疫苗研究

疫苗研究（精选十篇）

疫苗研究篇1

关键词：反向疫苗学,完整基因组,抗原提纯技术

随着对天花患者进行牛痘接种, 人类对疫苗的研制走过了漫长的岁月, 疫苗为人类做出了巨大的贡献, 拯救了无数条生命。然而很长一段时间, 疫苗的研制始终没有进一步的突破, 直到反向疫苗学的出现。随着生物学技术的发展, 基因组测序成为了可能, 这就为反向疫苗学的发展埋下了伏笔。然而传统反向疫苗学也遇到了难以解决的问题——时间与大量资金投入。因此, 全基因组反向疫苗学与特异针对性反向疫苗学的出现, 为反向疫苗学的发展起到了巨大推动作用。与传统的反向疫苗学相比, 新的反向疫苗方法具有以下优点: (1) 减少了候选抗原的筛选数量; (2) 较少的花费; (3) 需要的时间更短。而新兴辅助技术的应用为反向疫苗学的研制提供了极大的便利。

1 传统反向疫苗学

1.1 机制

传统的反向疫苗学运用计算机筛选标准, 获得编码表面蛋白的基因组及细菌毒力相关基因组。对筛选的基因组进行克隆、纯化等程序以测试其抗原性。

1.2 应用

脑膜炎球菌可以引起儿童及青少年急性化脓性脑膜炎应用传统研究方法, A、C血清型的疫苗已研制成功, 而由于细菌基因的变异, B血清型始终没有有效地疫苗。Pizza等[1]首次对B型脑膜炎球菌MC58毒性菌株的基因组进行了完整地测序, 将获得的基因扩增到大肠埃希杆菌中, 发现其中350个可以成功地表达, 大约30种蛋白可以诱发人体产生保护性抗体。随后, 反向疫苗学在其他一些病菌疫苗[2]的研制上也取得了成功, 如肺炎链球菌、肺炎衣原体、结核分支杆菌、炭疽杆菌、梅毒螺旋体等, 其中的大部分已经进入了临床开发阶段。

2 新的反向疫苗学

新的反向疫苗学是在传统反向疫苗学基础上, 强调基因组的多样性, 以获得物种完整的基因图为目标, 并有针对性地进行筛选, 极大提高了疫苗研制效率。

2.1 完整基因组反向疫苗学

完整基因组的获得引发了新一轮的变革, 为反向疫苗学的研制提供了新思路。完整基因组的概念由Tettelin等提出, 包括“核心基因”、“可变基因”和“特异基因”。Maione等对B组链球菌 (GBS) 的主要致病血清型进行测序和对比, 主要筛选出4种, 其中3种抗原来自于“可变基因”, 一种由“核心基因”编码, 它们诱导的免疫反应均十分微弱。因此, 在一个高度变异的物种中, 变异性是由非必须基因决定的, 核心基因不能完全取代全基因的功能, 所以反向疫苗的研制不能忽视非必须基因。

3 特异针对性反向疫苗学

特异针对性反向疫苗学是主要针对一些特异基因, Wizemann等在对肺炎链球菌的研究中成功筛选了外膜锚连蛋白组分, 因其结构上能高度暴露在细菌表面, 成为了非常合适的候选疫苗。在此基础上, Mora等应用生物计算科学, 对GAS的基因组进行测序研究, 发现了能够编码外膜锚连蛋白组分的基因序列, 用该菌株的重组复合抗原免疫小鼠, 小鼠获得了对GAS毒株的免疫能力[6]。应用特意针对性反向疫苗学可以有针对性地提取抗原, 简化了研究步骤。

4 抗原提纯技术

4.1 计算机筛选标准

在计算机软件中进行模拟分析和预测, 筛选出一批免疫原性强、具有重要功能的可溶性蛋白, 该方法增加了计算的速度及精确度。在对GAS的研究当中, 应用数据库和计算机筛选标准筛选出合适的基因并克隆、纯化, 组配成GAS特异的蛋白微抗原, 将受试者分配为抽动患者组合对比组, 用这些微抗原免疫受试者, 发现在抽搐者体内产生了强烈而特异的免疫反应, 成功地揭示了抽动障碍与GAS抗原免疫反应之间的关系。通过计算机筛选标准, 预测还可以对一些危险的病原进行分析。

4.2 蛋白组学方法

蛋白组包括外膜锚连蛋白、导向蛋白、粘连蛋白、宿主结合蛋白等。因其暴露于菌体表面, 是免疫应答的第一靶点, 它们不但可以制备有潜能的候选疫苗, 而且可以提供新的特异性候选抗原。Rodriguez-Ortega等应用蛋白组学方法对游离于细胞膜外的蛋白进行筛选, 然后对筛选出的蛋白进行光谱测定分析, 成功获得了70多种GAS的表面蛋白。然而, 目前, 蛋白组学方法尚存在着某些缺陷:对与疫苗候选抗原免疫原性相关的研究还存在缺陷;少数候选抗原由于蛋白表达量低, 无法达到大规模生产要求;重复研究和研究面广的现状, 浪费了现有资源, 制约了疫苗的深入研究。

5 前景

反向疫苗学的出现展现了人类与疾病不懈斗争的过程, 从B型脑膜炎球菌疫苗的研制至今, 反向疫苗学已走过了11年的历程, 其发展之快无疑成为了疫苗史崭新的一页, 而新型反向疫苗学的出现加之新兴辅助技术的应用又极大推动了疫苗学的发展。相信随着科学技术的进步, 反向疫苗学将会迎来更辉煌的明天。

参考文献

[1]Pizza M, Scarlato V.Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing[J].Science, 2000, 287 (5459) :1816-1820.

