全反式维甲酸

关键词：

全反式维甲酸（精选四篇）

全反式维甲酸 篇1

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)时肾小球滤过屏障功能障碍及肾脏血流动力学异常与蛋白尿的发生密切相关。近年来已认识到足细胞裂孔隔膜上的蛋白分子nephrin是肾小球滤过屏障选择性功能的关键。在未出现明显肾脏组织学损害和显著蛋白尿前,nephrin的表达已经明显下降[1]。前列腺素类化合物(PGs)参与糖尿病肾脏血流动力学的改变,其中环氧化酶-2(COX-2)是前列腺素代谢的关键限速酶。在糖尿病大鼠模型中可观察到COX-2的表达强度增加[2]。维甲酸类(RA)药物是近年引起国内外学者重视的肾保护药物。本研究旨在观察全反式维甲酸对糖尿病大鼠肾脏nephrin、COX-2表达的影响,进一步探讨其肾保护作用的机制,现报道如下:

1 资料和方法

1.1 动物模型的建立与分组

雄性SD大鼠26只,体重200～250 g,购于江苏大学医学院动物实验中心。用枸橼酸缓冲液(0.1mol/L,pH4.4)新鲜配置的1%链脲佐菌素(STZ,Sigma)给大鼠腹腔注射,剂量为55 mg/kg。另设正常对照组(N,n=6),仅注射同等剂量的枸橼酸缓冲液。注射72 h及7 d后,尾静脉采血测定血糖,血糖均大于16.7 mmol/L,且尿糖强阳性并出现多饮、多尿、多食、体重减轻入选糖尿病模型。将糖尿病大鼠随机分为两组,模型组(D,n=10)和全反式维甲酸干预组(A,全反式维甲酸片10 mg/(kg·d)灌胃,山东良福制药公司,n=10)。N组与D组以等剂量蒸馏水灌胃。试验过程中,D组死亡4只,R组死亡2只,可能为高血糖或酮症酸中毒所致。

1.2 标本收集及检测

干预8周后处死大鼠,处死前代谢笼收集24h尿,双缩脲法测尿蛋白,全自动生化分析仪测尿肌酐。以氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,心脏取血,血糖仪检测血糖,全自动生化分析仪测血脂、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)。并计算内生肌酐清除率(Ccr),Ccr=尿肌酐/血肌酐×24 h尿量。肾脏经生理盐水灌洗后测肾重,肾脏肥大指数:以肾重/体重×1 000表示。取肾脏,部分-70℃冻存以备荧光定量PCR检测;部分4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制成4μm切片,以备病理及免疫组织化学检查。

1.3 肾脏病理检查及免疫组织化学

所做标本切片行H.E染色。采用EnVision法检测肾组织中的nephrin、COX-2。石蜡切片脱蜡至水后加抗原修复液,高温热修复;分别滴加一抗兔抗nephrin多克隆抗体(1∶200,Santa Cruz)、兔抗COX-2多克隆抗体(即用型,福州迈新公司),4℃孵育过夜;滴加二抗为抗兔EnVision多聚物(DAKO公司),室温下孵育;最后加入DAB显色液(福州迈新公司),显微镜下控制显色,脱水,透明,封片。显色结果在高倍镜(×400)下随机选取10个连续不重复的视野,以胞质出现金黄色或棕黄色颗粒为阳性信号,免疫组化阳性指数用阳性面积×阳性强度表示,计算方法见参考文献[3]。取平均值作半定量分析,为该阳性物质的相对含量。

1.4 实时荧光定量PCR测定nephrin、COX-2mRNA

每份标本取肾皮质100 mg,加入Trizol(ABI基因公司)1 m L提取总RNA,以总RNA为模板,逆转录合成c DNA。nephrin引物序列上游:5'-CGAG-GCACTCCGTGAAAC-3',下游:5'-GCCTCGGAAG-GTCCAGTT-3',175 bp;COX-2引物序列上游:5'-CT GTATCCCGCCCTGCTGGTG-3',下游:5'-ACTTGCG TTGATGGTGGCTGTCTT-3',145 bp;GAPDH引物序列上游:5'-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3',下游5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3',121 bp,由广州达晖生物公司合成。采用ABI Prism 7300 PCR仪进行实时定量PCR反应(SYBR Green PCR试剂盒,广州达晖生物公司)。反应参数:预变性95℃15 min,然后95℃变性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40个循环。待测样品m RNA相对表达量=2-ΔCT×100%;ΔCT=目标基因CT值-内参(GAPDH)CT值。

1.5 统计学分析

应用SPSS11.5软件,计量资料用均数±标准差表示,各组间均数比较采用单因素方差分析。指标之间的关系采用Pearson's直线相关分析。P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 全反式维甲酸对糖尿病大鼠体重、肾重、血糖、尿量等一般指标的影响

模型组(D组)大鼠体重下降,肾重、肾脏肥大指数、血糖、尿量增加,与正常大鼠(N组)相比,差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。全反式维甲酸干预(A组)大鼠与D组比较,其肾重、肾脏肥大指数、尿量降低(均为P<0.05),但体重、血糖比较,差异无显著性。见表1。

