疫苗毒株

关键词： 病毒性

疫苗毒株（精选三篇）

疫苗毒株 篇1

1材料与方法

1. 1 RHDV流行毒株

RHDV贵州、四川、湖北、湖南、重庆、山西分离株,均由重庆市巴南区动物疫病预防控制中心兽医实验室于2010—2013年分离、鉴定并保存。

1. 2疫苗

RHD灭活疫苗( 批号为20131112 ) ,山东某生物工程有限公司生产。

1. 3试验动物

选择无RHD抗体的健康家兔( 体重为2. 0 ~ 2. 5 kg) ,购自山东省诸城市本明兔业开发有限公司。

1. 4 RHDV流行毒株的毒力测定

按参考文献[7]的方法将6株RHDV流行毒株分别作1 × 10－ 4倍稀释,分别接种体重2. 0 ~ 2. 5 kg的家兔4只,1. 0 m L/只,观察7 d,观察兔的发病死亡情况。

1. 5试验分组与疫苗免疫

将48只体重2. 0 ~ 2. 5 kg的RHD抗体阴性兔随机分成6组,每组8只,其中4只皮下注射RHD灭活疫苗1. 0 m L/只,另外4只不免疫作为空白对照, 隔离饲养。

1. 6 RHD抗体效价测定

免疫后第14天每组免疫兔与对照兔逐只采血, 分离血清,采用血凝抑制试验( HI) 测定各组兔的RHD抗体效价( lb) 。

1. 7攻毒保护试验

采血后每只兔皮下注射10倍稀释的各分离株病毒1. 0 m L/只,隔离饲养,观察7 d,观察免疫攻毒兔和对照兔的发病死亡情况,以及RHD灭活疫苗对不同流行毒株攻击的保护情况。

2结果与分析

2. 1 RHDV流行毒株的致死量测定

RHDV贵州、四川、湖北、湖南、重庆、山西分离株1 × 10－ 4倍稀释分别接种的4只家兔在攻毒后96 h内全部死亡,死亡兔具有呼吸系统及脾脏、肝脏等脏器淤血、出血等典型RHDV病理变化。说明6株RHDV流行毒株对兔的最小致死量均在1 × 10－ 4以上,均符合《兔病毒性出血症灭活疫苗制造与检验规程》中要求的强毒标准。

2. 2 RHD抗体效价的测定( 见表1)

lb

由表2可见,RHD灭活疫苗免疫后,家兔RHD抗体效价迅速上升,至第14天时抗体效价均在7. 25 lb以上。

2. 3攻毒保护试验( 见表2)

只

由表2可见: 试验各组的免疫兔和对照兔采用RHDV流行毒株进行攻击后,所有免疫兔均全部健活,表明试验兔免疫RHD灭活疫苗14 d后,可以抵抗不同来源的RHDV强毒的攻击,保护率达到100% ; 而对照组的未免疫兔全部死亡,兔死亡前体温高达41 ℃,同时呼吸加快,表现出尖叫、挣扎等神经症状,病理剖检发现死亡兔的肝脏岀血、肿大、质地脆弱易碎,肾脏岀血,脾脏岀血肿大,气管岀血,表现出RHDV感染的典型症状,说明未免疫兔确实死亡于RHDV感染。

3讨论与结论

自20世纪90年代RHD在我国流行以来,RHDV基因、抗原性等是否发生变异,引起了国内学者的普遍关注,尤其是近几年无血凝性RHDV的分离报道［8 － 9］,更引起人们的高度重视,对于RHD疫苗,人们最关心的是疫苗毒株与流行毒株抗原性之间的关系,疫苗毒株与流行毒株之间的交叉保护关系,即现行RHD疫苗免疫产生的抗体是否能够有效抵抗流行毒株的感染和致病。本研究通过应用近几年分离于不同地方的6株RHDV流行强毒株对免疫RHD疫苗兔进行攻毒保护试验,结果表明,现行疫苗对6株不同地区分离的RHDV强毒株均具有良好的保护效果,保护率均达到100% ,符合RHD疫苗效力检验标准要求,具有良好的免疫原性,能够抵御不同流行毒株的攻击。