乙肝疫苗的研究现状篇2

1.乙型肝炎的感染流行和预防

我国是乙型肝炎病毒感染的高流行区，几次大规模的血清流行病学调查显示，我国乙肝表面抗原携带率平均约为10%，全国约有1 亿以上人口为无症状乙肝病毒携带者。每年报告的急性肝炎病例约270 万，其中10%~ 30%为急性乙肝病例。估计现有慢性肝炎约1200万例；每年死于肝病者不下30万例，其中半数为原发性肝癌，其中约有80%是由乙肝病毒感染引起的。我国育龄妇女HBsAg 阳性率为7%，按其HBV围产传播发生率为40%推算，每年约有60万新生儿成为HBV携带者，其中1/4最终可能发展成慢性肝病, 包括肝硬化和肝癌。乙型肝炎病毒感染已成为我国最严重的公共卫生问题之一。

目前尚无针对乙型肝炎的有效药品，疫苗接种是预防乙型肝炎最有效、最经济的方法，也是降低继发性肝硬化和肝癌的有效策略。早在1991 年我国就颁布了5全国实施乙肝疫苗免疫接种规程，决定从1992年1月1日起在全国推行乙型肝炎疫苗免疫接种工作，将乙肝疫苗免疫接种纳入计划免疫管理。自90 年代以来，实施乙肝疫苗免疫接种已成为中国控制乙肝的主要对策。实施以全体新生儿免疫为主，先城市，后农村，逐步纳入计划免疫，以达到在中国经过两代人的努力，使人群乙型肝炎表面抗原携带率降至1%以下。

2．乙型肝炎疫苗的种类 2.1血原性乙肝疫苗

用高度纯化的乙肝表面抗原颗粒，以1∶2 000福尔马林灭活或以60℃10 h加热灭活的疫苗，是第一代乙肝疫苗。世纪初开始使用乙肝患者表面抗原阳性血清制备乙肝疫苗来预防乙肝病毒感染，1981年美国Merck公司研制成功了第一代乙肝疫苗，开创了病毒尚不能在实验室繁殖的情况下制备疫苗的先例。1983年中国血源乙肝疫苗也通过研究于1985年正式批准进行大量生产。血源乙肝疫苗安全有效，十几年里，为预防乙肝病毒的传播做出了积极贡献。但这种血原性疫苗存在一些问题，如血源有限，带有一定的潜在性危险等。特别是近年来艾滋病流行，血液制品易受HIV 污染，致使乙肝血原性疫苗的使用在一些国家受到限制。然而乙肝血原性疫苗的生产使用说明，乙肝表面抗原的主要蛋白可以诱生良好的保护性抗体，使人免疫乙肝病毒的侵袭, 这一事实为研制乙肝第二代疫苗奠定了良好的基础。

2.2重组乙肝疫苗

又称基因工程乙肝疫苗，是采用基因工程的重组技术，首先把HBsAg的基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌HBsAg，将其收集，提纯之后制成的乙肝疫苗，国际上称为第二代疫苗。2.2.1酵母系统表达的重组乙肝疫苗

重组酵母合成的乙肝表面抗原经纯化灭活及吸附后制成，用于预防所有亚型的乙肝病毒感染，它与血原性乙肝疫苗具有共同效果，但不含任何人血清成分，故更安全，更易被人们所接受。酵母系统表达的乙肝疫苗优点在于系统操作简单，表达量高，可用于大规模的工业化生产，成本低廉；可以装配成表面抗原颗粒，具有良好的免疫原性。重组酵母乙肝疫苗是我国目前两大基因工程乙肝疫苗之一，可代替血源乙肝疫苗。但是酵母表达系统也存在一些不足之处，如表达产生的HBsAg无糖基化，不能外分泌，产物的分离纯化较困难。

重组酵母乙肝疫苗的接种对象是乙肝易感者，包括婴幼儿、儿童和因职业关系接触乙肝病毒的成年人。但主要接种对象为婴幼儿，其次为乙肝病毒表面抗原阴性和转氨酶正常者，接种于上臂三角肌内。新生儿每次注射0.5ml（5μg），成人每次注射1ml（10μg），免疫间隔为0个月、1个月、6个月共三针。接种重组酵母乙肝疫苗所产生的抗体与接种血原性乙肝疫苗产生的抗体具有类似的免疫学性质和化学性质，这两种乙肝疫苗在健康人群中产生相同的抗体谱，因而这两种疫苗可以互换使用。已患有肝炎、急性传染病或其他疾病者禁用；对酵母或疫苗中任何成分过敏者禁用。注射时应备有肾上腺素，当有过敏反应发生时使用。2.2.2CHO表达的重组乙肝疫苗

CHO指中国仓鼠卵巢细胞，使最早应用的哺乳动物表达细胞，由猴病毒SV40启动子控制表达HBsAg。同时，以二氢叶酸脱氢酶基因作为扩增筛选基因，获得高效表达HBsAg的细胞株用于生产。哺乳动物细胞系统表达的乙型肝炎表面抗原更接近天然形式，产物的分离纯化也较简单。但是，由于哺乳动物细胞对培养条件等方面要求比较高，尤其是传代细胞使用过程中存在的不安全因素，如潜在的致癌因子等，使其应用存在一定争议。此外，哺乳动物细胞系统表达的产品在质量控制方面比较严格，导致成本上升，其推广受到了一定的限制。