2.2 全反式维甲酸对糖尿病大鼠尿蛋白、BUN、Scr及Ccr变化的影响

注:1)与N组相比,P<0.05;2)与N组相比,P<0.01;3)与D组相比,P<0.05

D组大鼠尿蛋白、BUN、Scr较N组增高,Ccr降低,差异有显著性(均为P<0.01),即糖尿病大鼠出现了明显的肾功能减退;A组大鼠比D组尿蛋白、BUN、Scr和Ccr均有明显恢复(P<0.05或P<0.01),但仍与正常大鼠差异有显著性,即全反式维甲酸部分逆转了糖尿病大鼠的肾损伤,有一定的肾保护作用。见表2。

注:1)与N组相比,P<0.01;2)与D组相比,P<0.05;3)与D组相比,P<0.01

2.3 全反式维甲酸对糖尿病大鼠肾组织病理形态学变化的影响

光镜H.E染色显示,与N组比较,D组表现出明显的肾小球体积增大,系膜细胞显著增多,基质增生,肾小球毛细血管壁狭窄,并可见部分肾小管上皮细胞空泡变性;而A组与D组比较肾小球基质及系膜细胞数减少,毛细血管袢开放良好,系膜基质轻微增生,部分小管上皮开始出现修复。

2.4 全反式维甲酸对糖尿病大鼠肾脏nephrin、COX-2免疫组化表达的影响

N组大鼠肾脏nephrin仅在肾小球表达,沿肾小球毛细血管袢呈线状分布;D组大鼠肾小球nephrin表达显著低于N组(P<0.01),在部分肾小球中,nephrin呈颗粒状分布;A组肾小球内nephrin的量比D组升高(P<0.01),但仍少于N组(P<0.01)。见表3、图1。N组大鼠肾脏COX-2主要表达集中于肾小管,呈散在表达,肾小球内有极少数细胞表达;D组COX-2表达比N组增强(P<0.01),并出现致密斑和肾小球内多个细胞表达;A组较D组肾小球及肾小管表达均减弱(P<0.01),但仍比N组多(P<0.01)。见表3、图2及3。

注:1)与N组相比,P<0.01;2)与D组相比,P<0.01;

2.5 全反式维甲酸对糖尿病大鼠肾脏nephrin、COX-2 mRNA相对表达量的影响

荧光定量PCR结果显示,D组大鼠肾组织nephrin m RNA表达(0.0415±0.0183)比N组(0.3186±0.0683)减少(P<0.01);A组nephrin m RNA表达(0.1340±0.0787)高于D组(P<0.05),但仍比N组少。D组大鼠肾组织COX-2 m RNA(0.7459±0.3543)比N组(0.1232±0.1089)高(P<0.05);A组COX-2 m RNA(0.2444±0.1974)表达低于D组(P<0.05),且与N组相比,差异无显著性。

2.6 直线相关分析

24 h尿蛋白定量分别与nephrin m RNA、nephrin免疫组化表达呈显著负相关(r=-0.771,P<0.01;r=-0.868,P<0.01);24 h尿蛋白定量分别与COX-2 m RNA、COX-2免疫组化表达呈显著正相关(r=0.611,P<0.01;r=0.828,P<0.01)。

3 讨论

维甲酸(RA)是维生素A在体内氧化代谢的中间产物,通常以全反式结构(ATRA)存在。RA在细胞核内有两组核受体:维甲酸受体(RAR)和维甲酸类X受体(RXR)。ATRA能够结合并活化RAR并与RXR形成异二聚体,再结合到目的基因启动子上的RAR反应元件(RARE),从而调节目的基因转录。近年来国外学者通过建立动物模型研究表明,ATRA有减少蛋白尿的作用,如WAGNER等[4]研究发现ATRA干预anti-Thy1.1肾炎可使尿蛋白的排泄率下降70%。MORENO等[5]用嘌罗霉素氨基核苷(PAN)诱导肾病模型,用ATRA治疗能抑制蛋白尿,保护肾脏上皮细胞,减少细胞水肿和减少足细胞的消失。上述实验都说明ATRA具有一定的肾脏保护作用。

特异性表达于足细胞裂孔隔膜上的蛋白分子nephrin是肾小球滤过屏障选择性功能的关键,能维持足细胞的正常形态和功能。DN时,nephrin等表面功能蛋白表达下调以及足突融合脱落等病理改变,进而导致了蛋白尿的发生[6]。在本研究中,笔者也发现糖尿病大鼠肾小球nephrin基因和蛋白表达均显著降低,同时糖尿病组大鼠尿蛋白、Scr、BUN亦显著增高,且nephrin的表达与24 h尿蛋白排泄量呈显著负相关,这表明糖尿病大鼠SD关键蛋白nephrin基因和蛋白表达及分布存在明显异常,裂孔膜结构和功能的完整性受损,肾小球滤过屏障通透性发生改变,从而促进糖尿病肾脏损害和蛋白尿的发生发展,同时蛋白尿的加剧可能也会使nephrin的表达进一步下降。

