈伤组织大多数是比较致密的愈伤组织，很少有粗颗粒状突起，难以增殖分化成芽；另一方面可能是由于植物本身的生理状态和遗传特性等因素造成的愈伤组织生长情况不佳[6]；此外，光照、温度等培养条件不适宜都可能是造成愈伤组织难分化成芽及分化的芽不易成活的因素。具体的愈伤组织分化成苗较难的原因还有待于进一步深入研究。
参考文献：
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大苞萱草再生体系的建立 篇7
1 材料与方法
1.1 试验植物及其生物学特性
大苞萱草,采自吉林农业大学植物园内,由吉林农业大学生命科学学院刘洪章教授鉴定。
大苞萱草具有开花期早、抗逆性强等特点,植株呈丛状,株高可达70 cm左右。叶簇生于根部,呈线形向上延伸,逐渐变窄变尖,叶片宽0.8~2.5 cm。花茎从花叶中部抽出,约与花叶等长,花茎不分枝,在顶部着生花蕾大约4朵,呈金黄色。根部位于土层之下呈绳索状,扭结在一起,多数根须粗约0.3 cm。蒴果,呈椭圆形球状,稍有三钝棱,长约2 cm;蒴果内包含多个种子,种子呈黑色不规则的颗粒状,表面有褶皱。大苞萱草的返青期与当地气候息息相关,一般来说,吉林省3月中下旬—4月上旬是大苞萱草的返青期,萌芽较早;4月份下旬—6月上旬集中进入花期,集中花期可长达1个月;6月中旬开始逐渐进入果熟期,种子发育良好、成熟率高;9月份中旬进入枯萎期。全年生长200 d左右,对土壤要求不严格,可露地栽培。
1.2 试剂与仪器
配制MS基本培养基的试剂见表1。
其他试剂包括盐酸、氢氧化钠、α-萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、活性炭、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇、95%酒精、0.1%升汞溶液、氢氧化钠蔗糖等,均为市购。
高压灭菌锅(MLS-3750),购自日本三洋公司;精密酸度计(PHS-3C),购自上海佑科仪器仪表有限公司;SC-316立式冷藏柜,海尔公司产品;电子分析天平(JA2003A),上海精天电子仪器有限公司制造;超净工作台(DL-CJ-2N),购自北京东联哈儿仪器制造有限公司;光照培养箱(BAG-400),购自上海博迅实业有限公司;微量移液枪,美国Thermo Freshman公司产品;医用镊子、解剖刀、滤纸、75%酒精、0.1%升汞溶液、日光灯、电磁炉、洗涤用水槽、500 m L圆形玻璃瓶、胶质瓶塞、烧杯、容量瓶、玻璃棒、各式洗瓶刷、胶手套等。以上仪器及设备均由吉林农业大学生命科学学院508实验室提供。
1.3 试验设计
1.3.1 外植体消毒灭菌
取采集的大苞萱草幼嫩外植体,在自来水中冲洗表面泥土和灰尘,加入洗衣粉溶液冲洗20 min;外植体置于超净工作台中,用75%乙醇浸泡消毒;用无菌水冲洗1遍,吸干后再用0.1%升汞溶液消毒,之后用无菌水冲洗4遍;在灭菌滤纸上将外植体材料切成2 cm左右的培养块,接种于萌动培养基中。能否得到无菌的外植体不但取决于所使用的表面消毒剂种类和时间,更重要的是植物材料的状况。灭菌方案见表2。
污染率=(污染外植体数/接种总外植体数)×100%;成活率=(成活外植体数/接种总外植体数)×100%。
1.3.2 愈伤组织初代诱导
试验均以MS固体培养基为基础培养基,琼脂6 g/L,p H值为5.8~6.0。根据培养目的的需要适量添加植物生长调节剂———细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、植物生长素2,4-D,配制后经高压灭菌器(121℃,0.2 MPa压力)消毒20 min,高温高压灭菌消毒后待用。试验采用响应面法将6-BA、2,4-D、NAA设置17种不同的浓度梯度,以得到最优初代诱导培养基配方。将灭菌的外植体分别接种筛选愈伤组织的培养基中,每个处理接种30瓶,每瓶接种5个外植体,(23±2)℃暗培养。30 d继代1次,约60 d统计出愈率[出愈率=(形成愈伤组织数/未污染的外植体数)×100%]。