重组CHO乙肝疫苗用于预防乙肝的接种对象及乙肝易感者(表面抗原阴性, 转氨酶正常),主要用于婴幼儿。一般易感染婴儿、儿童和成人，每次注射1ml(10μg)，免疫间隔为0个月注射、1个月、6个月共3针。3针后1个月100%抗体转阳。用于高危患者如肾透析患者及其他与乙肝患者密切接触者, 可用20μg/1ml规格。用于母体乙肝表面阳性(特别是e抗原阳性的)的新生儿, 应在出生后48h注射, 用20μg/1ml规格，注射间隔同上。亦可与乙肝高效价免疫球蛋白联合使用。对患有肝炎、发热、急性慢性严重疾病或有过敏史者禁用。2.2.3含前S2蛋白的乙肝疫苗

与其它只含HBsAg的乙肝疫苗不同，这种疫苗是重组哺乳动物细胞系统表达的包含S抗原和preS的重组乙肝疫苗，被称为第三代疫苗。preS含前S1和前S2两部分，含有肝细胞结合序列和高效Th细胞表位，前S抗原的T细胞免疫反应能力可以弥补S抗原无反应的发生，因而含前S抗原的疫苗可增强S蛋白免疫原性，打破免疫耐受和提高疫苗应答率。由S +前S2+前S1蛋白组成的L蛋白，虽然含有完整的preS，但在表达时不能有效的装配颗粒及外分泌。2.2.4其它重组乙肝疫苗

除了酵母细胞和CHO之外，大肠杆菌也曾经作为表达系统应用过。但因为其表达的HBsAg的融合蛋白表达量不高，易降解，表达产物不成颗粒，对疫苗的免疫原性有影响，同时抑制宿主细胞生长，有毒害作用而没有扩大临床使用。

昆虫细胞表达系统中昆虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因启动子可以指导外源基因的高效表达，表达蛋白具有糖基化，外分泌的特点，且产量非常地高。昆虫细胞表达的重组疫苗也许会成为具有应用前景的一条途径。

除各种表达系统之外还有以腺病毒为载体的活疫苗研究。在美国入伍新兵中使用4型和7型口服腺病毒活疫苗已有20年以上的历史，证明它是安全有效的。利用腺病毒载体表达HBsAg蛋白乙肝疫苗是目前研究的目标，不但生产价格低廉，而比需注射3针的亚单位乙肝疫苗更易被接受和推广。2.3新型乙肝疫苗 2.3.1联合疫苗

乙肝疫苗可与其他疫苗(尤其是儿童期疫苗)联合使用, 这样只需一针注射, 其结果无疑会提高免疫覆盖率。如百白破－乙肝四联疫苗、甲－乙肝联合疫苗。2.3.2单剂疫苗

目前正在用控释微粒技术研制单剂疫苗，该法是利用灭活疫苗一针注射诱导强的长期免疫应答。将疫苗包裹于无反应性且能很好耐受的可生物降解聚合物(聚丙交酯—聚乙交酯)中, 疫苗依其在这些微球内的分布, 在不同时间释放出不同量, 这样可模拟不同时间间隔接种数剂疫苗。动物实验已获成功, 1剂含乙肝表面抗原的微粒诱导的免疫应答几乎与不同时间接种3剂的常规乙肝疫苗相同。2.3.3佐剂改良型疫苗

我国通常采用的佐剂为铝佐剂，具有明显的免疫抑制作用，且对阻断病毒母婴传播和细胞内寄生的HBV无法产生免疫作用。目前正在研制一种新型的佐剂系统———SBAS4。SBAS4即史克必成佐剂系统，是利用脂质A的衍生物单磷酞脂质A(MPL)制备的低毒性的3-O-脱酞基-MPL与铝盐配伍成佐剂系统。同样抗原剂量的以SBAS4为佐剂的乙肝疫苗具有更好的免疫原性，且适合两剂接种程序。2.3.4治疗性乙肝疫苗

美国首先开发出治疗性的T细胞表位肽疫苗，在一次研究中26名健康受试者和90名慢性乙肝炎症患者接受了免疫。结果显示，疫苗安全、耐受性好，在74%的健康人群中免疫刺激产生特异性T细胞和HBV特异CTL。但是因为健康受试者样本太少，所以真正的免疫效果有待进一步研究。接受免疫的慢性乙肝患者中只有45%经过免疫刺激产生特异性T细胞和HBV 特异CTL，说明慢性乙肝患者存在免疫耐受。3．乙型肝炎疫苗注射无（弱）应答现象

在1992年乙肝疫苗纳入中国儿童计划免疫管理系统之后，直至2002年全面实施儿童乙肝疫苗计划管理，全国HBV总体感染率明显下降，体现了接种乙肝疫苗对乙型肝炎的良好的预防和控制效应。但对于个体而言，部分个体对乙肝疫苗接种表现出无应答或低应答。研究表明，健康人群中无应答率为10%～15%。对乙肝疫苗弱应答或无应答一直是影响某些个体免疫接种效果的重要因素，是其体内、外多种因素共同作用的结果。其中包括个体因素，例如性别、年龄、遗传因素、体质指数、免疫耐受等。这里主要关注疫苗因素和接种因素。3.1疫苗因素