COX-2是介导花生四烯酸代谢的限速酶,它能将花生四烯酸转化为前列腺素族(PGs),如前列环素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)。其作用特点尚未完全明确,目前的研究表明TXA2具有收缩肾脏入球小动脉及系膜细胞、减少肾血流量,促进血小板聚集、细胞外基质合成及肾小球硬化的形成等作用,而PGI2的作用则与之相反[7]。生理情况下COX-2呈低水平表达,但在低盐饮食、炎症或生长因子等的刺激下能迅速合成。KIRITOSHI等[8]用高糖培养人系膜细胞,显示高糖能增加线粒体活性氧簇的产生,导致核因子-κB(NF-κB)激活,诱导COX-2 m RNA和蛋白表达。本实验中,笔者通过免疫组化的方法观察了COX-2在糖尿病大鼠肾脏的表达,发现其较正常组明显增强,棕染面积扩大,实时荧光定量PCR结果也表明肾皮质COX-2 m RNA的表达增加,同时糖尿病大鼠出现尿蛋白增多,肾功能下降,且COX-2的表达与尿蛋白呈显著正相关。提示COX-2表达上调参与了DN的发生发展并与蛋白尿的产生密切相关。

本实验发现ATRA干预后,在降低蛋白尿的同时,肾脏肥大指数下降,细胞外基质增多及系膜细胞增生现象也明显改善,表明ATRA能改善DN的肾小球肥大,同时肾组织中nephrin表达上调、COX-2表达下调,BUN、Scr下降,Ccr升高,提示ATRA可能通过调节nephrin、COX-2的表达,降低蛋白尿,保护肾功能。上述MORENO等[5]的实验还发现nephrin启动子含有RARE,ATRA可通过特异性介导nephrin表达上调,减轻肾小球滤过屏障损伤。因此,笔者推测在糖尿病大鼠模型中,ATRA通过激活RAR/RXR,使其与nephrin启动子上特定的RARE序列结合,调节目的基因的转录来发挥肾保护作用。与nephrin不同,COX-2启动子上不含有RARE序列,即ATRA并非通过直接的RARE途径来调节COX-2的表达,可能另外存在间接的途径或其他机制介导COX-2的表达。ATRA活化的RAR/RXR二聚体正性或负性调节其他信号途径介导的基因激活,如ATRA介导抗转录因子激活蛋白(AP-1)活性可以抑制氧化应激介导的系膜细胞凋亡[9]。COX-2启动子上含有c AMP反应元件(CRE),SUBBARAMAIAH等[10]研究认为ATRA并不抑制AP-1与COX-2启动子上的CRE结合,而是通过减少招募到启动子上的CREB结合蛋白(CBP/p300)的数量来抑制AP-1介导的COX-2的转录。另外,ATRA可能也影响了各种蛋白激酶包括蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38来间接调节COX-2的表达。

综上,本实验研究认为ATRA可以减少糖尿病肾病的蛋白尿,减轻肾脏损害,保护肾功能;并可能通过RARE途径上调肾脏nephrin的表达及非RARE途径下调COX-2的表达发挥肾保护作用,这为ATRA可能预防和治疗糖尿病肾病提供了一定的理论依据。但ATRA对nephrin、COX-2表达调控的具体机制仍需进一步研究。

参考文献

[1]DOUBLIER S,SALVIDIO G,LUPIA E,et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensinⅡ[J].Diabetes,2003,52(4):1023-1030.

[2]KOMERS R,LINDSLEY JN,OYAMA TT,et al.Immunohistochemical and functional correlations of renal cyclooxygenase-2in experimental diabetes[J].J Clin Invest,2001,107(7):889-898.

[3]陈立平,周巧玲,彭卫生,等.罗格列酮联合洛沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞的协同保护作用[J].实用医学杂志,2007,23(8):1124-1126.[3]CHEN LP,ZHOU QL,PENG WS,et al.The protective effect of the combination of rosiglitazone and losartan on the podocytes of diabetic nephropathy rats[J].Journal of Practical Medicine,2007,23(8):1124-1126.Chinese

[4]WAGNER J,DECHOW C,MORATH C,et al.Retinoic acid reduce glomerular injury in a rat model of glomerular damage[J].J Am Soc Nephrol,2000,11(8):1479-1487.

[5]MORENO-MANZANO V,MAMPASO F,SEPULVEDA-MUNOZ JC,et al.Retinoid as a potential treatment for experimental puromycin-induced nephrosis[J].Br J Pharmacol,2003,139(4):823-831.

[6]WOLF G,CHEN S,ZIYADEH FN.From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease:podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J].Diabetes,2005,54(6):1626-1634.

[7]XIANG JH.Clinical research of ACEI combined with cyclooxygenase-2inhibitor on diabetic nephropathy[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(6):741-743.Chinese

[8]KIRITOSHI S,NISHIKAWA T,SONODA K,et al.Reactive oxygen species from mitochondria induce cyclooxygenase-αgene expression in human mesangial cells:potential role in diabetic nephropathy[J].Diabetes,2003,52(10):2570-2577.

[9]KITAMURA M,ISHIKAWA Y,MORENO-MANZNNO V,et al.Intervention by retinoic acid in oxidative stress-induced apoptosis[J].Nephrol Dial Transplant,2002,17(supplp):84-87.

