细胞密度

关键词： 扩散 肿瘤 无创

细胞密度（精选九篇）

细胞密度 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月-2015年12月在笔者所在医院诊断治疗的肾上腺肿瘤患者53例, 其中男27例, 女26例;年龄25~74岁, 平均 (48.2±12.1) 岁。53例患者良性肿瘤27例, 恶性肿瘤26例, 共有62个肿瘤, 其中9例为双侧肿瘤, 左侧32个, 右侧30个;肿瘤大小1.3 cm×2.0 cm~8.8 cm×12.3 cm。62个肿瘤中, 38个为良性肿瘤, 24个为恶性肿瘤。良性肿瘤中Cushing腺瘤3个, Conn腺瘤14个, 无功能腺瘤7个, 嗜铬细胞瘤11个, 神经源性肿瘤3个。恶性肿瘤中皮质癌2例, 淋巴瘤3个, 转移瘤19个。所有患者的诊断均经病理证实, 所有患者均临床资料完整。

1.2 检查方法

西门子1.5T超导磁共振, 型号:Essenza成像系统进行检查。常规轴位T1WI压脂, T2WI压脂, 快速梯度回波, 同相位反相位等序列检查, 然后行DWI检查, 采用SE-EPI-DWI屏气方式扫描。B取1000 s/mm2, 800 s/mm2, 500 s/mm2。TR为4000 ms, TE为64.6~50.9 ms, 带宽250 k Hz, 激励次数为1, 在XYZ三个轴方向上事假敏感梯度脉冲。层厚为5 mm, 间隔0 mm, 矩阵为128×128, FOV为35×35。所有数据输入仪器配置的工作站软件进行图像护理, 获得不同b值的ADC图及DWI图, 选择感兴趣区, 测量3个层面, 取平均值。放置ROI, 避开可见的坏死区、囊变, 避开肿瘤边缘, 减少容积效应。测ADC值。

1.3 计数细胞密度

所有患者对切下的肿瘤组织在200倍光镜下计数肿瘤细胞密度, 每个标本去5个视野计算, 并取均值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析, 计数资料以率 (%) 表示, 采用字2检验, 计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 采用方差分析及t检验, 相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DWI及ADC图像分析

在DWI图像上随着b值的变化, 肿瘤信号也随之变化。b值在500 s/mm2时肿瘤信号清晰, 边界清晰, 呈高信号或者混杂信号;b值在1000 s/mm2时, 信号减弱。质地不均匀的肿瘤, 坏死区、囊变区信号随着b值的增加而下降。良性肿瘤中质地均匀的实体瘤在DWI上表现为均值、高信号, 在ADC图上信号稍低;神经鞘细胞瘤、嗜铬细胞瘤等多见囊变、坏死的肿瘤, 在DWI图像上信号不均匀, 实性部分为高信号区, 坏死、囊变区为低信号区 (图1) , 在ADC图像上信号强度相反但是更为清晰 (图2) 。恶性肿瘤在DWI图像上为信号不均匀的肿块, 实性部分为高信号, 坏死、囊变部分为低信号, 信号强度不等, 转移瘤少数为均匀等信号;肾上腺原发恶性肿瘤根据肿瘤情况, 有大量坏死者, 可有不均匀信号, 肿瘤边缘可见高信号, 而腺淋巴瘤主要变现为均匀高信号;ADC图像上的信号相反。

注:可见坏死、囊变区为低信号

注:可见坏死、囊变区为高信号, 与DWI图相反

2.2 良恶性肿瘤在不同b值时ADC值比较

良性肿瘤与恶性肿瘤在不同的b值ADC值不同, 良性肿瘤的ADC值均显著高于恶性肿瘤 (P<0.01) , 见表1。

×10-3mm2/s

2.3 ADC值与细胞密度相关性

采用Pearson相关性分析进行分析ADC值与细胞密度相关性。b值取1000 s/mm2时, r=-0.652, P<0.01;b值取800 s/mm2时, r=-0.733, P<0.01;b值取500 s/mm2时, r=-0.476, P<0.01。在b值取800 s/mm2时, 相关性最大。

3 讨论

肾上腺是人体内重要的内分泌器官, 其位置与肾脏关系密切。肾上腺肿瘤根据是否具有内分泌功能分为功能性、非功能性。肾上腺解剖上分为皮质与髓质, 均可发生肿瘤。患者可有皮质醇增多症的临床表现, 原发性醛固酮增多症的临床表现。肾上腺嗜铬细胞瘤是常见的肾上腺肿瘤, 其能够释放肾上腺素与去甲肾上腺素, 可导致阵发性高血压、头痛、皮肤苍白、心跳增快、四肢及头部震颤、乏力、出汗。手术是治疗肾上腺肿瘤的主要治疗方法, 而术前明确诊断对指导治疗具有重要的临床意义。

DWI是20世纪90年代中期发展的检测组织内水分子扩散运动MRI技术。临床上DWI可用多种序列进行, 但是不同的序列影响其信号衰减的因素基本相通[3,4]。扩散敏感梯度场强度、持续时间、间隔时间、水分子自由扩散度等是主要的影响因素。强度越大时、持续时间越长者信号衰减越显著、间隔时间越长、水分子扩散自由度越大者组织信号衰减越显著[5,6,7]。DWI中扩散敏感系数 (b值) 对信号影响大。b值高则水分子扩散运动敏感, 但b值过高也会导致信号衰减[8,9,10]。b值的选择对DWI的检测结果很重要, 但合理选择b值在临床上较为困难, 目前主要根据设备条件、序列不同、目的不同调整b值[11,12,13]。在本次研究中, 笔者分别选择了500、800、1000 s/mm2三个值, 在1000 s/mm2时, 图像信号有减弱。

DWI反映的水分子扩散运动有方向性, 反映的是扩散敏感梯度场方向上的扩散运动, 检测不出其他方向的运动。因此通常在多个方向施加扩散梯度场以反映组织在各个方面的水分子扩散情况。通过检测施加扩散敏感剃度场前后信号强度计算组织扩散系数[14,15]。但DWI组织信号强度会受到其他形式水分子运动的影响, 因此检测其并不能得到实际的扩散系数, 因此被称为表观扩散系数 (ADC) 。在本次研究中, 肾上腺肿瘤在DWI图像上的信号强度与ADC图像上的强度区别, 大多呈相反的表现, 在DWI图像上的高信号在ADC图像上可呈低信号。本次研究中采用的扫描序列为单次继发SE-EPI-DWI序列, 不施加扩散敏感梯度场获得T2WI图像, 在此基础上施加扩散敏感梯度场得到DWI图像。在本次研究中良性肿瘤与恶性肿瘤在不同的b值情况下ADC值均有显著差异, 良性肿瘤的ADC值显著高于恶性肿瘤, 这可以作为鉴别诊断的指标之一。相关性分析结果显示, ADC值与细胞密度具有显著的负相关的关系, 并且在b值在800 s/mm2的时候相关性最明显。细胞密度是肿瘤鉴别诊断以及病理分级判定的标准之一。既往研究显示随着肿瘤的生长, 坏死区ADC值明显升高, 而实性部分的ADC值保持不变, 这说明DWI可反应肿瘤组织的特征。

细胞密度 篇2

-对连年发生比较严重水华的官厅水库进行了2 a的浮游植物动态监测,并在206-8月应用酶联免疫吸附法检测了主要水华藻类--铜绿微囊藻藻毒素质量浓度及其季节变化,初步探讨了微囊藻毒素质量浓度与铜绿微囊藻细胞密度之间的.关系.实验结果表明,水库中的浮游植物细胞密度高,平均值为1 308.35×104 cells/L,年达1 599.49×104 cells/L,同时呈现出明显的季节变化,在夏末秋初形成高峰.产毒的铜绿微囊藻为夏季最主要的优势水华种类,其细胞密度在7月达到最高,为4 748.58×104 cells/L;微囊藻毒素的质量浓度在7月亦达到最高值,为20 μg/L,都显著高于6月和8月(p<0.05).水体中微囊藻毒素质量浓度与微囊藻细胞密度呈正相关关系(R=0.926).其结果为全面了解官厅水库水质状况以及对水污染进行治理,恢复其饮用水源的功能提供了科学依据.