乙肝疫苗的接种效果与疫苗种类有关。对不同厂家生产的乙肝疫苗研究结果显示，不同的乙肝疫苗诱导抗－HBs阳性平均滴度有明显差异。

疫苗剂量的不同也能带来滴度的差异。在一定剂量的范围内，高剂量疫苗注射的抗体阳转率和免疫后24 个月抗体平均滴度一般高于低剂量注射。而且对于母亲为HBV携带者的婴儿常规接种疫苗免疫应答性差者，第一次接种加大剂量可以提升免疫效果。

不同免疫佐剂会影响乙肝疫苗的免疫效果。以rhGM-CSF联合乙肝疫苗复种对无(弱)应答者的免疫效果优于单纯复种，rhGM-CSF有利于提高机体对乙肝疫苗的免疫应答。对于慢性肾功能衰竭进行血液透析的患者，先注射rhGM-CSF再接种乙肝疫苗，可提高抗体应答率，rhGM-CSF能够促进免疫低下个体产生保护性抗体。前文提到的SBAS4也有类似的作用。3.2乙肝病毒变异

乙肝疫苗是针对主要病毒亚型制备，使用的疫苗未包含病毒变异株的基因。如果遇到罕见的亚型，现有的乙肝疫苗也无法产生保护效应。3.3接种因素

接种途径、部位、针次、医生操作方法不正确等也与乙肝疫苗免疫应答率低有关。研究证实，皮下接种乙肝疫苗效果最差，皮内接种次之，肌内注射最佳。接种部位以上臂三角肌最佳，臂部效果较差。因臂部脂肪较厚，接种疫苗后延缓进入血循环，影响了与巨噬细胞的接触和淋巴细胞的反应。也有研究表明，对肌内注射疫苗后无应答者改用皮内接种，每2周1次，接种8周后，抗HBs即可由阴转阳，表明更换接种途径可使无应答者出现应答。增加针次也可以可以提高接种的成功率。特别是针对注射疫苗后无应答者，增加次数注射加强针可以得到比较好的应答效果。3.4免疫程序对不同免疫接种程序疫效果的研究表明，采用0、1、2个月(A组)和0、1、6个月(B组)分别给予乙肝疫苗10μg肌注，结果A组血清抗－HBs在3、6个月时已明显升高，B组则升高不明显，待24个月时B组血清抗HBs含量高于A组。该研究结果提示，短期内重复注射对乙肝病毒密切接触者有预防效果，较长时间(B组)重复注射适合大面积预防接种。国外研究者也认为，按0、1、6月程序接种比0、1、3月程序预防接种果更好，进一步研究显示，0、1、6 组与0、1、7组和0、1、8三组间免疫效果无显著性差异。所以现在主要采用免疫间隔0个月、1个月、6个月进行注射。4．总结

乙型肝炎是传染性强且难以治愈的病毒性疾病，乙肝疫苗是目前控制乙型肝炎感染率的最有效手段，近些年的实行接种的免疫效果有目共睹。针对乙肝疫苗注射无应答的情况，加大剂量、针数，或者改变疫苗的注射方法、种类，也许会达到一定的免疫效果。目前，各种新型疫苗，如单剂疫苗、佐剂改良疫苗和治疗性疫苗是乙肝疫苗研制的重要方向。

参考文献

疟疾疫苗的研究现状篇3

摘要：目前，疟疾仍然是一种严重威胁人类健康的寄生虫病。由于疟原虫复杂的生活史，致使疟疾疫苗的研发困难重重。本文综述了当前的疟疾疫苗种类，并且介绍了其中较为先进的疫苗，为今后疟疾疫苗研发提供参考。

关键词：疟疾；疫苗；研究

中图分类号： R531.3 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-08-77-2

1 研究疟疾疫苗的必要性和可行性

疟疾，是一种流行在热带，亚热带地区的寄生虫疾病，由携带有疟原虫的雌性按蚊叮咬人体而导致感染。目前，感染人体的疟原虫有五种，分别是疟原虫属中的间日疟原虫，三日疟原虫，卵形疟原虫和诺氏疟原虫。2012年，全球受到疟疾威胁的人数就达到了34亿，大约有2亿人感染疟疾，死亡人数达到63万，而且其中大部分是5岁以下的婴幼儿和怀孕初期的孕妇[1]。虽然从2000年以后，非洲疟疾的发病率和死亡率都有所降低，但是由于一些地区长期使用单一的抗疟药物，导致疟原虫出现抗药性，并且有迅速向周边蔓延的趋势，因此就需要一种更为有效的治疗防控疟疾的方法。

早在20世纪70年代初期，David Clyde和他同事尝试研发疟疾疫苗。他们收集经过辐射的恶性疟原虫子孢子，将其注射到志愿者体内，实验结果是部分志愿者接种之后再没有感染疟疾。至此，提供研发疟疾疫苗可行性的确凿依据[2]。早期研发的疟疾疫苗都是通过接种经辐射降低毒性的疟原虫子孢子，来激发人体产生对疟疾的免疫，但是效果并不尽人意[3]。随着分子技术的推广，分子疫苗也融入到疟疾疫苗的研发进程中。通过寻找疟原虫携带的有效抗原，来进行疫苗的研制，相继出现30多种疟疾疫苗，但是都处于临床实验阶段[4]。从2006年起，世界卫生组织每年都会公布有关疟疾疫苗研发进程的汇总信息，以便于疟疾疫苗研究者进行参考交流[5]。目前，疟疾疫苗研发的主要方向有两个：一是降低临床疟疾的发病率，适用于感染疟原虫种类单一或疟疾的重症患者。此类疫苗研究主要针对恶性疟原虫和间日疟原虫的疟疾感染；二是阻断疟疾的传播，目的在于保护疟疾流行高危地区的人们，最终根除疟疾[6]。