全反式维甲酸 篇2

关键词：全反式维甲酸,人视网膜色素上皮细胞D407,增殖,调亡

近视眼是目前世界上发病率最高的眼病之一,全球近视眼发病率约为25%,且还有不断上升趋势。多年来关于近视眼的发病机制研究主要集中在视网膜和巩膜。在信号从视网膜传递至巩膜的过程中,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)起着不可忽视的作用。RPE具有自分泌功能,可分泌多种细胞因子和生长因子,并有多种受体表达[1,2]。因此RPE可接收来自视网膜的信号,阻断其生物学效应下传;亦可产生下一级信号分子作用于脉络膜和巩膜。其自分泌的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、转化生长因子β2(transforming growth factorβ2,TGFβ2)被认为是调控近视眼巩膜基质重塑的关键信号分子[3]。因此,人视网膜色素上皮细胞与近视眼的发病关系逐渐成为近年来近视眼疾病研究领域的热点。

维甲酸是维生素A在体内自然产生的衍生物,与人类的组织相容性较好,在细胞的生长、分化,细胞生理调亡等方面发挥重要作用[4]。维甲酸有顺式和反式两种,这两种构象之间在一定条件下可以互相转换。本文选用全反式维甲酸处理人视网膜色素上皮细胞D407,观察全反式维甲酸对人视网膜色素上皮细胞D407增殖及调亡的影响,旨在进一部探讨ATRA对D407细胞增殖及调亡的调控,并为揭示近视眼的发病机制及ATRA治疗近视的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人D407细胞、胎牛及小牛血清,由中南大学湘雅医学院细胞中心提供;DMEM培养基,美国GIB-CO公司;全反式维甲酸,美国SIGMA公司;Annexin V-FITC调亡检测试剂盒,美国Bender MedSystems公司。FACScan型流式细胞仪,美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 D407细胞培养

细胞复苏后,用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬吹打均匀后,以1×105/m L细胞密度接种于培养瓶中,培养基内含100U/m L的青霉素和100μg/m L的链霉素,在37℃,5%二氧化碳条件下培养,隔日换液,以后每隔2 d换液1次,细胞铺满后,用0.25%胰蛋白酶消化、传代培养。

1.2.2 ATRA对D407细胞生长的抑制作用

取对数生长期的D407细胞经计数后以5×104/m L的浓度细胞悬液接种于24孔培养板中,培养48 h后实验组各孔加入含ATRA10μg/m L完全培养液,另设3孔为空白对照组,空白对照组孔加入DMEM完全培养液,避光作用72 h后计数活细胞数。

1.2.3 ATRA对D407细胞贴壁影响的观察

取对数生长期细胞种入24孔培养板中,实验组孔加入以上实验组药物浓度的1/10培养液,空白对照组孔加入完全培养液,避光培养24 h后弃上清和未贴壁细胞,用0.25%胰蛋白酶消化各孔贴壁细胞,与对照组比较,计数各孔贴壁细胞数并计算贴壁率。同时在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照,记录细胞贴壁生长情况。

1.2.4 ATRA作用D407细胞后形态学观察

将传代培养的细胞以5×104/m L细胞浓度接种于垫有盖玻片的24孔板内,培养48 h后加入含ATRA浓度为10μg/m L的完全培养液,平行设3孔,另设3孔为空白对照,作用48 h后弃上清液,取出实验组和空白对照组各3孔的盖玻片在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照,记录细胞形态的改变。

1.2.5 超微结构观察

将传代培养的人D407细胞以5×104/m L的细胞浓度接种于25 cm2的培养瓶内,培养48 h后,换液加入含ATRA10μg/m L完全培养液,设空白对照组加入DMEM完全培养液,继续培养48 h,收集离心细胞约1×107个,PBS洗3遍,用4%戊二醇在4℃固定24 h;PBS洗3遍,丙酮梯度脱水;环氧树脂包埋,LKB超薄切片机切片,铅铀双染色后在H-600透射电镜下观察细胞超微结构。

1.2.6 人407细胞调亡检测

取对数生长期的D407细胞以每孔1×104个细胞接种于6孔板中,培养24 h后,弃上清液,分别加入含ATRA10μg/m L的完全培养液,空白对照组加入DMEM完全培养液,平行设3孔,培养72 h后消化收集细胞,PBS洗3遍,用1倍的缓冲液稀释细胞悬液浓度至1×106/m L。取100μL细胞悬液(含1×105个细胞)至流式管中,1 000 g离心5 min,弃上清液,加入195μL Annexin V-FITC结合液,轻轻混匀,加入5μL Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温避光孵育10min,1 000 g离心5 min,弃上清液,加入190μL Annexin V-FITC结合液,轻轻重悬细胞,加入10μL PI,轻轻混匀,冰浴并避光放置,用流式细胞仪分析细胞调亡率,Annexin V-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光;每组样本收集10 000个细胞荧光信号,同时设PI单染,FITC单染及空白对照。

1.3 统计学处理

实验所有数据均由SPSS 11.0统计软件进行处理,实验数据用均数±标准差(x±s)表示,两组均数比数采用t检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 ATRA对人407细胞增殖及贴壁的影响

2.1.1 ATRA对人D407细胞增殖的抑制作用

ATRA处理72 h后,实验组与空白对照组相比较,实验组DMEM培养液内悬浮细胞明显增多,存活的贴壁细胞数量减少,差异有显著性。实验组存活细胞数为(5.26±2.47)×104/m L,与空白对照组细胞存活数(12.97±3.56)×104/m L相比较差异具有显著性(P<0.05)。