愈伤组织初代诱导方案见表3。
mg·L-1
1.3.3 愈伤组织生根培养
很多文献表明,暗培养是不定根形成的必要条件。试验以2/1MS培养基为基础培养基,以不同浓度蔗糖(0,1,2)、NAA(0.1,0.3,0.5)、活性炭(0.1,0.3,0.5)为变量,分别将长势良好的大苞萱草无菌苗接种在诱导不定根培养基中进行生根培养,20 d后统计生根率。第35天统计生根量。愈伤组织生根培养方案见表4。
1.3.4 组培苗驯化与移栽的研究
取组培苗根长为4~7 cm的健壮植株,将培养瓶移出培养室,打开瓶盖并添加少量经高压灭菌锅灭菌过的纯化水,在室内放置3 d;3 d后将已生根的健壮幼苗从培养瓶中取出,用纯化水清洗根部的残留培养基并用无菌滤纸吸取幼苗上多余的水珠,栽在预处理好移栽基质中,隔1 d浇1次水,并适当遮阴;后期逐渐加强光照时间至全日照。移栽后15 d后统计移栽成活率。
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理对外植体初代培养的影响
见表5。
外植体的污染率随着升汞消毒时间的增加呈逐渐下降的趋势,成活率呈先上升后下降再上升的趋势。75%乙醇在超过30 s后外植体大部分失水死亡,单一靠长时间75%乙醇处理外植体,灭菌率虽然高,但随着乙醇灭菌时间的增加成活率逐渐降低。
乙醇消毒处理对芽污染率影响不大,在各处理中,A2成活率最高(为83%),A1、A4处理的污染率最高(为45%)。A5处理的污染率较低,但成活率为零。外植体污染率高,导致个体植株发生污染的同时分泌酚类物质,使培养基变成红褐色,导致更多的植株染菌而死。此类现象在初代培养时较为严重。通过污染率和成活率数据分析,在设定的幼芽灭菌方案中,处理2(75%乙醇30 s、升汞7 min)培苗污染率较低,成活率较高。处理2的培养情况见292页彩图1。
2.2 初代愈伤组织诱导培养基统计结果
见表6。
处理11,6-BA浓度为1 mg/L、NAA浓度为0.3 mg/L、2,4-D浓度为0.3 mg/L时诱导率最高,达98.27%。响应面方差分析结果见表7。数据经Design-Expert.V8.0.6.1软件分析3因素,得出B、AB、BC、A2、B2、C2是重要模型。得到回归方程为R1=94.60-3.33B-2.32×A×B+3.10×B×C-29.88A2-4.99×C2-B×7.62。R2=0.967 6,说明误差数值小,试验情况与数据分析相符。试验结果见292页彩图2、彩图3。
注:P>0.05表示影响结果不显著,P<0.05表示显著,P<0.000 1表示极显著。
通过响应面分析可知,134.96模型的F值意味着模型是显著的。“F”小于0.050,说明模型有重要价值。各因素的响应面3D分析一见292页彩图4。
3D曲面分析图曲线趋势越陡峭,说明对试验结果的影响越大;曲线趋势越平缓,说明试验结果影响较小。由此得出结论:在大苞萱草愈伤组织诱导试验中最佳诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。
2.3 愈伤组织生根诱导
植物生根培养是植物再生体系中的瓶颈,植物生根培养受多种因素限制,如光照、水分、温度、糖的浓度、培养基类型等。培养基成分不同,对植物生根率及根长势情况有极大的影响。生根培养各因素协同作用,根据试验数据所得参数见表8、表9。
由响应面分析可知,102.24模型的F值意味着模型是显著(P<0.05),试验情况与数据分析相符,见292页彩图5、彩图6。