2 疟疾疫苗的分类

疟原虫具有复杂的生活史，存在两个宿主人和按蚊。在人体内时疟原虫处于无性裂殖阶段，而在按蚊体内时是疟原虫的有性生殖阶段。因此，疟原虫在不同时期的抗原也存在差异，且单一抗原还具有多个表位，这些因素使得疟疾疫苗的研发难度增加[7]。现有疟疾疫苗的分类主要依据是疫苗对疟原虫作用的时期，即疟原虫生活史的哪一阶段而划分的，主要分为三类，红细胞前期疫苗，红细胞内期疫苗和传播阻断疫苗。

2.1 红细胞前期疫苗

此类疫苗的抗原选自疟原虫子孢子或红细胞前期感染疟原虫后的肝细胞。通过抗原激起人体的免疫来抵御疟疾初期感染，防止疟原虫的子孢子进入肝脏或在肝细胞内存活[8]。疫苗研发涉及到的几种候选抗原有CSP，ME-TRAP，CelTOS，LSA等。2013年世界卫生组织公布的疟疾疫苗中，临床实验阶段的红细胞前期疫苗有13种，都是针对恶性疟原虫引起的疟疾。其中，仅有RTS，S/AS01E 进入了临床Ⅲ期实验，其余的疫苗大部分都处于临床Ⅰ期实验中[9]。

RTS，S/AS01E是含有NANP表位的重组疫苗，此疫苗的抗原是C端与HBsAg的N端相融合的恶性疟原虫子孢子蛋白（PfCSP），并且在研制过程中向疫苗中加入其公司自主研发的保护佐剂系统AS01。RTS，S/AS01E是在比尔·盖茨基金会资助下由葛兰素史克（GSK）公司研制的面向婴幼儿的疟疾疫苗。目前正在进行的临床Ⅲ期实验中，分为两个年龄组6～14周婴儿和5～17个月幼儿，在非洲的8个国家设立13个疫苗接种站[10]。2013年10月公布的部分临床Ⅲ期实验结果显示：在5～17个月组中，首次感染疟疾的发病率降低了55.8%，重症疟疾的发病率也降低47.3%。并且在过去的18个月实验里，医院收治疟疾患者的人数也降低41.5%。在6～14周的婴儿组中，虽然首次感染疟疾的发病率降低了30.1%，但是疫苗对于重症疟疾的效果并不明显[11]。在2014年末，世界卫生组织将会得到RTS，S/AS01E临床第Ⅲ期实验的完整结果，有望在2015年正式投入临床应用。

2.2 红细胞内期疫苗

红细胞内期的疟原虫对于人体是最具有破坏性的。裂殖子入侵红细胞并且大量繁殖，致使红细胞破裂。因此，该期疫苗的靶点就是阻止裂殖子侵入红细胞，从根本上降低疟疾的发病率，对于非洲处在疟疾流行地区的人们来说具有重要的意义。目前，已被用于疫苗研制的抗原有AMA-1，MSP3，MSP2，GMZ2等。其中，抗原AMA-1的应用最为广泛，将其重组后与不同的佐剂相配合，可以有效的抑制血液中裂殖子入侵红细胞[12]。在初期临床实验中，MSP3为抗原的疫苗表现出明显的抑制疟疾感染的效果[13]。2013年，世界卫生组织公布处于临床实验阶段的红细胞内期疫苗有14种，均是针对由恶性疟原虫引起的疟疾。它们分别是EBA175 RII，FMP2.1/AS01B ，GMZ2，GMZ2 field，pfAMA1-

DiCo，P27A，MSP3 field，SE36，ChAd63 AMA1/MVA AMA1，NMRC - M3V-Ad-PfCA，NMRC-M3V-D/Ad-PfCA Prime/

Boost，ChAd63/AMA MVA/AMA1+alhydrogel/CPG7909，PfPEBS，ChAd63 MSP1/MVA MSP1。

2.3 阻断型疫苗

一般此类疫苗作用于疟原虫的配子融合前后，抑制疟原虫有性生殖的同时发挥阻断疟疾传播的作用。现有的此期间可以选择的疟原虫候选抗原有Pfs25，Pfs27，Pfs28，Pfs45等。Pfs25是较为常用的抗原，它属于合子和动合子表面抗原[14]。迄今为止，有性生殖阶段疫苗中仅有疫苗Pfs25-EPA进入了临床Ⅰ期实验[15]。

此外，由于近些年间日疟原虫的感染病例有上升趋势，并且在一些区域出现同时感染恶性疟原虫和间性疟原虫的病例，引起人们对间日疟原虫的关注，间日疟原虫的疫苗研发也被纳入疟疾疫苗研究中。目前间日疟原虫的疫苗ChAd63/MVA PvDBP，已经进入了临床Ⅰ期实验，其所选用的抗原为PvDBP RII。

3 结语

虽然现在处于临床实验阶段的疟疾疫苗已有几十种，但是在疟疾疫苗的研发上仍存在很多问题：一是有效抗原的筛选不足。现有的抗原表现出的抗原性并不强烈，致使疫苗的效果不佳，只有部分个体可以得到免疫保护；二是用于疫苗研究的实验模型不够完善，现有的动物实验模型不适合研究疫苗保护的持久性；三是研发出的疫苗普遍存在免疫后的保护持久性不强，产生抗体水平较低。目前仅有疫苗RTS，S/ ASO1E进入临床Ⅲ期实验，其有望成为第一个临床应用的疟疾疫苗，为未来攻克疟疾疫苗研发中存在的问题，获得高效疫苗奠定基础。