2.1.2 ATRA对人407细胞贴壁的影响

实验组与空白对照组作用24 h后,将两组细胞用0.25%胰蛋白酶消化后计数活细胞数,实验组存活细胞数与空白对照组存活细胞数相比较,差异有显著性(P<0.05),两组细胞计数结果见表1。

2.2 人D407细胞形态学观察

2.2.1 将传代的D407细胞置光学显微镜下直接观察

在相差显微镜下空白对照组细胞排列紧密,细胞间隙较少。实验组细胞间空隙变大,排列紧密度下降,部分细胞脱落形成空巢现象(图1)。

2.2.2 传代的人D407细胞超微结构观察

在电镜下观察的对照组细胞胞膜完整,胞质内可见正常分布的线粒体、内质网等细胞器。细胞核和细胞质比例正常,核膜完整,核内染色质分布均匀。ATRA作用的实验组细胞胞膜基本完整,部分细胞膜发生皱缩、凹陷。细胞核浓缩,细胞质和细胞器密度增高,细胞体积变小,细胞核膜完整但有皱缩改变,核染色质边集和浓缩(图2),部分细胞内染色质分割成片段,形成凋亡小体,细胞核固缩,核膜断裂,染色质断裂成碎片样改变(图3)。

2.3 流式细胞仪检测结果分析

经流式细胞仪检测结果分析,对照组的细胞调亡率为(4.12±1.58)%,实验组细胞调亡率为(24.38±2.37)%,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。在Annexi V-FITC/PI散点图上可见,实验组与对照组比较,位于右下象限的调亡细胞数量明显增多(图4)。

3 讨论

目前,国内外在应用药物对视网膜色素上皮细胞调控机制方面作了多方面的探索[5,6,7,8,9,10]。这些药物主要集中在抗代谢类和抗肿瘤类,传统的化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时,也在一定程度上杀死正常细胞。因此,分化治疗与传统化疗是不同的两种治疗理念。在眼科领域内,国内外学者在动物模型上证明它能有效抑制视网膜色素上皮细胞的增殖,而在抑制人类视网膜色素上皮细胞增殖方面,国内外只有极小数文献支持此结论,但尚未定论,对此抑制作用的机制也未见阐明。ATRA虽然能诱导人体多种细胞发生调亡反应;抑制多种肿瘤细胞的生长,促使肿瘤细胞向正常细胞终末方向分化,起到正向治疗作用[11,12,13]。但是对人类视网膜色素上皮细胞是否有此作用,尚未见文献报道。

本研究采用10μg/m L的药物浓度[14]作用于体外传代培养的人D407细胞72 h后结果显示,实验组细胞增殖数明显少于空白对照组(P<0.05),表明ATRA能有效地抑制人D407细胞的增生,而细胞增殖是形成近视的主要病理基础。

本实验还观察了ATRT对人D407细胞贴壁的影响,在药物浓度上选择实验组药物浓度的1/10,这样既可避免药物过量而引起的毒副作用,又能使人D407细胞在适宜和温和的药物浓度下保持细胞增殖活性,更好地突显药物对细胞贴壁作用的影响,本研究结果显示,ATRA作用24 h后,实验组贴壁生长细胞数量明显少于空白对照组贴壁细胞数,并具有统计学差异(P<0.05),表明该药物对D407细胞的贴壁生长,具有一定的抑制效应,所以ATRA在抑制人视网膜色素上皮细胞后,调控巩膜代谢状态,防治近视发生方面具有优势。

本研究细胞形态学观察发现,传代培养的人D407细胞排列紧密,具有一定的自我增殖的生物学特性,这种特性是构成近视的物质形成,在视网膜感受外界视觉环境变化后产生一系列近视信号因子,而这些因子相互作用,构成视网膜神经调控网络,再作用于视网膜色素上皮细胞,使其产生下一级近视信号因子,进而调控巩膜的代谢状态,导致眼轴延长,形成近视的生物学基础。而在ATRA药物的作用后,人D407细胞的增殖明显受到抑制和破坏,细胞呈现区域性脱落调亡。本研究还发现ATRA药物作用人D407细胞后,部分细胞出现早期调亡改变现象。细胞调亡现象的出现,说明调亡在ATRA抑制人D407细胞增殖过程中起到重要的调控作用,但它们之间调控关系尚需分子生物学或其他方面的研究来进一步验证。

综上所述,本研究证实了ATRA药物具有对体外培养的人D407细胞抑制生长和诱导调亡效应。并对抑制作用的机制进行了初步的探讨和分析,认为发生抑制作用的机制可能与诱导细胞调亡有关。本研究表明,ATRA可能是预防近视形成的理想药物,为预防近视眼形成的进一步研究提供了重要实验依据。