作 者：张娟 梁前进 周云龙 包智泓 李启军 ZHANG Juan LIANG Qian-jin ZHOU Yun-long BAO Zhi-hong LI Qi-jun 作者单位：张娟,梁前进,周云龙,ZHANG Juan,LIANG Qian-jin,ZHOU Yun-long(北京师范大学生命科学学院,北京,100875)

包智泓,李启军,BAO Zhi-hong,LI Qi-jun(北京市水利科学研究所,北京,100044)

细胞密度 篇3

关键词 Sysmex XT1800i全自动血细胞分析仪 不精密度 总变异系数

S批间=0.71，CV批间=S批间/X×100%=1.9%；

S批内=0.45，CV批内=S批内/X×100%=1.2%；

S總=［(2S日间2+S批间2+S批内2)/2］0.5=0.90，CV总=S总/X×100%=2.41%。

HCT异常值标本：日平均值的均值X=48.2，离群点的检查：每次双份测定的差值最大是1.8，初步精密度测定时标准差的±5.5倍是±48.2×1.2%×5.5=±2.47，无离群点。

S日间=0.92，CV日间=S日间/X×100%=0.92/48.2×100%=1.9%；

S批间=0.87，CV批间=S批间/X×100%=1.8%；

S批内=0.68，CV批内=S批内/X×100%=1.4%；

S总=［(2S日间2+S批间2+S批内2)/2］0.5=1.21，CV总=S总/X×100%=2.51%。

PLT正常值标本：日平均值的均值X=215，离群点的检查：每次双份测定的差值最大是23，初步精密度测定时标准差的±5.5倍是±215×2.6%×5.5=±30.8，无离群点。

S日间=14.2，CV日间=S日间/X×100%=14.2/215×100%=6.6%；

S批间=13.3，CV批间=S批间/X×100%=6.2%；

S批内=11.4，CV批内=S批内/X×100%=5.3%；

S总=［(2S日间2+S批间2+S批内2)/2］0.5=18.9，CV总=S总/X×100%=8.79%。

PLT异常值标本：日平均值的均值X=493，离群点的检查：每次双份测定的差值最大是45，初步精密度测定时标准差的±5.5倍是±493×2.6%×5.5=±70.5，无离群点。

S日间=38.0，CV日间=S日间/X×100%=14.2/493×100%=7.7%；

S批间=37.0，CV批间=S批间/X×100%=7.5%；

S批内=29.6，CV批内=S批内/X×100%=6.0%；

S总=［(2S日间2+S批间2+S批内2)/2］0.5=50.7，CV总=S总/X×100%=10.28%。

结果及讨论

采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)制订的一套评价方案(evaluation protocols)，对检验科使用的XT1800i全自动血细胞分析仪及试剂组成的分析系统测定白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、血小板计数(PLT)进行了精密度的性能评价。根据参考文献的介绍［４］，血细胞分析检测项目精密度评价标准：设CLIA’88允许的总误差为TEa，则要求批内精密度CV%≤1/4TEa，批间和日间精密度CV%≤1/3TEa，总精密度CV%≤1/2TEa。通过以上评价步骤可知各项变异系数均在可接受范围之内，符合CLIA’88的指标要求。见表2。

精密度性能是检测系统的基本分析性能之一，它也是其他方法评价的基础。目前国内最普及的精密度评价方案存在缺陷，而NCCLS EP5-A2文件是目前精密度评价实验方案中最全面和最有统计学意义的［５］。严格按照文件要求操作，所采集的数据是可以真实反映仪器的精密度性能的，由上表结果可知XT1800i全自动血细胞分析仪性能优良，检测结果精密度高，重复性好，可满足我科室血液常规检验的要求。再参考文献的结论［６］：Sysmex XT1800i全自动血细胞分析仪的各项性能测试结果显示此仪器与常规镜检方法有很好的可比性。故它的应用降低了工作人员的劳动强度，提高了检测的精密度和准确性，是较理想的全自动血液细胞分析仪。

参考文献

1 NCCLS.EP5-A2 Evaluation Of Precision Performance Of Quantitative Measurement Methods;Approved Guide-line-Second Edition［S］.Wayne,PA:NCCLS,2004.

2 日本Sysmex XT1800i全自动血细胞分析仪操作手册(中文版).

3 叶应妩,王毓三,等.全国临床检验操作规程［M］.南京:东南大学出版社,2006.

4 冯仁丰.临床检验质量管理技术基础［M］.上海:上海科学技术文献出版社,2007:89.

5 黄福达,杨志钊,梁培松,杨山虹,张秀明.应用NCCLS EP5-A2文件评价CA7000全自动血凝仪的精密度［Ｊ］.检验医学与临床,2010,8(7～16):1710-1712.

细胞密度 篇4

关键词：浮游藻类,细胞密度,理化指标,太原汾河蓄水区

太原汾河蓄水区始建于1998 年, 经过15 年的建设, 已形成了北起柴村桥, 南至祥云桥, 共20. 3km的绿化长廊, 总面积约为1. 21 km2, 蓄水量2. 26× 106m3, 是目前太原市最大、最集中的公共绿地休闲场所和蓄水工程［1，2］。蓄水区的水质状况直接关系到城市景观和百姓生活。

然而, 对太原汾河蓄水区浮游藻类植物的研究还鲜有报道［3］, 对蓄水区浮游藻类细胞密度与气温、水温、DO、CODCr和CODMn等指标的相关性研究也尚未见报道, 其它景观水在该领域的研究也很少［4］。2012 年6 月至10 月, 作者对太原汾河蓄水区的浮游藻类细胞密度及部分理化指标进行了调查, 并分析了它们之间的性关性, 以期为该区域及其它景观水水质保护和水华暴发预警及防治提供指导。

1 调查方法

1. 1 采样点的设置

根据太原汾河蓄水区的自然地理情况, 设以下8 个采样点, 分别位于柴村桥 ( S1 ) 、胜利桥北 ( S2 ) 、胜利桥南 ( 1#池) ( S3) 、迎泽桥 ( 2#池) ( S4) 、南内环桥 ( 3#池) ( S5) 、长风桥 ( 4#池) ( S6) 、跻汾桥 ( 5#池) ( S7) 和南中环桥南 ( 6#池) ( S8) ( 图1) 。

1. 2 样品采集时间和理化指标测定

2012 年6 月至2012 年10 月, 对太原汾河蓄水区进行了34 次 ( 每周2 次) 浮游藻类采集和一些理化指标的测定。现场记录气温、水温和溶解氧 ( DO) 。参照有关文献中的方法测定高锰酸盐指数 ( CODMn) 和化学需氧量 ( CODCr) ［5］。

2 统计分析方法

采用Excel 2007 统计水温、气温、高锰酸盐指数 ( CODMn) 、化学需氧量 ( CODCr) 、溶解氧 ( DO) 和浮游藻类细胞密度。采用SPSS18. 0 软件对数据进行pearson相关系数及其双尾显著性分析, 统计各环境因子与浮游藻类细胞密度之间的相关性。采用Origin Pro8. 5 软件绘图。