采用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析,结果A、B、C、A2、B2、C2是重要模型。各因素的响应面3D分析二见292页彩图7。由292页彩图7得到回归方程为R1=55.44-0.24×B+1.67×B×C-23.07A2-14.67×B2-C2×15.99。R2=0.924 9,说明误差数值小。根据分析得出最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+2 g/L活性炭。
注:P>0.05表示影响结果不显著,P<0.05表示显著,P<0.000 1表示极显著。
2.4 组培苗移栽
在试验中发现,大苞萱草管理很粗放,种植于不同基质中生根苗的成活率都很高,其中在园土中的移栽成活率为85%,园土+珍珠岩中的成活率为97%,沙土+园土中的成活率为70%。分析原因,珍珠岩具有较大的孔隙度,增加透气,不积水;而园土的透气性较差,成活率相对较低。综合分析,园土、珍珠岩之比为3∶1为大苞萱草组培苗的最佳移栽基质,见292页彩图8。
3 讨论
大苞萱草为百合科萱草属多年生宿根草本花卉,根茎表现出极强的抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病虫害等优点。在本试验中发现,幼芽很少产生愈伤组织,直接诱导出丛生芽,只要芽在培养过程中不污染,不死亡,就能诱导出不定芽来。一些幼芽直接长出独苗,一些长出2个甚至多个丛生芽。但是诱导出的不定芽长势不好,出现畸形,并大量出现玻璃化、水浸现象。幼叶在前期生长正常,在叶的两边出现一些白的愈伤组织,但是随着培养时间的推移,叶逐渐开始褐化死亡。
添加1 g/L活性炭的相同激素配比的培养基比未添加活性炭的诱导率高,且成长状态好、褐化情况少。可能是活性炭吸收了萱草组织分泌的有害物质,从而比未添加活性炭的诱导率高。鉴于取材时间、试验所限,未深入研究活性炭量多少对萱草愈伤组织诱导的影响的试验,有待今后进一步研究。
4 结论
最佳的外植体消毒方案:75%乙醇30 s+0.1%升汞7 min;最佳愈伤诱导培养基:MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L;最佳生根培养基:1/2MS+NAA 0.3 mg/L+2 g/L活性炭。
图1大苞萱草的愈伤组织诱异情况
图2大苞萱草愈伤组织分化情况
图3大苞萱草不定芽增殖情况
图4各因素间响应面3D图分析一
参考文献
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再生体系 篇8
Saunders等[1]从苜蓿未成熟的花药、子房、子叶愈伤组织分化再生植株获得成功,标志着苜蓿再生体系研究的开始。上海植物生理所杨燮荣[2]利用叶片、叶柄、茎段成功地进行了国内首例紫花苜蓿的再生体系。拉开了我国研究苜蓿再生体系的序幕,苜蓿的再生体系成功与否和许多因素有关。
1 苜蓿再生体系的研究进展
1.1 苜蓿再生体系中基因型的选择
苜蓿再生体系会受到基因型的影响,基因型不同的苜蓿品种,其再生能力及特征差别特别大。Song等[3]认为基因型杂合程度高的,其体胚形成能力高,再生能力也高。Sairam等[4]证明,苜蓿愈伤组织的再生能力受基因型控制,并且高度遗传,可通过轮回选择的方法将植株再生能力提高。
ReschMoltrasio等[5]利用苜蓿的15个品种作为试验材料,品种12R产生愈伤组织率平均为50%,而另一个品种196不能再生。Brown和Atanassov[6]通过试验也得出了苜蓿组培是依赖于基因型的。Iantcheva等[7]利用R108和Jemalong两个品种进行再生能力的比较,R108的再生率为45%,而Jemalong的再生率只有1%～2%。
1.2 苜蓿再生体系中外植体的选择