全反式维甲酸 篇3

关键词：急性早幼粒细胞白血病,全反式维甲酸,亚砷酸,柔红霉素

急性早幼粒细胞白血病在早期容易发生弥散性血管内凝血, 患者出血严重, 病死率高。本文观察全反式维甲酸、亚砷酸和柔红霉素方案治疗初诊急性早幼粒细胞白血病的临床效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择桂林市医学院附属医院2005年1月至2010年1月急性早幼粒细胞白血病触诊患者32例, 以上患者均经过骨髓细胞学检查而确诊, 患者白细胞总数大于10×109/L, 所选患者均行弥散性血管内凝血检查, 没有患者发生弥散性血管内凝血。将上述患者分为两组, 观察组和对照组, 其中观察组16例, 男10例, 女6例, 年龄为16~69岁, 平均年龄为 (36.5±11.3) 岁;临床表现:牙龈出血、鼻出血及黏膜出血患者8例, 贫血为主要临床表现患者5例, 感染发热患者3例。对照组患者16例, 其中男17例, 女5例, 年龄为18~70岁, 平均年龄为 (38.6±9.8) 岁;临床表现:牙龈出血、鼻出血及黏膜出血患者9例, 贫血为主要临床表现患者5例, 感染发热患者2例。两组患者在性别、年龄等方面比较, 差异无统计学意义, 具有可比性。

1.2 方法

观察组患者给予亚砷酸10mg加入生理盐水500m L中静脉滴注, 每天1次, 连续用药到患者为完全缓解;给予全反式维甲酸每天30~60mg口服;给予柔红霉素每天20~40mg, 在第1~3天和第15~17天静脉注射。对照组患者给予全反式维甲酸每天30~60mg口服。

1.3 观察指标

观察两组患者治疗前后早幼粒细胞百分比、白细胞总数、用药1周后白细胞总数、早幼粒细胞百分比, 观察患者症状改善情况。

1.4 疗效评定标准

根据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》中的标准进行疗效评定。记录两组患者治疗28d后完全缓解情况。

1.5 统计学处理

采用统计学软件SPSS13.0对两组患者所得数据分析, 均数比较采用t检验, 率的比较采用卡方检验, P<0.05, 显示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗1周后外周血早幼粒细胞和白细胞总数比较

观察组治疗1周后早幼粒细胞和白细胞总数分别与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 两组患者完全缓解情况比较

观察组完全缓解14例, 完全缓解率为87.5%;对照组完全缓解9完全缓解率为56.2%。两组完全缓解率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 不良反应

对照组患者出现维甲酸综合征5例, 给予停药或者相应处理后, 患者症状缓解, 但是患者的完全缓解时间延长;观察组没有出现显著不良反应。

3 讨论

由于急性早幼粒细胞白血病患者容易发生严重感染和弥散性血管内凝血, 患者病死率高[1]。随着治疗中应用维甲酸和亚砷酸后, 急性早有粒细胞白血病患者预后有显著改善, 患者的缓解率有极大提高, 早期患者病死率显著下降。临床研究报道, 单用维甲酸不能使患者长期缓解, 患者体内残留的微小病灶存在, 故患者多在半年内复发。而单用维甲酸可发生高白细胞综合征及维甲酸综合征, 这也是导致患者死亡的一个原因[2]。

亚砷酸的作用表现为多向性。亚砷酸可与巯基结合, 导致诸多酶类反应, 产生一系列的抗击癌细胞效应。低浓度的亚砷酸能够诱导急性早幼粒细胞出现分化, 高浓度的砷剂可导致细胞凋亡。亚砷酸可抑制白血病相关细胞系细胞VEGF m RNA和相关蛋白表达, congenial抑制血管形成和白血病细胞增殖。研究表明, 亚砷酸和维甲酸合用起到协同作用[3]。柔红霉素能够诱导白血病细胞分化, 能够抑制细胞增殖。

在本文中, 观察组中全反式维甲酸、亚砷酸和柔红霉素合用后, 观察组治疗1周后早幼粒细胞、白细胞总数均有显著下降, 并优于对照组;观察组完全缓解率也显著高于对照组, 病情观察组没有1例患者发生高血细胞综合征及维甲酸综合征, 没有严重的不良反应发生。说明全反式维甲酸、亚砷酸和柔红霉素方案能够显著提高初诊急性早幼粒细胞白血病完全缓解率, 临床效果显著。

参考文献

[1]龙冰, 朱焕玲, 李建军.急性早幼粒细胞白血病预后因素分析[J].四川医学, 2010, 31 (4) :434-435.

[2]刘玉玉, 杜书静, 滕清良.急性早幼粒细胞白血病的治疗[J].山东医药, 2010, 50 (11) :111.

全反式维甲酸 篇4

关键词：急性早幼粒细胞白血病,全反式维甲酸,复方黄黛片

急性早幼粒细胞白血病 (acute promyelocytic leukemia, APL) 在临床血液系统恶性疾病中较为常见, 早期化疗大部分患儿可以获得完全缓解, 但是残余部分的APL细胞缓解后易复发[1]。APL对全反式维甲酸 (all-trans retinoic acid, ATRA) 具有独特的敏感性, 目前多以ATRA联合化疗作为诱导缓解及维持治疗手段。复方黄黛片是由雄黄、青黛、丹参及太子参合成的中成药, 具有诱导APL细胞凋亡、增强A-TRA效果及益气活血的作用[2]。本次研究主要分析全反式维甲酸联合复方黄黛片序贯治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