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疫苗毒株 篇2

1 材料与方法

1.1 标本收集

2005年11月~2006年1月,在湖南省人类狂犬病的高、中、低疫区,分别选择冷水滩区、邵东县、桃源县、湘乡市、泸溪县5个县(市、区),由当地疾病预防控制中心工作人员采集家犬脑组织标本684份,冷冻保存送湖南省疾病预防控制中心实验室。采用直接免疫荧光法(DFA)检测狂犬病毒抗原,同时用巢式RT-PCR检测狂犬病毒核酸。两种检测方法均为阳性者有20份脑组织标本,用于N基因片段(704-1 423 bp,共720 bp)的测序。RT-PCR所用引物见表1。

注:引物位置以PV株(M13215)为准

1.2 狂犬病毒N基因片段扩增及测序

以巢式RT-PCR的一次反应产物为模板,反应引物为N577(+)和NR-B,PCR反应结果用1%琼脂糖(Sigma公司)凝胶电泳检查扩增条带。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化后,送北京利嘉富诚生物技术有限公司进行测序。

1.3 狂犬病毒N基因序列分析

采用DNAStar软件包中的Meg Align软件对本研究中获得的毒株、狂犬病疫苗株的核苷酸、氨基酸序列同源性比对分析,并以邻接法(Neighbor-Joining,NJ法)构建种系发生树,种系外群选用基因3型AY333111(Mokola)毒株。研究中用于分析和比较的13株国内外狂犬病疫苗株的N基因序列均来自Gen Bank,见表2。

2 结果

2.1 20株狂犬病毒株背景资料情况

湖南省2006年从外表行为正常的家犬脑组织中检测到20株狂犬病毒核酸。全部N基因片段测序成功,背景资料见表3。

2.2 与疫苗株N基因片段核苷酸序列同源性分析

由表4可见,湖南省检测到的20株研究毒株,与Gen Bank中已发表的国内外13株疫苗代表株核苷酸同源性较高,同源性在85.3%~94.2%(中位数88.6%)。其中,邵东株2006HN07与日本RC-HL株的同源性最低,为85.3%。冷水滩株2006HN17与中国CTN株的同源性最高,为94.2%。

与我国疫苗株(3a G、CTN、RB/E3-15及SRV9)比较,核酸同源性范围为84.7%~93.8%。冷水滩株2006HN17与CTN株间同源性最高,为94.2%。湘乡市株2006HN20与3a G间同源性最低,为84.7%。湖南省20株研究毒株与CTN株的核酸同源性均值最高,达90%;与3a G株同源性均值最低,为85.2%。与国外疫苗株比较,同源性在85.3%~89.4%之间,差异率为11.9%~17.1%;其中,与PV株的同源性在88.1%~88.9%之间;与PM1503株的同源性在88.2%~80.0%之间,与HEP-Flury株的同源性在88.6%~89.4%之间。

2.3 与疫苗株N基因片段氨基酸序列同源性分析

由表5可见,在湖南省2006年检测到的20株研究毒株中,与疫苗株的N基因氨基酸序列同源性为95.4%~99.6%(中位数99.2%),明显高于核苷酸序列的同源性(85.3%~94.2%),差异性仅为0.4%~4.7%(中位数0.8%)。其中,与中国疫苗株CTN、SRV-9,国外疫苗株CVS、RBE3-15、SADB19-1st及HEP-Flury株的氨基酸序列同源性范围在99.2%~99.6%。