3 结果和分析

3. 1 不同采样点细胞密度的比较

图2 是太原汾河蓄水区各采样点的浮游藻类细胞密度。可以看出, 除S1 细胞密度较为稳定, 变化幅度较小外, 其余各采样点均以7 月份的细胞密度较高, 但各点变化幅度和高峰出现时间不同。总体而言, 下游端较上游端浮游藻类生长旺盛, 这可能是由于周边支沟有些污染水体的汇入, 导致藻类细胞的迅速繁殖［6］。这也说明下游段发生水华的可能性较上游段大。

3. 2 不同采样点温度的动态变化

太原汾河蓄水区各采样点气温和水温的变化见图3。可以看出, 在调查期间, 8 个采样点的水温主要受气温的影响, 二者呈极显著正相关 ( P < 0. 01) 。6 ~ 8 月份温度较高且基本平稳, 9 月初开始温度明显下降。到10 月下旬可下降10 ℃以上。从图3 还可看出, 温度较高的6 ~ 8 月份也正是多数采样点浮游藻类细胞密度较高的时候, 尤其是7 月份, 这也在一定程度上说明, 在当地夏秋季的高温期也是水华易发期, 应特别注意采取防控措施。有研究报道, 水体中浮游藻类生长与环境温度关系密切［7—10］。本文的研究结果也与此一致。

3. 3 不同采样点DO、CODCr和CODMn的动态变化

太原汾河蓄水区各采样点溶解氧 ( DO) 、化学需氧量 ( CODCr) 和高锰酸盐指数 ( CODMn) 的变化见图4。可以看出, 在调查期间, 8 个采样点的DO变幅在0. 52 mg /L ~ 12. 8 mg /L之间, 最高值出现在S7, 最低值出现在S8, 多数样点以8 月份DO浓度最低。洁净的水中DO一般接近饱和, 如果水体受到有机物及还原性物质污染, 营养过剩加速浮游藻类生长, 则DO浓度降低［11，12］。由此可见, 8 月份时, 多数样点的水体污染较重, 特别是S8 ( 6 # 池) 。CODCr是衡量水体污染状况的重要指标, 值越大, 表明水体污染越严重［6，13］。调查期间, 8 个采样点的CODCr变幅在8. 66 mg /L ~ 61. 6 mg /L之间, 7 ~ 9 月份CODCr相对较高, 说明水体污染较为严重样点。S1 的CODCr总体低于其他样点, 而样点S7 和S8CODCr则高于其他样点, 说明蓄水区上游段污染较下游段轻。但9 月底样点S1 CODCr陡然上升, 原因很可能与局部有机废水排放的增加有关。CODMn也是衡量水体污染状况的重要指标, 从图4 可以看出, 其变化趋势与CODCr一致, 二者呈极显著正相关 ( P < 0. 01) ［13］。

3. 4 细胞密度与温度、DO、CODCr和CODMn的相关性分析

表1 是太原汾河蓄水区各样点浮游藻类细胞密度和温度、DO、CODCr和CODMn的相关性。由表1 可知, 多数样点浮游藻类细胞密度与气温、水温、CODCr和CODMn呈正相关, 而与DO呈负相关。其中, 有的样点浮游藻类细胞密度与部分理化因子相关性显著或极显著。总体分析, 温度和CODCr的变化与浮游藻类细胞密度关系更密切, 因此这几个因子在检测中应予以重视, 以便及时预防水华的发生。

**在0.01水平 (双侧) 上显著相关;*在0.05水平 (双侧) 上显著相关。

4 结论

( 1) 太原汾河蓄水区各采样点的浮游藻类细胞密度以7 月份较高, 各点变化幅度和高峰出现时间不同, 下游端较上游端浮游藻类生长旺盛。

( 2) 太原汾河蓄水区各采样点气温和水温变化一致, 6 ~ 8 月份温度较高, 9 月初开始明显下降。夏秋季的高温期是水华易发期, 应特别注意采取防控措施。DO、CODCr和CODMn的变化反映出8 月份时, 多数样点水体污染较重, 特别是S8 ( 6#池) 。

( 3) 太原汾河蓄水区多数样点浮游藻类细胞密度与气温、水温、CODCr和CODMn呈正相关, 而与DO呈负相关。总体分析, 温度和CODCr的变化与浮游藻类细胞密度关系更密切。

细胞密度 篇5

1 材料与方法

1.1 材料 ECV304细胞株 (中山大学细胞库) , 人类单核细胞系U937 (上海细胞生物研究所) ;RPMI-1640培养液 (美国GIBCO) ;胎牛血清 (美国GIBCO) ;低密度脂蛋白 (LDL, 美国SIGMA) ;单克隆抗体 CD106-FITC、CD54-PE、CD62E-PE、CD62P-PE、IgG-PE、IgG-FITC (均是美国PharMingen产品) ;流式细胞仪: (美国BECKMAN COULTE公司 ALTRA型) , 四色荧光, 配套EXPO 32采集分析软件。

1.2 ox-LDL的制备 将LDL置于含10 μmol/L CuSO4的PBS (pH7.2) 溶液中, 37 ℃温育24 h, 再将ox-LDL液置含200 μmol/L EDTA的PBS 4 ℃中透析24 h, 超滤除菌后4 ℃保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法检测不同浓度ox-LDL对细胞活性的影响 细胞以5×104个/mL细胞数接种入96孔培养板, 待细胞生长至稳定状态 (约24 h) , 分别加入ox-LDL高浓度组 (100 μg/mL) 、中浓度组 (50 μg/mL) 、低浓度组 (25 μg/mL) , 正常对照组加等量生理盐水, 置于37 ℃、5%CO2、95%空气的培养箱培养24 h后, 每孔加入10 g/L的MTT 10 μL, 培养4 h, 弃去培养基, 每孔加入150 μL二甲基亚砜 (DMSO) , 置微量振荡器上振荡10 min, 酶标仪 (波长570 nm) 测定吸光值 (OD) , 筛选ox-LDL适宜作用浓度。

1.3.2 ox-LDL对血管内皮细胞黏附分子表达的影响 将ECV304细胞接种于24孔板, 待细胞生长至稳定状态 (约24 h) , 加入50 μg/mL ox-LDL, 对照组加等量生理盐水, 置于37 ℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养, 24 h后, 移去培养液, 每孔加入含4×104人类单核细胞系U937细胞培养基细胞悬液, 37 ℃孵育30 min, 移去培养液, 用PBS轻洗2遍, 去除未黏附的细胞, 用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液消化收集细胞, 测定细胞间黏附分子-1 (ICAM-1, CD54) 、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1, CD106) 、E-选择素 (CD62E) 和P-选择素 (CD62P) 。

1.4 FCM检测VCAM-1、ICAM-1、CD62E、CD62P的表达率 收集上述单细胞悬液, PBS洗两次, 分别加入 CD106-FITC、CD54-PE、CD62E-PE、CD62P-PE单克隆抗体各10 μL, 室温避光孵育30 min后, PBS洗2遍, 流式细胞仪检测, 其结果以阳性百分率表示。每份样本均设阴性对照 (加相应IgG抗体) , 以消除本底荧光的影响。

1.5 统计学处理 用SPSS16.0软件进行t检验, 数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。

2 结 果

2.1 MTT检测结果

ox-LDL作用的各组细胞活性均下降, 与正常组比较, 高、中浓度组有统计意义 (P<0.05) , 而低浓度组无统计意义, 提示50 μg/mL ox-LDL为适宜的作用浓度。详见表1。

2.2 ox-LDL对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

ox-LDL作用损伤组细胞表面黏附分子VCAM-1、ICAM-1、CD62E、CD62P表达率均明显增高, 与正常组比较有统计学意义 (P<0.01) 。详见表2。