外植体是指从活体植物组织分离下来的用于培养的那一块植物。苜蓿再生体系研究开展30年来,国内外研究报告中所采用的外植体种类繁多,几乎所有器官或组织都可以作为外植体,如茎尖、叶片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花粉、子房、胚珠、根、叶柄等。一般形成胚性愈伤组织时选叶柄、子叶、上胚轴、下胚轴、幼芽等作为外植体,污染小,材料易得、方便。快繁可以选茎段、花茎等作为外植体,操作简单、取材容易。尽管几乎苜蓿所有器官或组织都可以作为外植体,但合适的外植体选择也是决定再生体系成功的一个关键因素。Monteiro[8]等在研究5个不同品种苜蓿原生质体培养时发现,虽然外植体为子叶或叶片时都能诱导形成愈伤组织,但只有Rangelander苜蓿的叶片可以分化出体胚,获得再生植株,Gallego[9]利用子叶,下胚轴,叶柄和叶片做外植体,在他的实验条件下,叶柄是最好的外植体,平均产生18个体细胞胚,8%的体细胞胚转变为正常的植株。Cuadrado[10]也得到了叶柄是最好的外植体同样的结论。Iantcheva A[11]利用杂花苜蓿品种R108的根做外植体,根先被1M蔗糖溶液预处理48 h和72 h后,在液体培养基中培养。预处理72 h的根完成再生所用时间最短(55 d),体细胞胚转化为完整植株的比例最大(70%)。Ziauddin[12]利用苜蓿品种RSY27茎尖作为外植体,离体培养在添加1 μmol·L-1 IBA的MS培养基上,植株得到了再生。
1.3 苜蓿再生体系中培养基的选择
培养基是活体植物组织体外保存、生长发育的营养来源。苜蓿再生体系中所用培养基较多,随着生物技术的发展,苜蓿再生体系中所用培养基种类越来越多。Shao等[13]在诱导愈伤组织的形成时,采用的培养基为B5培养基,愈伤组织分化成植株采用Blaydes改良培养基,苜蓿外植体直接成苗中采用MS和B5培养基。Bryan等[14]在诱导愈伤组织的形成时,采用的培养基为SH培养基,愈伤组织分化成植株采用Blaydes改良培养基。Janos等[15]利用添加25 μmol·L-1的NAA和10 μmol·L-1的KT的SH培养基诱导愈伤组织的形成,然后利用常用的MS培养基培养悬浮细胞,在诱导苜蓿愈伤组织分化成苗上,MS优越性更大。进行不同2,4-D的处理,用来进行一个新基因的筛选。Winicov等[16]利用在SH培养基培养苜蓿的细胞系,进行细胞的抗盐的筛选。再生体系发展方向,很大程度上取决于培养基中植物生长调节物质的种类、浓度及配置组合等。苜蓿再生体系中通常采用的植物生长调节物质主要有植物细胞生长素和植物细胞分裂素二类。主要应用的植物生长素有2,4-D,NAA和IAA,在离体培养中主要诱导愈伤组织形成和根的发育。而细胞分裂素主要应用的则是KT,ZT,BA,其中生长素和分裂素二者在培养基中比值大小,决定外植体分化或发育方向;当比值高时,有利于根的诱导,而比值低时则有利于芽的分化。苜蓿再生体系中,外源激素的应用相当普遍且重要,使用的种类、浓度及结构控制着再生方式。在再生程序中,SH中添加2,4-D 50 μmol·L-1和KT 5 μmol·L-1,可以产生具有高度再生能力的胚性愈伤组织,不添加任何生长调节物质则有利再生,当诱导生根时则应添加50 μmol·L-1 KT和5 μmol·L-12,4-D。
1.4 苜蓿再生体系的途径