参考文献

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核酸疫苗研究进展篇4

1核酸疫苗免疫的作用机理

核酸疫苗的免疫机制比蛋白性抗原或病毒性抗原作用机体产生免疫反应机理更为复杂。核酸疫苗由外源抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒构成,其被导入宿主细胞后被周围的组织细胞、抗原递呈细胞(APCs)或其他炎性细胞摄取,在载体上的启动子调控下转录出抗原基因m RNA后进入胞浆内表达病毒体的蛋白质抗原,再经加工后形成的多肽抗原与宿主细胞主要组织相容性复合物MHCΙ和MHCII分子结合,刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和刺激辅助性T细胞[1]。最终引发了免疫系统的响应。免疫系统的响应程度与不同免疫部位、细胞的表达程度和是否增加免疫调节基因有关[2]。

2核酸疫苗的构建与接种

核酸疫苗的构建是核酸疫苗研究的基础和重要环节而核酸疫苗的接种方法等对核酸疫苗的免疫效果有着显著影响。核酸疫苗构建主要包括表达载体的构建、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定等几个方面。

2.1外源抗原基因的选择与分析外源抗原基因即原体保护性抗原的编码基因,其决定核酸免疫效果的关键,能够诱发机体产生保护性免疫,因此最好选择病毒的主要保护性康源基因。

2.2表达载体的选择与构建核酸疫苗载体有多种但主要以PUC或p BR322为基本骨架。载体选择需含真核启动子(CMV、RSV或SV40等)且载体自身不在真核生物细胞内表达,但其重组的目的基因基因能在真核细胞内长期、高效表达。若有些载体中含有内含子序列,其能够明显提高外源基因的表达水平[3]。实践中一般选择CMV启动子,CMV启动子的转录活性最高、调节功能最好且应用也最多。1998年Haribarants等[4]用sindbis病毒复制子的载体构建了表达单纯疱疹病毒的核酸疫苗,质粒在动物体内复制,其免疫效果高出非复制型载体100倍以上。将免疫调节因子基因同时克隆致核酸疫苗载体可以提高免疫效果。已经成功构建的表达载体有很多种,目前常用的有:pc DNA3、PRC/Rsv、Rsv/CAT、Rsv-Neo、VR1320、p BK和p GFP等等。其共同特点是都具有在真核细胞表达的启动子。

2.3抗原基因与表达载体的连接与鉴定外源抗原基因与表达载体的连接,即克隆进行表达载体时,必须考虑外源基因开放阅读框的完整性、方向、插入位置及表达基因m RNA起始部位的Kazaka序列以及表达载体到达抗原蛋白能力等因素,以保证免疫效果。Heinen等报道当用强毒攻击接种表达流感病毒M2e NP融合蛋白质粒的易感猪时,免疫猪却表现出较非免疫对照组更严重的临床症状和更高的死亡率[4]。说明了不同基因键的连接方式几各基因表达产物间的关系,直接影响着DNA疫苗的免疫效果。

2.4核酸疫苗接种核酸疫苗可以通过基因枪和气枪法导入宿主细胞使之能产生有效的诱导。核酸疫苗可接种的部位有肌肉、静脉内、皮下、黏膜、鼻内、皮内及腹腔等多种途径,所有接种方法都可诱导产生免疫应答[5,6,7]。核酸疫苗接种方法多种多样,Wolf认为肌肉细胞通过其特有的T小管管状系统和细胞膜穴样内陷将外源基因纳入,在该基因携带的强启动子作用下表达相应蛋白[8]。Fynan等(1993)用不同的方式对核酸免疫的效果进行比较,结果发现用基因枪接种比直接注射核酸疫苗效果好600~6000倍,而且王凯研究表明,肌肉注射免疫效果比鼻腔内、腹腔内和静脉内免疫效果好。更有周世力报道DNA疫苗与蛋白质疫苗交替注射有可能获得更好的免疫效果[9]。

3影响核酸免疫效果的因素

核酸的免疫效果受到多种因素的影响,例如外源抗原基因的选择,表达载体的构建与选择,免疫佐剂的类型、剂量以及注射次数,动物接种部位的预处理,试验动物年龄和品系的影响等。实验证明含CMV、RSV的载体表达水平较高,在接种核酸疫苗时加入细胞因子佐剂时能明显提高机体的体液免疫和细胞免疫反应同时许多研究结果表明幼龄动物接种DNA时比老龄动物接种DNA在体内表达水平较高,产生的免疫应答较强[9]。

4核酸疫苗的研究现状与展望

近几年来有关核酸疫苗在人类及动物生产预防和治疗作用的研究不断增加,应用范围也逐渐扩大。接种核酸疫苗后蛋白质在宿主细胞内表达产生的免疫保护力较普通的疫苗强,也不会引起对机体的不良反应。核酸疫苗以其制备简单,性质稳定,使用方便,易于保存与运输等优点显示了广阔的应用前景。核酸疫苗作为一种重组质粒,易在工程菌内大量扩增,提纯方法简单,且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用,制备多价核酸疫苗,这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应。核酸疫苗具有持久性免疫,一次接种可获得长期免疫力。但尚处于研究探索阶段,还存在一些潜在危害,如质粒DNA可能诱导自身免疫反应,但是人和动物的许多试验表明质粒DNA诱发自身免疫性疾病的可能性较小。目前已有一项DNA疫苗的接种研究表明,免疫动物血清中未检测到抗DNA抗体。而且持续表达外源抗原可能产生一些不良后果,质粒长期过高水平地表达外源抗原,可能导致机体对该抗原的免疫耐受,在成年动物尚未见到因DNA疫苗接种而诱发免疫耐受的例子。但新生动物的免疫系统尚未成熟,可能将外源抗原认为自己成分而形成耐受。另外,持续低水平表达的抗原可能会被血中的中和抗体清除,不能引起足够的免疫应答,从而使疫苗的预防作用得不到充分的体现等。综上所述核酸疫苗虽然具有广阔的发展前景但是仍需要科研者的不懈努力,不断改进核酸疫苗的制作流程和工艺以及优化其接种方法等,使其更好地服务于人类。