3 讨 论

AS是危害人类健康最大的疾病之一, 是心脑血管病的主要病理基础, 其发病机制复杂, 尚未完全阐明。自Ross提出AS发病机制的“损伤反应”学说至今, VCE损伤在AS的形成与发展中的地位日趋受到关注。在AS解剖学证据出现之前已有内皮功能紊乱的表现[3,4], 而VEC功能紊乱是AS发病的早期关键性环节[5]。

ox-LDL是AS明确的危险因子, 动脉壁中ox-LDL的存在是造成动脉壁持续损伤重要因素之一, ox-LDL可直接损伤内皮细胞, 通过信号传导通路改变内皮细胞分泌活性, 介导单核细胞对内皮细胞的黏附, 导致内皮细胞的损伤[6,7]。人AS的斑块中有ICAM-1的表达, 并在AS的病理过程中起重要作用[8]。高血脂患者血中的可溶性的ICAM-1、VCAM-1均升高, 认为血中可溶性ICAM-1、VCAM-1是反应动脉粥样硬化的早期变化指标[9]。MC-EC黏附是内皮细胞功能受损而处于激活状态的表现之一, 两种细胞黏附不仅是物理接触, 而且涉及MC、EC细胞表面诸多分子之间的相互作用, 在相互作用过程中两种细胞的功能均发生相应变化, 促进细胞CAMs表达, 而CAMs介导的炎症细胞与血管内皮细胞的黏附及损伤作用, 被认为是AS重要的始动环节, 可作为炎症活动的指标[2,10]。本实验采用对U937- ECV304联合培养的方法, 用ox-LDL为诱导损伤因素, FCM进行分析ECV304细胞表面VCAM-1、ICAM-1、E-选择素、P-选择素的表达, 探讨ox-LDL致VEC损伤机制;结果显示, ox-LDL促使内皮细胞CAMs表达明显上调, 提示ox-LDL在内皮细胞黏附分子合成或诱导过程中扮演了较为重要的角色, ox-LDL刺激诱导内皮细胞CAMs表达增高, 而CAMs的高表达, 又促进单核细胞黏附于内皮细胞, 影响血管内皮细胞功能, 参与AS化的形成和发展。

VEC是多种危险因子作用的重要靶器官。Ox-LDL通过介导单核细胞和血管内皮细胞黏附, 上调血管内皮细胞CAMs的表达, 致内皮细胞功能紊乱, 损伤VEC。阻断或抑制ox-LD对内皮细胞功能的损害, 能有效预防、治疗心血管疾病的发生、发展。

摘要：目的 观察氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 对人脐静脉内皮细胞 (ECV304) 细胞黏附分子 (CAMs) 表达的影响, 探讨ox-LDL损伤血管内皮细胞 (VEC) 的作用及机制。方法 采用人类单核细胞系 (U937) -ECV304联合培养的方法, ox-LDL为诱导损伤因素, 用流式细胞术 (FCM) 测定ECV304细胞表面细胞间黏附分子-1 (ICAM-1, CD54) 、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1, CD106) 、E-选择素 (CD62E) 和P-选择素 (CD62P) 的表达率。结果 ox-LDL促进CAMs表达, 与正常对照组比较有统计学意义 (P<0.01) 。结论 ox-LDL诱导促进内皮细胞表面黏附分子表达, 导致VEC损伤, 参与动脉硬化 (AS) 的发生、发展。

关键词：动脉硬化,氧化低密度脂蛋白,人脐静脉血管内皮细胞株,细胞黏附分子

参考文献

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[2]Dai G, Kaazempur-Mofrad MR, Natarajan S, et al.Distinct endo-thelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from ath-erosclerosis-susceptible and resistant regions of human vascula-ture[J].PNAS, 2004, 101 (41) :14871-14876.

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细胞密度 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年8月~2015年1月在沈阳市第四人民医院确诊的糖尿病合并白内障患者15例 (15只眼) 和年龄相关性白内障患者15例 (15只眼) , 分别为糖尿病组 (糖尿病合并白内障患者) 与对照组 (年龄相关性白内障患者) 。糖尿病组男8例、女7例, 年龄55~65岁, 平均年龄 (60.5±3.3) 岁。对照组男10例、女5例, 年龄55~65岁, 平均年龄 (61.8±2.9) 岁。所有入组患者的晶体核硬度均为Emery三级核硬度, 即晶状体核呈深黄色, 中等硬度核, 符合白内障手术适应证而无手术禁忌证, 未发生术中或术后严重并发症。两组性别、年龄等一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 检查方法

所有患者的共聚焦显微镜 (Heidelberg Gmb H, Germany) 检查均由同一名有经验的技师操作, 图片分析均由另一名医师完成。观察并记录患者的术前、术后1周、术后1个月和术后3个月中央区角膜前基质层 (选取前弹力层后方40μm范围) 细胞密度和后基质层 (选取后弹力层前方30μm范围) 细胞密度。

1.3 白内障超声乳化手术及术后处理

所有患者的超声乳化白内障吸除术均由同一名眼科医师完成, 均应用超声乳化仪 (Accurus 800CS, Alcon, 美国) 、同一品牌眼内冲洗灌注液 (Balanced salt solution, Bausch&Lomb lncorporated) 等。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验;对两组不同时间点的角膜前基质层细胞密度和后基质层细胞密度的数据分析采用重复测量资料的方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 角膜前基质层细胞密度变化

两组术前、术后1周、术后1个月、术后3个月角膜前基质层细胞密度 (个/mm2) :糖尿病组: (609±129) 、 (591±114) 、 (589±106) 、 (601±108) ;对照组: (645±119) 、 (624±120) 、 (651±113) 、 (648±127) 。两组术前、术后1周、术后1个月和术后3个月组间比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。不同分组与不同时间点不存在交互效应 (P=0.262>0.05) 。两组术后3个时间点分别与术前组内比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.2 角膜后基质层细胞密度变化

两组术前、术后1周、术后1个月、术后3个月角膜后基质层细胞密度 (个/mm2) :糖尿病组: (321±39) 、 (289±50) 、 (298±44) 、 (319±38) ;对照组: (349±50) 、 (321±45) 、 (332±52) 、 (345±57) 。两组术前、术后1周、术后1个月和术后3个月组间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。不同分组与不同时间点不存在交互效应 (P=0.932>0.05) 。对照组术后1周角膜后基质层细胞密度较术前明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 术后1个月和术后3个月角膜后基质层细胞密度较术前差异无统计学意义 (P>0.05) ;糖尿病组术后1周和术后1个月角膜后基质层细胞密度较术前明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 术后3个月角膜后基质层细胞密度较术前变化差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

与传统的光学共焦显微镜相比, 激光共焦显微镜具有许多优势: (1) 由于激光特有的单色性和相干性[4], 使图像清晰, 分辨率高至1μm, 极大提高了对角膜尤其是角膜缘疾病的诊断和基础研究的水平。 (2) 可以对病变进行确切的深度定位, 可重复性好, 有利于病变的前后对比。 (3) 提供多种图像获取模式, 不仅可对同一焦平面进行动态连续扫描, 而且实现了时间与空间的动态观察等。

角膜基质全层细胞密度与年龄相关, 平均每年减少0.45%[5,6], 本研究中, 两组之间年龄比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 所以年龄这一因素对实验没有影响。有研究表明, 角膜基质细胞位于角膜基质胶原纤维板层之间, 在角膜损伤修复过程中有着不可替代的作用[7]。Müller等[8]用透射电镜观察尸体角膜, 发现角膜前基质细胞具有较强的新陈代谢能力和携氧能力, 其组织学特征与角膜损伤后的修复有关。