苜蓿再生体系的途径分为直接分化再生途径和愈伤组织再生途径两种。激素在两种途径中起到了至关重要的作用。直接分化再生途径即不经过胚性愈伤组织直接发育成体细胞胚的。叶片放在添加22.6μmol·L-1 2,4-D和4.7 μmol·L-1 Kinetin的MS培养基上,发育成胚性细胞,可以不经过胚性愈伤组织直接发育成体细胞胚。大多数苜蓿再生体系是经过愈伤组织再生途径完成的即经过体细胞先发育成胚性愈伤组织再发育成体细胞胚阶段。在Davietova等[17]所采用的培养条件下1 mg·L-1的2,4-D能有效 地在愈伤组织中提高细胞分裂,但不能诱导器官发生。具有胚胎发生能力的苜蓿品种(subsp.Varia A2)在低浓度(1 μmol·L-1)的2,4-D存在的情况下,原生质细胞只是增长,然后死亡或者不分化。在高浓度(10 μmol·L-1)的2,4-D存在的情况下,原生质细胞保持小并且浓的细胞质,能进一步发育成原胚发生细胞蔟。
1.5 再生体系条件的控制
再生体系中,光照是必需条件之一。一般诱导愈伤组织时光照强度为800～1 000 lx,诱导分化时则以1 500～2 000 lx为宜,光照时间为12 h·d-1。光照强度和时间在苜蓿组培中应根据基因型、外植体种类及培养基的灵活应用。20～28℃是苜蓿再生体系温度的基本范围,应用最多的是23～27℃,过低过高的温度对植株再生都是不利的。
2 苜蓿转基因体系研究进展
首例由Deak等[18]利用农杆菌介导法对苜蓿进行转化获得成功之后,外源基因转入苜蓿的研究陆续见有报道。遗传转化也受到若干因素影响。
2.1 乙酰丁香酮(AS)浓度的影响
乙酰丁香酮(AS)是常用的诱导能力最强的酚类化合物,虽然被广泛应用以提高转化率,但在不同植物上应用效果不同,很多实验中都证明其不是决定性因素,只可能在单方面诱导农杆菌的毒性,而农杆菌的毒性是有最高限度的,超过这个限度,乙酰丁香酮就无法进一步提高转化效率甚至是有害的。Ziauddin [12]利用农杆菌侵染苜蓿的子叶15 min(没有使用AS),共培养5 d。Mckersie[19]利用农杆菌侵染苜蓿的叶柄,使用AS的浓度为100 μmol·L-1,共培养3 d。Galili[20]等使用的AS浓度为50 μmol·L-1。
2.2 选择压Kana的影响
Kana常常作为转化过程中的筛选标记,经有效转化的外植体才可以在含有Kana的选择培养基上持续生长,作为进一步转基因植株鉴定的基础。但有的报道中认为,苜蓿发育的不同时期,表现不同的Kana抗性,种子的萌发似乎不受Kana的影响,幼苗中也发现了高水平的内源抗性,对转化体的筛选效率很低。在不同的转化体系中使用的浓度不同,如Saruul[21]使用Kana浓度为50 mg·L-1,Winicov[16]使用Kana浓度为100 mg·L-1,而在Austin[22]和Dong[23]所用Kana浓度却为25 mg·L-1。
2.3 转基因苜蓿受体的选择
转基因苜蓿的手段包括直接转化法和农杆菌介导的基因转化法,直接转化法是通过物理或化学方法将外源基因导入植物细胞或原生质体,如Reich[24]利用显微注射法将Ti质粒导入紫花苜蓿原生质体,得到转化的愈伤组织。农杆菌介导的基因转化是最普遍的,农杆菌的受体材料广泛,在基因转化的过程中选择适合的受体系统会收到事半功倍的效果。Anthony [25]等利用发芽的种子及花器官作为转化的受体,绕开了再生体系程序获得了转化植株。转化率分别为36.0%和9.4%。但使用的材料是特殊品种“Jemalong”,以后也没有后续的报道。Mckersie[19]利用叶柄作为转基因的受体,在筛选后,大约90%的再生植株是转基因阳性植株。但苜蓿转化多数是以子叶为遗传转化的受体。
德国建立完善的塑料回收再生体系 篇9
IK表示, 德国的塑料袋回收体系, 可确保塑料手提袋经过分拣进行机械再生和能源回收, 不会滞留于环境中。该研究显示, 使用过的塑料手提袋48%可实现回收再生, 72%的消费者会多次利用手提袋, 只有11%的零售食品和化学产品使用新的塑料手提袋。
在引人注目的2014年美国塑料回收会议上, 行业专家们对于长期以来无法大规模回收的诸如薄膜、发泡塑料盒其他不易处理的塑料的回收积极地交换了意见。
加工番茄离体再生体系研究 篇10