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基因工程疫苗研究进展篇5

[关键词]基因工程疫苗核酸疫苗免疫

自Edward Jenne医生发明天花疫苗开始，已有几千种疫苗被开发出来，疫苗逐渐成为人类与疾病做斗争的重要武器之一。传统疫苗具有生产的成本高、疫苗中含强毒性致病物质、减毒株突变及部分疾病用传统的疫苗防治收效甚微等缺点。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。

DNA重组技术为新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指应用DNA重组技术，通过基因组改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，进而达到防治传染病的目的。迄今为止，基因工程疫苗是最先进的疫苗，相比传统疫苗而言它有巨大的优势。

一、基因工程疫苗种类

应用基因工程技术开发的已经使用和正在研制的新型疫苗种类主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物可食疫苗等。

(一)基因工程亚单位疫苗

该类疫苗仅包含病原体的抗原，不包含病原体的其他遗传信息。基因工程亚单位疫苗通过表达病毒的主要保护性抗原蛋白获得免疫原性，具有安全、便于规模化生产等优点。该类疫苗的制备步骤如下：

①了解编码具有免疫原活性的抗原蛋白对应的`基因信息。②从大肠埃希氏菌、酵母、转基因动植物等表达系统中选择最适表达载体。如：酵母表达系统已经大规模生产人用重组肝炎疫苗。基因工程亚单位疫苗可细分为：细菌性疾病、病毒性疾病和激素亚单位疫苗。

1.细菌性疾病亚单位疫苗

分离和鉴定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究细菌性亚单位疫苗的基础，目前已研制出与炭疽、大肠杆菌病、牛布鲁氏菌病等对应的亚单位疫苗，均能对相应的疾病产生有效的保护作用。史百芬等发现RSVF蛋白亚单位疫苗(PFP-1)注射接种后接种者无呼吸道疾病加剧作用。

2.病毒性疾病亚单位疫苗

大多数病毒基因组已经被克隆和完全测序，因此病毒性亚单位疫苗的研制相对简单。现在病毒性疾病亚单位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中国台湾省科学家研制的禽流感亚单位疫苗效力远比灭活疫苗高。祁贤等应用酵母系统表达生产鸡传染性腔上囊病病毒VP2亚单位疫苗，发现其可完全取代传统灭活疫苗。

3.激素亚单位疫苗

该疫苗是以生长抑制素为免疫原的一类疫苗。杜念兴等将大肠埃希氏菌中表达的生长抑制素基因与HbsAg基因融合，通过Vero细胞表达，结果发现表达产物具有良好的免疫原性。杜念兴等用SS基因疫苗免疫小鼠，发现口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小肠表达HBsAg/SS融合蛋白，推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。

(二)基因工程活载体疫苗

此类疫苗生产主要有两种方法，一是使非致病性微生物表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，进而产生免疫原性，另一种是致病性微生物被修饰或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活载体疫苗结合了活疫苗和死疫苗的共同优点，在免疫力上具有很大的优势，分复制性和基因突变活载体疫苗。

(三)核酸疫苗

核酸疫苗接种后，抗原合成、增加与病原自然感染十分相似;还具有免疫原性单一;易构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产等优点。

二、展望

疫苗开发具有安全性、有效性、价廉性、易推广性等特点。基因工程疫苗具有传统疫苗无可比拟的优点，是疫苗产品开发的主要方向。研制多联或多价疫苗是基因工程疫苗的主要发展方向。

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犬细小病毒病DNA疫苗的研究进展篇6

关键词：犬；细小病毒；DNA疫苗

中图分类号： S858.292.265+.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0231-03

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一种急性传染病，该病毒属细小病毒科，细小病毒属[1]。病毒经消化道感染健康犬后，主要攻击2种细胞，一是肠上皮细胞，二是心肌细胞，分别表现出血性肠炎型和非化脓性心肌炎型，心肌炎以幼犬多见[2-3]。CPV自1978年被首次分离以来[4]，已在世界范围内迅速传播。目前，该病主要通过弱毒苗预防，但免疫效果不理想[5-6]，因此，新型基因工程疫苗逐渐成为研究的热点，特别是DNA疫苗倍受国内外学者关注。

1 作用机理

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是20世纪90年代Wolff等首创的新型疫苗[7]，把主要抗原基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注入动物体内，使外源基因通过宿主细胞合成抗原蛋白，进而诱导宿主产生特异性免疫应答[8-9]。