术前糖尿病组和对照组的角膜后基质层细胞密度组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 这与Bitirgen[9]和Quadrado等[10]的研究结果相一致。行白内障超声乳化术时器械反复进入前房造成的机械损伤、超声能量的热损伤、晶状体核碎片及前房灌注液的大量冲洗、粘弹剂的应用, 加上患者的自身因素 (晶体硬度、合并疾病) , 均会对角膜产生影响[11]。本研究发现对照组术后1周时角膜后基质层细胞密度较术前减少, 这与赵江月等[12]研究结果相类似。Müller等[13]研究表明角膜基质细胞是由基质的神经纤维直接支配, 角膜神经对细胞有非常重要的营养作用, 而糖尿病患者的角膜神经易发生数量的减少、变性[14]和角膜内皮功能障碍, 因而角膜后基质层细胞对手术损伤的耐受力降低, 更易受到损伤, 造成角膜后基质层细胞密度降低。

由于后基质层比前基质层更接近于前房, 所以角膜后基质层细胞对手术超声能量的刺激更为敏感。Kim等[15]研究发现糖尿病组糖化终产物 (AGEs) 在角膜组织中蓄积, 8-羟基脱氧鸟苷抗体 (8-OHd G) 和核因子-κB (NF-κB) 可以在角膜上皮、基质层和内皮层检测到, 并且明显高于正常对照组, 这些因素可能与角膜细胞凋亡和组织形态的改变有很大关系。Hatou等[16]研究发现, 胰岛素增加了Na+-K+-ATP酶的活性, 提高了角膜内皮细胞泵的功能。糖尿病患者胰岛素水平会有不同程度的下降, 推测糖尿病患者内皮细胞的功能也会有不同程度降低。因此本研究中, 糖尿病组患者可能存在内皮细胞密度减少和“泵”的功能降低, 导致角膜内皮功能障碍, 从而致使角膜后基质层细胞受损。

综上所述, 超声乳化白内障吸除术对角膜后基质层细胞的密度变化有一定影响, 糖尿病合并白内障的患者手术后角膜后基质层细胞密度恢复较对照组慢。虽然糖尿病合并白内障的患者相对非糖尿病患者对手术的耐受性较低, 手术风险较高, 术后恢复慢, 但患者全身状况良好和合理控制血糖时, 手术也是安全可行的, 除此之外, 术前还要充分评估该患者能否承受手术所造成的创伤, 术中注意操作轻柔, 尽量避免手术器械对角膜的损伤, 术后更要关注糖尿病患者角膜水肿的情况, 避免发生严重的角膜病变。

摘要：目的 了解糖尿病患者白内障超声乳化吸除术前后角膜基质层细胞密度变化的情况。方法 30例 (30只眼) 进行超声乳化吸除术的白内障患者, 其中糖尿病合并白内障患者 (糖尿病组) 与年龄相关性白内障患者 (对照组) 各15例 (15只眼) 。应用共聚焦显微镜测量患者术前、术后1周、术后1个月和术后3个月角膜前基质层细胞密度和后基质层细胞密度并进行统计分析。结果 前基质层细胞密度:两组术前、术后1周、1个月、3个月组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;两组各自组内术后3个时间点分别与术前比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。后基质层细胞密度:两组术前、术后1周、术后1个月和术后3个月组间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。对照组术后1周角膜后基质层细胞密度较术前减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 术后1个月和术后3个月与术前比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;糖尿病组术后1周和术后1个月角膜后基质层细胞密度较术前减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 术后3个月与术前比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 白内障超声乳化手术对两组角膜前基质层细胞密度影响均不明显;手术对两组角膜后基质层细胞密度影响较明显;两组角膜后基质层细胞密度在术后3个月均恢复到术前水平, 糖尿病组患者术后细胞密度恢复较对照组慢。

细胞密度 篇7

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2007-04~2011-05开滦总医院收治的经病理证实的33例星形细胞瘤患者, 其中低级别星形细胞瘤 (WHOⅠ~Ⅱ级) 18例, 高级别星形细胞瘤 (WHOⅢ~Ⅳ级) 15例。低级别星形细胞瘤组男7例, 女11例;年龄27~68岁, 平均 (48.5±7.5) 岁;高级别星形细胞瘤组男9例, 女6例;年龄22~57岁, 平均 (43.5±6.5) 岁。两组年龄、性别差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 ADC值测量

采用GE 1.5T超导型MR扫描仪, 检查顺序为:常规扫描、DWI、增强扫描。常规扫描参数:自旋回波 (SE) T1WI:TR/TE 2126/22 ms;快速恢复快速自旋回波 (FRFSE) T2WI:TR/TE 4300/102 ms;MRI液体衰减反转恢复 (FLAIR) 序列:TR/TE 8502/125 ms。采用头颅正交线圈, 层厚6 mm, 层间隔1 mm, 重建视野24 cm×24 cm, 距阵320×224。DWI采用SE序列平面回波成像, TR/TE 6000/76 ms。在读出 (Read) 、相位 (Phase) 编码和层面 (Slice) 选择3个方向上施加扩散梯度, b值取0、1000 s/mm2。轴位扫描层厚6 mm, 层间隔1 mm, 视野 (FOV) 24 cm×24 cm, 距阵128×128, 成像时间64 s。增强扫描采用钆喷替酸葡甲胺作为造影剂, 经肘静脉注入后行T1WI轴位、冠状位、矢状位扫描。采用头颅正交线圈, 层厚6 mm, 层间隔1 mm, FOV 24 cm×24 cm, 距阵320×224。在图像浏览器中选择“弥散扫描”, 点击“Functool 2”图表, 点击“ADC”按键, 进入弥散图像后处理界面, 调节原始图像到合适的窗宽、窗位。调节阈值后, 在同一屏幕上同时生成ADC图、e ADC图和原始的DWI取样图层。感兴趣区 (ROI) 放置于肿瘤实质内, 并尽量保持同一患者ROI的外形、大小和解剖位置一致。将e ADC图替换为T1WI增强扫描、FLAIR或T2WI FRFSE序列的取样图层, 可以使ROI更准确地放入肿瘤实质内。ROI为20~40 mm2, 测量3次ROI的ADC值取平均值;对照侧ROI选择与肿瘤相对应部位的对侧脑白质, 测量3次ADC值取平均值。

1.3 肿瘤细胞密度测定

由2名病理学主任医师采用双盲法在光镜下根据最新WHO分级标准[3]对肿瘤病理进行分级, 同时摄取典型病理图片。采用Scion Image 4.0.3.2软件对病理照片进行分析, 计算单位面积肿瘤组织中肿瘤细胞面积所占百分比, 即肿瘤组织的细胞密度构成。

1.4 免疫组化检查

采用免疫组化法检测与MRI资料相对应的星形细胞瘤标本中的HIF-1α表达状况, 按上海长岛生物技术有限公司提供的免疫组化试剂盒说明书进行操作。HIF-1α购自武汉博士德生物工程有限公司, 浓度为1︰50。HIF-1α以细胞核有浅黄色、棕色、棕褐色颗粒为阳性细胞, 每张切片分别在上、下、左、右和中心区各随机选择一个高倍视野 (×400) , 计算肿瘤细胞密度值。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0软件, 低级别和高级别星形细胞瘤组平均ADC值、平均细胞密度值、HIF-1α标记指数比较采用t检验, ADC值、r ADC值、细胞密度值及HIF-1α标记指数的相关性采用Pearson相关分析, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 星形细胞瘤的影像学特点