相对于鲜食番茄,加工番茄的研究起步较晚,生产用品种单一且经过多年种植已出现抗病虫、品质严重下降的趋势,遗传背景狭窄,新品种培育受到限制,与国外存在很大差距[4,5]。随着现代生物技术的发展,细胞工程和基因工程技术为品种改良和突破性育种开辟了新途径,甚至加速了新品种选育进程[6]。开展这些工作都离不开高效的离体再生条件,其作为离体培养和转基因操作的重要技术基础,离体再生体系已成为基因工程育种、杂种优势固定和优异种质保存的前提。当前加工番茄离体再生体系研究还较少,且主要集中在B02、B04、里格尔87-5和亚心98-1等老品种之间[7,8,9],不能满足当前开展遗传转化的需求。本研究选用品质好、产量高、深受消费者喜爱的石红303为材料,分别以下胚轴、子叶和叶片作为外植体,系统地研究了不同外植体和激素种类对加工番茄再生体系的影响,以期建立高效的离体再生体系,为进一步快速繁殖、固定杂种优势和遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试品种为石红303,由新疆石河子蔬菜研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 培养基的配制
种子发芽培养基为1/2MS培养基。愈伤和不定芽诱导培养基以MS为基本培养基,添加不同种类和浓度的激素配比(见表1)。生根培养基以1/2MS为基本培养基,添加不同种类和浓度的激素(见表2)。以上培养基均添加7.0mg·L-1琼脂,pH5.8,于121℃下灭菌20min,放置l~2d后使用。
1.2.2 外植体的制备及后续培养
(1)无菌苗:取健康、饱满的种子浸于10%的次氯酸钠溶液中灭菌20 min,无菌水冲洗3次,灭菌的干燥滤纸吸干残液,接种于1/2MS培养基上。前4~7d暗培养,待大部分种子发芽转至光下培养,每天光照16h,培养温度为(25±1)℃。取培养约10d无菌苗,子叶去除叶尖和叶柄,剩余部分切成0.5cm×0.5cm大小叶盘,下胚轴切为长约0.5cm的切段。(2)叶片:选取在田间正常生长的健康植株的幼嫩叶片,自来水冲洗30 min,转入超净工作台,75%酒精浸泡30s,无菌水冲洗3次,0.2%氯化汞溶液中轻摇5 min后,无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干残液,去除叶尖和叶柄,剩余部分切成0.5cm×0.5cm大小叶盘。
将处理好的子叶、下胚轴和叶片分别接种于愈伤和不定芽诱导培养基上,每个培养皿中接种15~20个,每个处理3次重复,在温度(25±1)℃,光照16h,光照强度1 500lx培养条件下培养。培养约20d时统计愈伤组织诱导率,35d时统计不定芽诱导率,其中:愈伤组织诱导率(%)=有愈伤组织形成的外植体数/接种外植体数×100;不定芽诱导率(%)=分化出不定芽的愈伤组织数/接种总外植体数×100。
1.2.3 生根培养
选取顶芽正常、生长健壮的再生幼芽(≥2.0cm),将基部愈伤组织及培养基完全切除,转接到生根培养基上培养,其中每个处理接种20个芽,培养条件同上。培养20d后观察根生长状况,统计生根率,其中:生根率(%)=有根形成的芽数/接种芽数×100。
1.2.4 炼苗及移栽
当幼苗根的长度达到6~9cm,须根较多时,将封口膜打开炼苗2~3d,取出小苗洗掉根部的培养基,移入高压灭菌后的基质中(蛀石∶草炭=1∶2)并覆膜保湿,7~10d后,可逐步放风,最后除去塑料薄膜,让其继续生长发育至开花结果。
2 结果与分析
2.1 不同激素组合对加工番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响