20株研究毒株与国内外疫苗代表性毒株氨基酸序列比较发现,部分氨基酸序列位点发生替代现象。具体表现为:3a G株有212(L→M)、322(I→V)、327(S→A)、352(R→K)、379(V→L)、407(A→T)6个位点发生替代;CTN株有254(K→R)1个位点发生替代;CNS株有379(V→L)1个位点发生替代;ERA株有228(I→T)、272(T→M)、334(T→A)、379(V→L)、431(R→H)、432(H→Q)6个位点发生替代;PV株有379(V→L)、410(I→M)2个位点发生替代;RB/E3-15株有379(V→L)1个位点发生替代;RV-97有218(D→E)、246(V→I)、364(R→K)、379(V→L)、407(A→T)5个位点发生替代;SAD B19-1st株有379(V→L)、448(N→S)2个位点发生替代;PM1503有379(V→L)1个位点发生替代;Nishigahara有322(I→V)、379(V→L)、388(D→N)、399(A→T)、401(G→S)、407(A→T)6个位点发生替代;SRV9株有:379(V→L)1个位点发生替代;HEP-Flury株有379(V→L)1个位点发生替代;RC-HL有257(T→I)、322(I→V)、352(R→K)、37(V→L)、388(D→N)、394(H→Y)、396(D→S)、39(A→T)、401(G→S)、407(A→T)10个位点发生替代。

然而,在389位氨基酸残基位点,各疫苗毒株和20株研究毒株氨基酸序列均为S(丝氨酸),无一株发生替代,都具有狂犬病毒共有的丝氨酸磷酸化位点特征。

2.4 与疫苗株N基因的系统发生分析

从附图可以看出,研究毒株与国外内狂犬病疫苗株按系统进化分为A、B两大群。按照进化关系远近,研究毒株与中国CTN株进化关系最近,并以冷水滩株2006HN17与其亲缘性最高。其次,研究毒株与标准固定毒株SADB19-1ST、CVS、PV、兽用ERA株及中国的SRV-9等毒株的亲缘关系较近,而与中国的3a G株、德国的PM1503毒株、日本株、美国减毒HEP-Flury株进化关系则普遍较远。

3 讨论

湖南省20株研究毒株与13株国内外代表性狂犬病疫苗株N基因核苷酸同源性范围为85.3%~94.2%(中位数88.6%)。特别是与中国人用疫苗CTN疫苗株的核苷酸同源性相对较高(89.9%~94.2%)。CTN疫苗株是我国目前生产精制疫苗的毒种,它与各毒株的同源性较高,肯定了该疫苗能有效预防湖南省流行的狂犬病。另外,它们还与兽用疫苗SRV-9疫苗株的核苷酸同源性较高,但与中国3a G株、国外疫苗株的核苷酸同源性相对较低。这些差异可能与病毒分离时间和分离地域有关,也说明了狂犬病毒的分布具有明显的地域分布特征。

湖南省20株研究毒株与疫苗株的氨基酸序列同源性为95.4%~99.6%,明显高于核苷酸序列的同源性。与中国疫苗株CTN、SRV-9,国外CVS、RBE3-15、SADB19-1st、HEP-Flury株相比,氨基酸序列同源性范围在99.2%~99.6%,也从另一方面说明,目前使用的这些疫苗都是稳定的。这些病毒都是同一血清型,使用后都能够获得良好的保护力。研究毒株与国外内狂犬病疫苗株按系统进化分为两大群。本研究的全部20份毒株与中国人用CTN株具有很高的亲缘性,构成第一群。其余的疫苗毒株构成第二基因群。这与罗廷荣[1]、明平刚[2]、SMITH JS[3]、孟胜利[4,5]等研究结果相似。

CTN是1983年分离自中国济南的一株野毒株,后经传代减毒固定下来[5]。CTN在系统发生树上与本研究的全部20份毒株在一个群,提示其与湖南毒株亲缘关系较近。罗廷荣等[1]比较了广西狂犬病毒株GXN119、GXBM、GXLA的N基因序列,发现它们与疫苗株CTN、PV、CNS、SAD-B19核苷酸同源性为84.9%~99.0%。比较还发现,3株N基因核苷酸与CTN核苷酸同源性均较高。明平刚等[2]将新分离的5株街毒株N基因与CTN株比较,发现核苷酸和氨基酸同源性分别在89.4%~89.6%和98.2%~98.6%之间,二者同源性均较3a G株高;与PV、SAD、CVS和Flury等国外固定毒株进行比较,核苷酸序列同源性在87.1%~88.3%之间,氨基酸同源性在97.3%~99.1%之间。SMITH等[3]发现,实验室的疫苗毒株大部分有很高的同源性,如CVS、3a G、ERA等,而街毒株差异较大,存在明显的地域性。孟胜利等[4,5]测定了8个代次CTN-1疫苗株的核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因序列,并与代表性疫苗株和街毒株进行比较。结果表明,CTN-1株8个代次之间的核苷酸序列几乎完全相同,CTN-1株在传代过程中,N和G基因变异小,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于其它疫苗株。