低级别星形细胞瘤边界清楚, 肿块信号均匀, 见图1。高级别星形细胞瘤边界不清楚, 肿块信号不均匀, 见图2。

图1患者男, 40岁, 低级别星形细胞瘤。肿瘤边界清楚, 肿块信号均匀。A为T1WI图像, B为T1WI增强图像, C为DWI图像, D为ADC图像

图2患者女, 61岁, 高级别星形细胞瘤。肿瘤边界不清楚, 肿块信号不均匀。A为T1WI图像, B为T1WI增强图像, C为DWI图像, D为ADC图像

2.2 MRI测量结果与星形细胞瘤病理分级的关系

低级别星形细胞瘤肿瘤实质部分的平均ADC值为 (1619.24±376.22) ×10-3mm2/s, 高于高级别星形细胞瘤的 (954.29±80.63) ×10-3mm2/s, 差异有统计学意义 (t=7.300, P<0.001) 。高级别星形细胞瘤平均细胞密度值为 (20.13±0.10) %, 明显大于低级别星形细胞瘤的 (9.36±5.38) %, 差异有统计学意义 (t=-3.845, P<0.01) 。正常脑组织中未见HIF-1α表达, 低级别和高级别星形细胞瘤中均有HIF-1α表达, 低级别星形细胞瘤的平均HIF-1α标记指数为 (20.08±10.01) %, 高级别星形细胞瘤为 (47.91±19.03) %, 差异有统计学意义 (t=-5.104, P<0.001) 。

2.3 各测量指标间的相关性

肿瘤ADC值与HIF-1α标记指数、肿瘤细胞密度值呈负相关 (r=-0.756、-0.617, P<0.001) , HIF-1α与肿瘤细胞密度呈正相关 (r=0.622, P<0.001) 。

3 讨论

常规CT及MRI检查难以定量反映星形细胞瘤的成分及微结构状态, DWI使MR对人体的研究深入到了更微观的水平。脑组织中水分子的扩散大小和方向取决于扩散屏障的通透性、空间、介质的黏滞度及观察时间, 同时受毛细血管血流、组织细胞对水的主动转运过程等因素的影响[4]。星形细胞瘤肿瘤组织取代正常脑组织, 肿瘤组织的细胞间隙影响间质水分子扩散, 肿瘤细胞密度越高, 间质成分越少, 则组织中水分子扩散运动越弱, 反之亦然。本研究结果表明, 高级别和低级别星形细胞瘤的ADC值与组织中的细胞密度值呈显著负相关关系, 高级别肿瘤生长活跃, 细胞密度高, ADC值小;低级别肿瘤生长缓慢, 细胞密度低, ADC值大。虽然肿瘤囊变或坏死可能会使ADC值上升, 但是本研究在计算ADC值时, 参照既往避开肿瘤囊变或坏死部位的方法[5], 通过T1WI强化、T2WI及FLAIR序列成像图像对比, 避开了囊变或坏死部位。但经计算得出的星形细胞瘤的肿瘤实质部分ADC值与细胞密度值仅中度相关 (r=-0.617) , 可能是由于除了细胞构成比之外还有其他因素影响肿瘤的ADC值, 比如肿瘤基质、纤维成分或胶质成分等[6]。然而, 活体肿瘤细胞密度是影响肿瘤内水分子扩散的关键因素, 星形细胞瘤中水分子的扩散主要受细胞密度的影响, 肿瘤实质部分ADC值越低, DWI上信号越高, DWI可以在一定程度上反映星形细胞瘤的分子生物学相关行为。

缺氧是一种普遍的生理和病理现象, 无法调控地增殖是肿瘤细胞的主要特征, 其侵袭性生长方式及转移依赖新生血管网的产生, 肿瘤因为细胞密度增加, 组织增生过快必然导致局部组织低氧、低糖和酸性, 为适应缺氧微环境, 肿瘤组织形成多血管体系, 同时使肿瘤更具侵袭性[7]。HIF-1α是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子, 是肿瘤血管生成的核心调控因子。星形细胞瘤的浸润性生长导致局部缺氧微环境, HIF-1α在低氧应激中发挥抗凋亡蛋白的作用。本研究中, HIF-1α在正常脑组织中不表达, 在低级别和高级别星形细胞瘤中均表达, 且其表达强度随星形细胞瘤病理级别的升高而增强。本研究中HIF-1α标记指数与肿瘤细胞密度值呈明显正相关, 与ADC值呈明显负相关, 表明HIF-1α与肿瘤细胞恶性增殖有关。肿瘤区ADC值与HIF-1α标记指数、肿瘤细胞密度值呈显著负相关, 表明脑DWI是星形细胞瘤诊断与病理分级的重要方法。肿瘤的无限增殖逐渐加重缺氧状态, HIF-1α表达水平增加, 促进促红细胞生成素转录表达, 进而促进肿瘤细胞繁殖。细胞繁殖越旺盛、密度越高、生物膜结构对水分子的扩散限制作用越明显, ADC值越低, DWI上信号越强。迄今为止, HIF-1α已确定的靶基因至少有60多种, 涉及细胞的能量代谢、血管生成等, 为低氧的肿瘤细胞提供能量, 从而增强肿瘤细胞的生存能力。糖酵解系统中磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶M、乳酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇化酶-1等基因调控序列上均存在HIF-1α结合位点, HIF-1α通过增强这些基因的表达, 提高葡萄糖转运、糖酵解, 促进肿瘤细胞分裂增殖和向恶性转化[8]。本研究涉猎神经肿瘤学与神经影像学交叉学科, 国内外相关报道较少。

总之, ADC值可以初步判定星形细胞瘤性质, 对低级别和高级别星形细胞瘤有一定的鉴别价值, 有助于术前诊断, 应进一步推广使用。低氧是肿瘤微环境改变的特征, HIF-1α是调节细胞适应低氧的转录激活因子, 通过不同途径使肿瘤细胞适应低氧微环境, 在肿瘤细胞密度增殖中发挥着重要作用, 应进一步深入研究HIF-1α在星形细胞瘤中的作用。

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细胞密度 篇8

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器

CO2孵箱 (HERA cell 150) , 倒置显微镜 (Nikon TS100, 日本) , 超净工作台 (LONGHONG, 中国) , 恒温水浴箱 (HS-4, 成都仪器厂) , 低温台式离心机 (Labofuge 400R, Heraeus) , FACSCalibur流式细胞仪 (美国BD公司) 。

1.1.2 实验试剂

人 THP-1单核细胞购自中科院上海细胞库。ox-LDL由北京医科大附属医院实验室馈赠。RPMI1640培养基 (GIBCO公司, 美国) , 10%胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司) , 胰蛋白酶 (solarbio, Spain) , PMA (Sigma, 美国) , 鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均购自Santa Cruz美国公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与诱导

将人THP-1单核细胞悬浮于含10%胎牛血清的1640培养液中, 在5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中静置培养。在光学显微镜下可见细胞呈球形, 悬浮状态。视细胞生长情况进行传代、换液, 选择生长良好的第3代～第5代细胞用于实验。实验前在培养液中加入终浓度为100 mmol/L的PMA孵育48 h, 诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。在光学显微镜下可见细胞转化为贴壁状态, 并伸出伪足, 呈现巨噬细胞形态。

1.2.2 实验分组

对照组:细胞置1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。ox-LDL组:在细胞培养瓶中分别加入ox-LDL (25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL) 在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养48 h。在细胞的培养瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养24 h、48 h、72 h。

1.2.3 细胞凋亡的检测

采用Annexin V-FITC/PI双标记染色法进行检测, 分组分孔收集细胞 (1×106个) , 1 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 每管用200 μL PBS重悬成单细胞悬液。加入10 L Annexin V-FITC和5 L PI, 加入300 L Binding Buffer轻轻混匀, 避光室温反应15 min, 流式细胞仪检测, 以凋亡的巨噬细胞占巨噬细胞总数的百分比为凋亡率。

1.2.4 Western blot测GRP78、Caspase-12、CHOP的表达

分组分孔收集细胞 (1×106个) , 进行免疫印迹法 (Western Blot) 检测GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达。将每管细胞洗涤, 离心, 用细胞裂解液裂解细胞, 在其中加入等体积的样品缓冲液混匀, 沸水煮沸5 min, 使蛋白质变性, 将蛋白质分装并冻存于-70 ℃冰箱中保存。取样品蛋白质100 μg, 用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭, 依次加入一抗4 ℃孵育过夜, 二抗孵育2 h后, ECL发光液孵育5 min后, 置于图像分析系统进行图像扫描及强度分析。