植物的组织培养通常需要细胞分裂素和生长素配合使用,本试验选取6-BA作为细胞分裂素,配合使用的生长素有NAA、IAA和IBA,从表1看出,6-BA和NAA搭配使用,可获得最高的愈伤组织诱导率(98.0%~100.0%),但大都为黄白色的愈伤组织,体积大且松软湿润,多伴有不定根的生成(见图1B),不定芽分化率非常低(4.1%~8.0%)。6-BA和IAA搭配使用,可获得较高的愈伤组织诱导率(67.0%~92.4%),且诱导的愈伤组织呈淡绿色或绿色,结构致密,绿色芽点多且分生能力强,具有最高的不定芽分化率(21.0%~96.0%)。6-BA与IBA组合时,愈伤组织诱导率介于54.4与85.8之间,愈伤组织大都为淡绿色、易散的水渍状小颗粒,生长速度慢,分生能力差,不定芽分化率较低(14.8%~66.3%)。即当细胞分裂素固定为6-BA时,3种生长素的综合诱导效果为IAA>IBA>NAA。
近年来,ZT在番茄的再生体系和遗传转化中得到广泛的应用。将ZT与IAA搭配使用,结果显示可获得较高的愈伤组织诱导率(82.8%~100.0%),诱导的愈伤组织呈淡绿色或绿色,结构致密,绿色芽点多且分生能力强,具有较高的不定芽分化率(45.5%~81.5%)。当生长素固定为IAA时,6-BA的综合诱导效果优于ZT,即最适合石红303的愈伤和不定芽诱导培养基是:MS+6-BA3.0mg·L-1+IAA0.2mg·L-1。分析4个不同激素组合的愈伤组织和不定芽诱导效率,结果显示不同激素配比浓度对外植体愈伤组织的诱导影响不大,但对不定芽分化影响较大,存在较大的差异。
2.2 外植体类型对愈伤诱导和芽分化的影响
接种7d后,子叶和叶片的切口处开始卷起,叶片膨大,边缘或者下部开始形成愈伤组织;下胚轴开始肿胀,两端形成肉眼可见的愈伤组织,外形呈哑铃状,培养约20d时,愈伤组织诱导均出现高峰。接种约14d时,外植体上开始陆续分化出芽点,这些芽点能进一步发育成苗或叶,培养约35d时,不定芽分化出现高峰。分别统计三类外植体的愈伤组织和不定芽诱导率,结果显示同一品种的不同外植体愈伤组织诱导率差异不明显,不定芽分化率差异较大,且外植体分化率最高的是子叶,其次是叶片,最后是下胚轴。
A:无菌苗;B:6-BA+NAA诱导的愈伤组织;C:子叶诱导愈伤与不定芽;D:下胚轴诱导愈伤与不定芽;E:叶片诱导愈伤与不定芽;F:继代培养;G:不定芽生根;H:再生苗移栽;I:再生苗开花结果A:sterile seedling;B:callus induced by 6-BA and NAA;C:callus and adventitious bud induced from cotyledon;D:callus and adventitious bud induced from hypocotyl;E:callus and adventitious bud induced from leaf;F:subculture;G:rooting of adventitious bud;H:transplant of the regrowth;I:blossom and yield fruit of the regenerated plant
2.3 不同激素种类对不定芽生根的诱导
将不定芽转入附加不同生长素的生根培养基上培养,7d左右即可生根,从基部边缘首先长出主根,在主根上进一步长出长短不一的小侧根,进而发育成完整的小植株。培养20d统计生根率,结果显示(见表2):NAA诱导的根比较粗壮稀少,但愈伤化极其严重,芽苗生根后生长缓慢,甚至死亡;IAA和IBA诱导生根能力明显好于NAA,生成的根细长盘曲,须根较多。其中加入0.1mg·L-1IAA的培养基生根速度快,再生苗茎粗、叶多、生长势强,非常适合用于加工番茄离体再生体系中不定芽的生根诱导。
2.4 再生苗移栽