由于疫苗株CTN与湖南省狂犬病毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,通过系统发生分析表明,湖南省狂犬病毒株与中国CTN疫苗株亲缘关系较近。研究毒株与标准固定毒株SADB19-1ST、CVS、PV、兽用ERA株及中国的SRV-9等毒株,亦发现有良好的进化关系,而与中国的3a G株、德国的PM1503毒株、日本株、美国减毒HEP-Flury株进化关系则普遍较远。因此,为了更加有效地保护人类和动物,在湖南省使用CTN株疫苗,能起到比其他毒株更好的防治作用。然而,对于用3a G疫苗株与PM疫苗株生产的人用疫苗,以及用ERA疫苗株生产的兽用疫苗,是否能取得如CTN株一样的保护效果,还有待于进一步的研究评价。尤其是3a G疫苗株,由于分离时间较早,经过70多年来狂犬病毒流行株的遗传漂变,该疫苗株极有可能不能为流行的街毒株提供比较充分的保护。

近几年经过调查发现,湖南省犬只感染率较高。曾经是狂犬病低发病地区的泸溪县,目前犬只感染率也有1.92%,这在一定程度上可以解释,为何连续10年无狂犬病病例的湘西自治州、张家界市,自2005年起出现狂犬病记录[6],而且还伴随着潜伏期变短等新的流行特征。除了以上所分析的街毒株与疫苗株的差异所导致的免疫保护力低以外,可能流行的街毒株的毒力与致病性也有所加强。由于全程免疫狂犬疫苗是减少并控制狂犬病发生的有效措施,卫生部门应加强对人用狂犬疫苗的监督、监测、管理,提高狂犬疫苗的质量[7]。与已知的基因1型狂犬病毒株比较,本研究中,20株狂犬病毒街毒株N蛋白的氨基酸序列均有不同程度的差异。考虑到核蛋白对病毒的转录与复制具有调控作用[8,9],N蛋白任何形式的变异,都有可能影响到病毒的转录与复制,进而影响到病毒的毒力。因此,是否由于氨基酸位点的变化能增加病毒的毒力与致病性,使感染病毒后的潜伏期变短抑或更有利于病毒的流行,还有待于进一步的研究。

俞永新指出,疫苗生产株的基因序列与野毒株有较大差别,可能是由于当前用于疫苗生产的毒种多是很早以前分离的病毒[10]。最早的来源是1882年分离的,如国外Vero疫苗生产的PM和PV株,较近的有1939年分离的Flury毒种,现在被用于鸡胚细胞疫苗的生产。中国a G株来源于1935年分离的北京株,CTN-1分离株则来源于1956年分离的济南株。由于狂犬病潜伏期缩短,提示可能出现毒力增强的变异株。如果出现毒力更强的野毒株,则现有疫苗应有足够的抗原量,才能达到对这类街毒感染的有效保护作用。因此,应进一步深入研究不同地区狂犬病野毒株的表型和基因型特性,了解是否存在或新出现抗原性或毒力不同的狂犬病变异株,特别是野毒株与疫苗株、攻击毒株间抗原性和免疫性的关系研究。明确目前不同毒株生产的疫苗对国内不同地区的野毒株均有普遍的保护作用,将为疫苗生产、应用和改进等提供依据。

(王吉伟编辑)

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疫苗毒株 篇3

本研究利用PEDV ORF3 基因强弱毒株有49~51 bp缺失的特性设计特异性引物, 通过一次试验即可解决是否有PEDV感染以及是疫苗毒感染还是野毒感染或共感染的情况, 极大地降低检测时间和检测成本, 此外也为该病的流行病学调查及免疫防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1病毒株PEDV野毒株由本实验室分离;PED活疫苗 (毒株ZJ-08 株) 、猪瘟病毒 (HCV) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、 猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 均由福州大北农生物技术有限公司提供。