1.2.5 统计学处理

所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 使用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析, 多重比较采用LSD法, P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 ox-LDL对THP-1细胞凋亡的影响

各组细胞经流式细胞仪检测结果发现, 对照组细胞生长良好, ox-LDL处理的细胞则出现凋亡细胞。与对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05) 。ox-LDL组细胞凋亡率呈现剂量和时间依赖性, 随着作用时间的延长和浓度的增加, 凋亡呈递增变化。详见表1、表2。

与对照组比较, 1) P<0.05;与50μg/mL比较, 2) P<0.05;与75μg/mL比较, 3) P<0.05

与0 h比较, 1) P<0.05;与24 h比较, 2) P<0.05;与48 h比较, 3) P<0.05

2.2 各组细胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达

常规培养的对照组无GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达, 用50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL浓度的ox-LDL培养细胞48 h后 GRP78、CHOP、Caspase-12表达均增加。详见图 1。

注:1为对照组, 2为50 μg/mL组, 3为100 μg/mL组, 4为200 μg/mL组。

3 讨论

细胞凋亡是动脉粥样硬化病变的主要特征之一, 其中巨噬细胞凋亡贯穿动脉粥样硬化的整个过程。巨噬细胞泡沫化及其最终凋亡的过程中泡沫细胞聚集坏死形成脂核并使其不断增大, 导致临床事件发生[5]。内质网是细胞内蛋白质折叠和钙离子存储的主要场所, 对多种生理功能的完成具有重要意义。然而, 细胞内外环境的改变导致内质网腔内氧化环境被破坏, 钙代谢紊乱, 突变的蛋白质产生或蛋白质的二硫键不能形成, 大量异常的蛋白质聚集在细胞内, 内质网的稳态失衡, 这种内质网功能紊乱状态被称为内质网应激[6]。 GRP78被认为是内质网稳态的中心调节剂, 也被认为是内质网应激的标志, 但是过强或时间过长的内质网应激可能会导致细胞死亡[7]。 Caspase-12 激活是触发内质网应激相关凋亡途径的重要信号转导通路。 Caspase-12 以酶原形式存在于内质网膜胞浆侧, 在ERS 时被特异激活而诱导细胞凋亡[8]。CHOP也是触发内质网应激相关凋亡途径的重要信号转导通路。CHOP 又称生长停滞及DNA 损伤基因 (Growth Arrestand DNA Damage Induciblegene 153, GADD 153) , 存在于细胞浆内, 在ERS 时被活化转位至细胞核, 通过下调Bcl-2 表达而促进细胞凋亡。 本实验以不同浓度的ox-LDL与THP-1细胞共同培养不同时间, 结果发现ox-LDL以时间和浓度依赖的方式诱导THP-1细胞的凋亡。ox-LDL浓度为100 μg/mL作用48 h最明显。随着时间的延长和浓度增加THP-1细胞凋亡呈递增后递减变化。内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径, 用ox-LDL培养人THP-1细胞并检测Caspase12、CHOP、GRP78蛋白的变化来探讨ox-LDL是否通过内质网应激途径诱导细胞凋亡。结果发现100 μg/mL 的ox-LDL作用于细胞48 h后, GRP78、Caspase-12、CHOP的表达都明显增加, 提示ox-LDL可以通过内质网应激引发细胞凋亡。 不同于线粒体介导的凋亡途径, ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路, 称为内质网相关性死亡 (ER-associated death, ERAD) 途径, 而且参与ERS 的分子伴侣和感受蛋白是ERS 特异诱导的, 因此能够作为治疗相关疾病的有效靶点。

摘要：目的 探讨氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 对培养的人单核巨噬细胞 (THP-1) 凋亡的影响, 并进一步探讨其凋亡产生的机制。方法 体外培养的人THP-1单核细胞经PMA诱导48 h, 使形成巨噬细胞, 将分化良好的巨噬细胞分别用不同浓度ox-LDL (0100μg/mL) 培养48 h和用75μg/mL ox-LDL培养THP-1细胞不同时间 (072 h) 。应用Annexin-V和碘化丙锭双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡, 用Western-bolt法检测GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达。结果 ox-LDL处理后的细胞凋亡率增加, 并且呈时间和剂量依赖性, 随着作用时间的延长和浓度的增加, 凋亡呈递增变化, 同时检测到GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达都增加。结论 ox-LDL可诱导THP-1细胞凋亡, 其凋亡机制有内质网应激途径的参与。

关键词：氧化低密度脂蛋白,THP-1细胞,细胞凋亡,内质网应激

参考文献

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[5]Tabas I.Signal transduction pathways in free cholesterol-loadedmacrophages:Cell biological insight into the progression of athero-sclerosis[J].International Congress Series, 2004, 1262:392-395.

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细胞密度 篇9

1材料与方法

1. 1实验动物

无特定病源体( specefic pathogen free,SPF) 级健康SD大鼠,雌性,40只,体质量( 200 ± 20) g,3月龄,广州中医药大学动物实验中心提供。动物合格证书号: SCXK( 粤) 2013-0020。

1.2实验药品

骨疏颗粒由狗脊30 g、骨碎补15 g、淫羊藿10 g、熟地15 g、杜仲20 g、知母10 g、黄芪20 g、白术10 g、苍术10 g、三七粉3 g、羌活10 g、独活10 g,共12味药组成,为颗粒剂,由广州中医药大学制剂中心制备; 戊酸雌二醇片( 商品名: 补佳乐,拜耳医药保健有限公司广州分公司,生产批号069A2) ; 注射用青霉素 ( 华北制药 股份有限 公司,生产批号J3048403) 。

1.3主要试剂与仪器

大鼠TNF-α 试剂盒( 联科生物技术有限公司, 生产批号238240523) ; 大鼠IL-1β 试剂盒( 联科生物技术有限公司,生产批号2301B40534) ; 大鼠IL-6试剂盒 ( 联科生物 技术有限 公司,生产批号230640433) ; AL204-IC电子分析天平( 梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ; Multiscan Mk3-酶标仪( 美国BIO-RAD550) ; 辽制00000131-1普通电子天平 ( 沈阳龙腾电子公司) ; 移液器( EPPENDORF) ; XW-80A旋涡混合器( 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司,) ; XK96-3型微量振荡器( 姜堰市新康医疗器械有限公司,) ; 双能X线吸收骨密度仪( 美国通用电气公司) ; F80超低温冰箱( SANYO公司) 。

1.4动物分组及模型建立

将SD雌性大鼠按随机数字表法分为空白组及模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组4组。每组10只。各组大鼠经10% 水合氯醛 腹腔注射 麻醉, 0. 3 m L /100 g体重,仰卧位固定。75% 酒精消毒,沿下腹正中线切口2 ~ 3 cm。先将模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组“Y”型子宫角曝露,然后结扎子宫角,切除双侧卵巢,空白组只切除卵巢周围少许脂肪组织,逐层关闭,缝合切口。术后连续肌注青霉素3天,40000 u /只。模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组连续阴道涂片2个性周期,示阴道上皮无性周期变化,提示卵巢切除成功。术后所有大鼠在室温22. 5 ~ 24℃ 及湿度53% ~ 54. 5% 的SPF级饲育室饲养。实验过程中,空白组及模型组各脱落1例; 戊酸雌二醇组脱落2例。空白组、模型组及戊酸雌二醇组各1只大鼠于术后出现肠胀气,肠梗阻死亡; 戊酸雌二醇组1只误灌药入肺死亡。

1.5给药方法

术后第4天开始给药,灌胃的剂量按人与大鼠体表面积比折算成大鼠等效剂量。空白组灌服蒸馏水1 m L/100 g。模型组按1 m L/100 g灌服蒸馏水,戊酸雌二醇组按0. 05 mg /( m L·100 g) 给药,骨疏颗粒组按0. 3 g /( m L·100 g) 给药。每日上午灌胃1次,连续灌胃12周。