移栽成活是再生苗的难关之一,待再生试管苗根系发达、茎秆粗壮后,进行驯化移栽。打开封口膜,将其放置在待移栽的环境中炼苗2~3d,取出并洗掉根部的培养基,移栽到盛有灭菌基质的营养钵中覆膜保湿,7~10d后,可逐步放风,最后除去塑料薄膜。对基质进行灭菌处理,有效防止了土传细菌和真菌的感染,利用此种方法,移栽成活率高达90%,定植后可正常发育至开花结果。
3 结论与讨论
在植物组织培养中,外源激素的使用是必不可少的,其种类和浓度是影响植物离体再生能力的关键因素。本研究对细胞分裂素6-BA、ZT,生长素IAA、IBA、NAA进行了筛选,结果显示激素的种类和浓度对加工番茄外植体出愈率的影响没有差异,但是诱导形成的愈伤组织形态和不定芽存在差异。根据愈伤组织的形态和结构,可分为3类:I型呈淡绿色或绿色,结构致密,生长速度快,分生能力强;Ⅱ型呈淡绿色,霜状或易散的水渍状颗粒,生长速度慢,分生能力差;Ⅲ型呈灰白色或灰褐色,松软湿润,生长速度最快,分生能力极差。本研究中,当生长素为NAA时,大都产生Ⅲ型愈伤组织,不定芽分化率非常低(4.1%~8.0%);生长素为IAA时,大都产生I型愈伤组织,不定芽分化率最高(21%~96%);生长素为IBA时,大都产生Ⅱ型愈伤组织,不定芽分化率较低(14.8%~66.3%),其综合诱导效果为IAA>IBA>NAA,这与孟祥栋[10]、陈丽萍[8]等在番茄中研究结果一致。比较6-BA和ZT的诱导效果,结果显示:都可获得较高的愈伤组织诱导率,大都为I型愈伤组织,不定芽分化率较高,且差异不明显。选取子叶和真叶作为外植体,6-BA的诱导效果略高于ZT;选取下胚轴作为外植体,ZT的诱导效果略高于6-BA,这与高南[11]等的研究结果一致。有研究表明,IAA和6-BA结合使用会提高番茄外植体的再生频率[12,13],也有研究表明ZT诱导番茄再生的效率高于6-BA[14,15],造成这种差异的主要原因在于激素诱导愈伤和不定芽分化有一定的基因型依赖性[16]。
植物组织培养中使用的外植体种类很多,有花药、叶片、原生质体、子叶和下胚轴,在以往的研究中,对番茄外植体的选择各有不同,其中以下胚轴和子叶为外植体再生植株的报道较多。已有研究表明,番茄的植株再生能力一般为叶片>子叶>下胚轴,不同品种、不同外植体的再生频率各不相同[17,18]。以加工番茄石红303的子叶、下胚轴、叶片作为外植体进行离体再生,结果显示同一品种不同外植体愈伤组织诱导率差异不明显,不定芽分化率差异较大,其离体再生能力为子叶>叶片>下胚轴。子叶的再生频率高于下胚轴,这与张丽华、陈丽萍等人在加工番茄中的研究结果一致[7,8];子叶的再生频率高于叶片,这与前人研究结果不同,造成这种差异的主要原因在于叶片的来源与处理不同。在本研究中,叶片来源于田间,后期的灭菌处理中使用了氯化汞,其抑制了IAA对细胞壁的影响和幼苗生长[19,20]。通过此种来源的叶片离体再生,可以解决育种上一些特殊可贵材料的保存与繁殖问题。加工番茄离体再生受到内因和外因的共同影响,内因包括植物组织的基因型、生理状态和发育时期等,而外因则包括培养基、培养条件、继代时间和接种方式等。本研究通过选择最佳的外植体及发育时期、激素种类及配比、培养条件及炼苗移栽途径,建立了高效的离体再生体系,为加工番茄细胞工程和基因工程的研究与开发提供了可靠的理论依据和相应的技术保障。
摘要：为建立一套优化的适于加工番茄遗传转化的高效离体再生体系,以加工番茄石红303的子叶、下胚轴、叶片作为外植体,研究了不同激素及浓度、不同外植体材料对愈伤组织诱导、不定芽分化及生根的影响。结果表明:激素的种类和浓度对加工番茄外植体出愈率的影响没有差异,但是诱导形成的愈伤组织形态和不定芽存在差异。选取子叶作为外植体,培养基组成为MS+6-BA3.0mg·L-1+IAA0.2mg·L-1最有利于愈伤组织和不定芽的形成;不定芽在生根培养基1/2MS+0.1mg·L-1 IAA上生根效果最佳,并能发育成完整的小植株。