1.2主要试剂RNA viral Kit购自Omega公司;AMV反转录酶、HPRI、Random primer、DL2000 DNA Marker和d NTPs (2.5 mmol/L) 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;PCR Master Mix (2×) 购自天根生化科技有限公司。

1.3引物设计与合成参照Gen Bank中登录的PEDV ORF3 基因序列, 利用Primer Permier 5.0 和Oligo 7.0 软件设计特异性引物。 引物序列为:F:GGCGCAATTATATTATGTTGG;R:CACGTATAGCTA GATACAAGTCA;引物均由Invitrogen公司合成。

1.4病毒RNA的提取和CDNA的合成按照RNA viral kit提取总RNA。按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录合成CDNA, -20℃保存备用。

1.5 PCR扩增以提取的样品CDNA为模板, 用所设计的特异性引物进行PCR扩增, 反应体系50 u L, 其中:2×Mix 25 u L、上下游引物 (20 umol/m L) 各1 u L、c DNA 1 u L, 补充去离子水至终体积为50 u L。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性50 s, 55℃退火35 s, 72℃延伸25 s, 30个循环;72℃延伸10 min。反应结束后, 扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 引物特异性试验分别以猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪瘟病毒 (HCV) 、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 为模板进行RT-PCR扩增, 以验证该方法的特异性。

1.7 检测方法的应用用建立的RT-PCR检测方法对送检的临床样品进行检测, 并设立阴性对照。

2 结果与分析

2.1 PEDV疫苗株与野毒株的扩增该方法能够对疫苗株扩增出一条大小为278 bp的目的片段, 对野毒株扩增出一条大小为327 bp的目的片段, 其大小与预期目的片段一致, 差异明显 (见图1) 。 将目的条带进行纯化、 克隆、 测序, 经Blast比对分析, 与Gen Bank中的PEDV ORF3 序列相似度高达99%以上。

2.2 特异性试验分别对猪源性病毒:猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪瘟病毒 (HCV) 、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 进行RNA提取与CDNA合成, 以这3 种CDNA为模板进行RT-PCR扩增。 扩增结果显示 (见图2) , 该方法具有良好的特异性, 不会在实际应用中引起非特异性扩增。

2.3 RT-PCR鉴定方法的应用采用建立的RTPCR检测方法对2016 年1 月份以来送检的37 份疑似PEDV感染猪粪样、 呕吐物及肠道内容物CDNA进行扩增, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 37 份样品中有30 份能检测到PEDV, 其中野毒感染13 份, 疫苗毒与野毒共感染的为17 份, 提示疫苗接种已难以控制该病的流行。

3 结论

目前已有多种PEDV检测方法建立的报道。李长龙等[8]建立了能够区分猪流行性腹泻疫苗毒与野毒的RT-PCR检测方法, 可用于PEDV诊断及流行病学调查;刘琦等[9]建立巢式PCR法;修金生等[10]根据野毒株和弱毒疫苗株在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异, 建立了能够区分疫苗毒与野毒的SYBR Green I检测方法。

本文成功建立了鉴别诊断PEDV疫苗株与野毒的RT-PCR检测方法, 该方法具有操作简单、用时少、花费低等特点。利用该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪瘟病毒 (HCV) 、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 等猪源性病毒的检测结果均为阴性, 说明该方法具有很好的特异性。目前PED的流行趋势较为严峻[11]。Gao等[12]报道了变异PEDV在我国发病猪场中占主导地位。临床检测结果发现, 大部分发病猪只中存在疫苗株与野毒共感染的特点, 提示目前流行的仔猪流行性腹泻很有可能是由猪流行性腹泻病毒变异株引起的, 仅采用经典株疫苗进行免疫, 已经难以达到有效的防控目的, 应根据检测数据及临床使用结果给予合理的免疫接种。

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