1.6检测指标

实验大鼠在最后一次灌胃后,禁食12小时,自由饮水。经10% 水合氯醛按0. 3 m L/100 g体重腹腔麻醉,卧位固定,75% 酒精消毒腹部皮肤,腹主动脉取血。4℃ 静置30分钟后,以3000 rmp离心15分钟,分离血清,分装入Eppendorf管,标号,- 20℃ 保存。检测时常温下解冻血清,酶联免疫吸附法检测IL-1β、IL-6及TNF-α。分离左侧股骨,剥离肌肉、 肌腱等组织,用0. 9% 生理盐水湿润纱布,包裹离体股骨,- 80℃冰箱保存,用于骨密度测定。

1.7统计学处理

实验数据采用SPSS 15. 0统计软件进行处理, 实验结果以均数 ± 标准差(  ± s) 表示,各组数据符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析( OneWay ANOVA) 进行分析,组间两两比较采用LSD分析,P < 0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2.1对左股骨骨密度的影响

组间比较采用单因素方差分析,组间差异有统计学意义( P < 0. 01) 。与空白组比较,模型组骨密度显著降低( P < 0. 01) ,差异有统计学意义; 与模型组比较,戊酸雌二醇组骨密度显著增加( P < 0. 01) , 骨疏颗粒组骨密度增加( P < 0. 05) ,差异均有统计学意义,具体见表1。

注: 与空白组比较,aP < 0. 01; 与模型组比较,bP < 0. 05,cP < 0. 01

2.2对血清细胞因子的影响

采用单因素方差分析对各组间IL-1β、IL-6及TNF-α 进行统计学分析,IL-1 β 组间差异有 统计学意义( P < 0. 01 ) ,IL-6组间差异 有统计学 意义 ( P < 0. 05 ) ,TNF-α 组间差异 有统计学 意义 ( P < 0. 05) 。采用LSD分析进行组间两两比较, 与空白组比 较,模型组IL-1β 及IL-6显著增加 ( P < 0. 01) ,TNF-α 增加( P < 0. 05) ,差异均有统计学意义; 与模型组比较,戊酸雌二醇组IL-1β 显著降低( P < 0. 01) ,IL-6及TNF-α 均降低( P < 0. 05 ) ,差异均有统计学意义; 与模型组比较,骨疏颗粒组IL-1β、IL-6及TNF-α 均降低( P < 0. 05) ,差异均有统计学意义( P < 0. 05) ,具体见表2。

3讨论

绝经后骨质疏松症(Ⅰ型) 是指因为雌激素急剧下降导致的以骨吸收增强、骨量减少、骨脆性增加、骨显微结构退化为特征,易于发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病[9]。目前,骨质疏松症大鼠模型的制作方法主要有维甲酸灌胃、切除卵巢和灌服糖皮质激素造模3种。采用雌性大鼠双侧卵巢切除方法进行造模,是研究绝经后骨质疏松症的经典模型[10]。本研究采用摘除大鼠双侧卵巢复制骨质疏松症模型,术后连续阴道涂片2个性周期。研究显示大鼠阴道上皮性周期变化消失,模型复制成功。骨密度检测亦显示模型组骨密度较空白组明显降低。

双能X线吸收测 定法 ( dual energy X-ray absorptiometry,DXA) 测量值是目前国际学术界公认的骨质疏松症诊断的金标准。骨疏颗粒能够提高去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度,此组骨密度与去模型组大鼠比较有统计学意义。

骨质疏松的发病过程是骨重建偏向破骨细胞所致的骨吸收不平衡过程,细胞因子产生于骨的微环境中,骨重建过程受到TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的调节。TNF-α 由骨原细胞产生,也可以由其他因子诱导产生,具有促进破骨细胞生成,加速骨吸收的作用[11]。IL-1是促破骨细胞的细胞因子之一,IL-1可以刺激成骨细胞产生IL-6与TNF-α 细胞,而且可以与这两种细胞因子相互协调,促进骨吸收[12]。本研究中,模型组IL-1β、IL-6及TNF-α 较空白组明显升高。用药12周后,戊酸雌二醇组及骨疏颗粒组血清IL-1β、IL-6及TNF-α 均降低,与模型组比较,差异均有统计学意义。骨疏颗粒防治骨质疏松症的机制可能是通过抑制IL-1β、IL-6及TNF-α 分泌,纠正骨吸收不平衡,进而减少骨吸收。

注: 与空白组比较,aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与模型组比较,cP < 0. 05,dP < 0. 01

本课题组临床观察发现,骨质疏松症主要病机为脾肾亏虚,瘀血阻络。骨疏颗粒由狗脊30 g、骨碎补15 g、淫羊藿10 g、熟地黄15 g、杜仲20 g、知母10 g、黄芪20 g、白术10 g、苍术10 g、三七粉3 g、羌活10 g、独活10 g等组成。方中狗脊、骨碎补、淫羊藿、熟地黄、杜仲、知母补肾壮骨,黄芪、白术、苍术补益脾气,三七、羌活、独活活血通络止痛,共凑补肾健脾,活血通络止痛之功。现代药理学研究显示,淫羊藿总黄酮能有效防止灌服维甲酸造成的大鼠骨量丢失,改善骨组织的显微结构,调节骨形成与骨破坏的紊乱状态,进而有效地对抗骨质疏松的发生[13]。谢雁鸣等[14]研究发现,骨碎补总黄酮能显著提高大鼠股骨及腰椎的骨密度,调节细胞因子IL-6、IL-4及TNF-α 的水平。杜仲叶醇提取物具有类激素样作用,能增进大鼠骨髓生成和增加骨质强度[15]。黄芪水提液防止去卵巢大鼠骨丢失的效应与乙烯雌酚相近,但机制不同; 其不仅能抑制去卵巢后的骨吸收,而且能增加体重[16]。 由此可知,骨疏颗粒主要药物淫羊藿、骨碎补、杜仲、黄芪等均有抗骨质疏松作用。本课题组前期临床研究亦表明[7-8],骨疏颗粒能改善OP的相关症状,抑制骨吸收,减缓骨量丢失,提高腰椎骨密度。本实验研究显示,骨疏颗粒可以增加去卵巢骨质疏松症大鼠骨密度,与模型组比较,差异有统计学意义。

综上,骨疏颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠有治疗作用,其机制可能是通过降低血清IL-1β、IL-6及TNF-α 水平,抑制骨吸收,从而防治骨质疏松症。

摘要：目的 观察骨疏颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度及血清细胞因子的影响,探讨骨疏颗粒防治骨质疏松症的可能作用机制。方法 将3月龄SD雌性大鼠40只,按随机数字表法分为空白组、模型组、戊酸雌二醇组及骨疏颗粒组。空白组只行假手术,其余3组用去大鼠双侧卵巢复制绝经后骨质疏松症的模型。术后3天分别给戊酸雌二醇及骨疏颗粒灌胃,12周后检测血清白细胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α及左股骨骨密度。结果(1)与空白组比较,模型组骨密度显著下降,血清IL-1β及IL-6显著增加(P<0.01),TNF-α增加(P<0.05);(2)与模型组比较,戊酸雌二醇组骨密度显著增加(P<0.01),血清IL-1β显著降低(P<0.01),IL-6及TNF-α均降低(P<0.05);骨疏颗粒组骨密度增加(P<0.05),血清IL-1β、IL-6及TNF-α均降低(P<0.05)。结论 骨疏颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠有治疗作用,其作用机制可能是通过降低血清中IL-1β、IL-6及TNF-α细胞因子水平,从而抑制骨吸收。