取2007年6月-2009年6月在本院血液科进行治疗的急性早幼粒细胞白血病患儿118例作为研究对象, 对其治疗方法及治疗结果进行回顾性分析。所有入组患儿均符合《血液病诊断及疗效标准》中对急性早幼粒细胞白血病的诊断标准, 经基因检测显示早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α (PML-RARα) 融合基因阳性。按照治疗方式的不同将所有入组患儿分为接受常规治疗的对照组64例及接受全反式维甲酸联合复方黄黛片序贯治疗的观察组54例。对照组患儿中男30例, 女34例, 年龄2~13岁, 平均 (6.76±1.12) 岁;观察组组患儿中男性31例, 女性33例, 年龄3~12岁, 平均 (6.15±0.89) 岁。两组患儿的一般资料差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 治疗方法

两组患儿诱导缓解治疗均采用全反式维甲酸 (ATRA) 联合柔红霉素 (DA) 方案:口服ATRA 45mg/ (m2·d) , 维持时间2~4周, 对症支持治疗凝血功能及血象异常, 待以上功能趋于正常时加入DA方案。休息3周后开始巩固治疗, 常规采用DA方案3个疗程 (以1个月为一疗程) , 检测细胞学形态正常、PML-RARα融合基因阴性, 脑脊液正常后再给与阿糖胞苷、MTX、地塞米松鞘内注射预防中枢神经系统白血病发生。在维持治疗阶段对照组患儿序贯应用ATRA (45 mg/ (m2·d) , 15 d) 及巯嘌呤 (6-MP) 、甲氨蝶呤 (MTX) , 具体如下:ATRA 45 mg/ (m2·d) , 15 d;6-MP, 50 mg, 2次/天、MTX 30 mg, 1次/周, 以75 d为1周期。观察组患儿序贯应用ATRA及复方黄黛片, 具体如下:ATRA 45 mg/ (m2·d) , 30 d;复方黄黛片 (0.25 g/片) 10片/次, 3次/天, 以1个月为1个周期。

1.3 观察指标

1.3.1 治疗起效情况

两组患儿接受不同治疗方案后, 比较首次完全缓解出现时间、完全缓解率、Hb开始回升时间及PLT开始回升时间差异。

1.3.2 生存时间及死亡情况

自患儿获得第一次完全缓解之日进行随访, 存活病例随访制2014年6月。总体生存时间:首次获得完全缓解之日至死亡或者截止随访之日的总时间;无复发生存时间:首次获得完全缓解之日至复发或者随访截止日的时间。

1.3.3维持治疗中的不良反应情况

患儿在接受维持治疗期间, 定期监测不良反应包括头痛头昏、末梢神经异常、肌肉关节疼痛、肝酶升高、皮疹等发生情况差异。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 18.0统计软件包进行数据分析处理, 计量资料采用均数±标准差 (±s) , 两两比较采用t检验, 计数资料的比较采用χ2检验, 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 治疗起效情况

观察组患儿接受治疗后的首次完全缓解出现时间、Hb开始回升时间及PLT开始回升时间均明显短于对照组患儿, 而化疗后完全缓解率则明显高于对照组患儿 (P<0.05) , 见表1。

2.2 生存时间及死亡情况

在随访期内, 观察组患儿的总生存时间 (31.82±4.16) 月、无复发生存时间 (19.36±3.29) 月, 随访期内死亡率为12.96% (7/54) ;对照组患儿的总生存时间 (20.16±2.43) 月、无复发生存时间 (11.05±2.16) 月, 随访期内死亡率为19 (29.69%) 。观察组患儿的总生存时间、无复发生存时间明显长于对照组, 随访期内死亡率显著低于对照组 (P<0.05) 。

2.3 维持治疗中的不良反应情况

观察组患儿在完全缓解后的维持治疗期间各项不良反应的发生率均明显低于对照组 (P<0.05) , 见表2。

注:覮与对照组比较, P<0.05

注:覮与对照组比较, P<0.05

3 讨论

APL属于急性髓细胞白血病的一个亚型, 常因严重凝血功能异常导致颅内出血死亡, 多有染色体异常而形成PML-RARα融合基因, 其对维甲酸、蒽环类药物等均具有独特敏感性[3]。近年来全反式维甲酸与化疗的联合诱导治疗使得APL患儿的完全缓解率 (complete remission, CR) 大幅提高, 其在维持治疗期间多使用全反式维甲酸、甲氨蝶呤等, 但是仍有不少患儿会出现复发, APL复发患儿的治疗难度增加, 对其预后也有不良影响[4]。APL患儿诱导缓解后复发的主要原因如下: (1) CR后巩固治疗不足; (2) APL细胞耐药; (3) 治疗药物有效性不足; (4) 髓外白血病特别是中枢神经系统白血病防治不利。鉴于APL复发的巨大危害性, 在巩固治疗后进行长期维持治疗显得十分必要, 而在维持治疗阶段加入强效但副作用小的药物更是最佳选择[5]。复发黄黛片与化疗方案序贯治疗是近年来新提出的APL综合治疗方案, 通过增强维持治疗阶段时对APL细胞的杀灭作用, 最终达到增强疗效及降低复发率。

复方黄黛片由雄黄、青黛、丹参及太子参四味中成药组成, 雄黄含四硫化四砷, 可诱导HL-60、NB4、K562等白血病细胞凋亡, 青黛可配伍雄黄增强其诱导凋亡作用, 丹参及太子参则能增强砷剂对APL细胞的抑制作用, 同时益气生血利于机体恢复[6]。A-TRA的作用机理为调变RARa蛋白, 诱导APL细胞分化成熟, 其与复方黄黛片作用机制并无冲突, 故两者联用既可延长每种药物的间歇期、避免耐药, 又能减少砷剂蓄积, 且于化疗后骨髓造血功能恢复期可充分发挥ATRA的诱导分化疗效[7]。

本研究观察组患儿在接受ATRA及复方黄黛片序贯治疗后, 所有患儿可在较短时间内获得完全缓解, 且血液指标中Hb及PLT水平可在相对较短的时间内回升, 具有常规治疗的对照组无法比拟的优势 (P<0.05) 。这与加入黄黛片进行治疗后其本身对APL细胞的诱导凋亡作用, 以及增强ATRA治疗效果均关系密切。说明ATRA及复方黄黛片序贯治疗较常规治疗方案药效更强, 且能有效促进患儿的造血功能恢复。在远期疗效方面, 最为关注的是患儿的无复发生存率及总生存时间, 白血病作为一种恶性血液疾病, 临床治疗的根本目的是尽可能延长患儿的正常生存时间。观察组患儿的总生存时间、无复发生存时间明显长于对照组患儿, 且随访期内死亡率显著低于对照组患儿 (P<0.05) 。由此可见, 复方黄黛片与化疗方案的合理应用能够延长患儿的完全缓解时间, 减少CR后复发率, 对于患儿的预后改善具有积极的作用。

化疗作为APL的主要治疗手段, 其在取得治疗效果的同时, 由也会给患儿的正常细胞及脏器带来损失, 故大多数患儿于化疗期间均承受着躯体及精神的双重折磨。过多的化疗不良反应可削弱总体治疗效果, 而复方黄黛片作用一类中成药物, 毒副作用较小且能减少其他化疗药物的用量, 有望改善患儿在化疗期间的不良感受。观察组患儿在接受治疗后的头痛头昏、末梢神经异常、肌肉关节疼痛、肝酶升高、皮疹等不良反应发生率均明显低于对照组患儿 (P<0.05) , 这与向阳[8]的研究结果一致, 也充分说明了复方黄黛片在发挥抑制APL细胞作用的同时, 还能减少对患儿正常器官功能的损伤, 这也是延长患儿无病生存时间的内在原因之一。

综上所述, 全反式维甲酸联合复方黄黛片序贯治疗可以缩短急性早幼粒细胞白血病患儿的治疗起效时间、提高完全缓解率、延长生存时间, 同时具有良好的治疗安全性。

参考文献

[1]王荷花, 许多荣, 张婧.初治急性早幼粒细胞白血病缓解后三氧化二砷和常规化疗巩固治疗疗效分析[J].中山大学学报, 2011, 32 (4) :485-487.[1]WANG HH, XU DR, ZHANG J.Efficacy of Arsenic Trioxide and Conventional Chemotherapy as Postremission Treatment for Newly Diagnosed Acute Promyelocytic Leukemia Patients[J].Journal of Zhongshan University, 2011, 32 (4) :485-487.Chinese

[2]JUNG YS, CHEONG HJ, KIM SJ, et al.Src family kinase inhibitor PP2 enhances differentiation of acute promyelocytic leukemia cell line induced by combination of all-trans-retinoic acid and arsenic trioxide[J].Leuk Res, 2014, 38 (8) :977-982.

[3]宫经新, 孟建波, 马悦.全反式维甲酸联合复方黄黛片序贯维持治疗对急性早幼粒细胞白血病长期疗效的影响[J].中国中西医结合杂志, 2012, 32 (11) :1473-1475.[3]GONG JX, MENG JB, MA Y.Effects of all-trans retinoic acidand compound Huangdai tablet sequential maintenance treatment on the long-term efficacy of acute promyelocytic leukemia patients[J].Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 2012, 32 (11) :1473-1475.Chinese

[4]刘春梅, 黄红铭, 秦燕.全反式维甲酸与亚砷酸联合化疗对急性早幼粒细胞白血病高危患儿的疗效[J].江苏医药, 2012, 38 (14) :1653-1655.[4]LIU CM, HUANG HM, QIN Y.Outcomes of treating high-risk acute promyelocytic leukemia with all-trans retinoic acid combined with arsenic trioxide[J].Jiangsu Med J, 2012, 38 (14) :1653-1655.Chinese

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[6]陶思, 周琨, 汤多壮.三氧化二砷联合全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的意义研究[J].中国中西医结合杂志, 2009, 29 (2) :111-113.[6]TAO S, ZHOU K, TANG DZ.The Sighificance of Combined Therapy of Arsenic Trioxide and All-trans Retinoic Acid in Treating Acute Promyelocytic Leukemia[J].Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 2009, 29 (2) :111-113.Chinese

[7]NAIR M, KUSUMAKUMARY P, NAIR PS.Rare presentation of pediatric acute promyelocytic leukemia as multiple lytic bone lesions:Case report and review of literature[J].J Cancer Res Ther, 2014, 10 (2) :381-383.