DNA疫苗接种机体后，质粒被周围的组织细胞（如肌细胞）抗原递呈细胞（APC）或其他炎性细胞摄取，被吸收的质粒在机体启动子作用下合成mRNA，并被细胞质中的酶复合物-蛋白酶体所降解，形成氨基酸肽段，然后經抗原转运蛋白（TAP）转运至内质网腔进一步修饰成氨基酸短肽[10]。这些短肽片段在内质网腔与新合成的MHC-Ⅰ分子的抗原结合槽相结合，形成抗原肽-MHC-分子复合物，并转运至细胞表面作为免疫原信号肽供 CD8+细胞毒性T细胞（CTL）所识别，导致其活化、增值并分化为具有杀伤能力的效应 CTL，诱导产生较强的细胞免疫反应[11]。

另一部分蛋白抗原从分泌它们的APC的细胞膜上进入MHC-Ⅱ类型途径，DNA疫苗基因表达的抗原蛋白未经加工被释放出去由专职的APC摄取后，在细胞内经过吞噬体和溶酶体作用后被降解成具有抗原特异性的多肽，这些多肽同细胞内质网产生的 MHC-Ⅱ分子相结合并转运到细胞膜上，被CD4+辅助性T细胞（Th）的受体识别。Th细胞分泌淋巴因子，刺激B 细胞转化为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异型的体液免疫应答[12]。

DNA疫苗具有许多优点：可同时诱导体液免疫和细胞免疫、可将含有不同抗原基因的质粒混合起来联合免疫、可在同一载体上插入多种基因、可持续表达外源蛋白、易于构建和制备、稳定性好。近年来，在犬细小病毒病新型疫苗的研发中也显示出其独特的优势。

2 抗原基因

CPV基因组主要编码VP1和VP2 2种结构蛋白。VP2基因全长1 755 nt，编码的584 氨基酸残基组成的蛋白是构成衣壳的主要蛋白，约有60 个拷贝，VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围[13]，表位图谱试验表明，结合中和抗体的全部抗原决定基因都在VP2中[14]。VP1基因全长2 256 bp，包含VP2基因的完整阅读框架，2者的3′端完全重叠。VP1、VP2的序列基本相同，只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列，这段序列中含有T细胞识别表位，能够激发机体产生细胞免疫，而细胞介导的免疫应答反应是基因免疫诱导机体抵抗病原攻击的一个重要机制。因此VP1、VP2都可以作为DNA疫苗的主要抗原基因。

Parrish等用含CPV VP1基因的真核表达质粒免疫犬，攻毒保护试验证明基因疫苗能够保护犬不被CPV感染[15]。Jiang W等构建了表达CPV VP1蛋白的真核表达载体pGT36VP1[16]，将5只9月龄的犬分别接种不同剂量的pGT36VP1，结果显示免疫1周后，血清中可检测到抗体IgG，2周左右达到峰值，约14周后抗体消失，所有免疫pGT36VP1疫苗的犬均能抵抗 CPV强毒的攻击，而生理盐水的对照组全部发病，证实了接种CPV VP1核酸疫苗能够诱导机体产生抗CPV的特异性免疫反应。邱薇等构建真核表达载体pIRES VP1重组质粒也能抵抗 CPV强毒的攻击[17]。

Gupta等含CPV VP2 DNA质粒表达载体免疫家犬获得了较好的免疫反应[18]。韩冬梅等利用DNAstar软件对CPV VP2基因以及编码的氨基酸序列进行分析，确定了VP2蛋白抗原表位基因（VP2蛋白第490～559位氨基酸）[19]，即 VP2-70 构建了融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70，也能够诱导机体产生抗体IgG2a和IgG1，引起淋巴细胞增殖。

3 载体选择

构建基因疫苗之前，载体的选择十分重要。在CPV DNA疫苗中，常用的载体主要有invitrogen公司的pcDNA系列、pVAX1和Clontech公司的pIRES载体。pcDNA系列载体是常用的真核表达载体，其启动子和增强子都源于巨细胞病毒（CMV），含有牛生长激素（BGH）转录终止序列，不同程度提高了目的基因的表达，但要注意的是插入的片段序列必须自带ATG起始密码子和TAG（或TGA、TAA）终止密码子。pVAX1是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体试验的核酸疫苗载体。谢之景等利用pVAX1载体构建了CPV DNA疫苗的真核表达质粒pVCPV能够有效诱导小鼠产生抗CPV的特异性体液免疫和细胞免疫[20]。pIRES载体由于IRES元件的存在，可以同时表达2个基因。Patial等将狂犬病病毒的糖蛋白基因与犬细小病毒VP2基因连接到pIRES载体，构建了能同时表达2种抗原蛋白的双顺反子DNA疫苗，同时分别构建了2种抗原的单顺反子 pIRES疫苗[21]。将双顺反子DNA疫苗免疫小鼠，并与单顺反子疫苗的免疫效果进行比较。结果发现，2种DNA疫苗分别对狂犬病病毒和细小病毒的抗体中和反应效果相同，并能产生有效的免疫保护，证明该双顺反子DNA疫苗作犬用疫苗能够有效诱导对狂犬病病毒和犬细小病毒的病毒中和反应。

4 分子佐剂

犬细小病毒病DNA疫苗与其他DNA病毒疫苗一样，存在着免疫原性较弱，免疫动物后常常不能产生较强的保护性免疫反应。为了提高DNA疫苗的免疫效果，研究者们选用了不少分子佐剂来增强DNA疫苗的免疫原性，如CpG、热应激蛋白（HSP）、白细胞介素类（IL）、大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）、集落刺激因子（GM-CSF）等[22-25]。

王璐等将pcDNA-VP2和pcDNA-cIL-2共免疫小鼠，35 d后血清中VP2的抗体水平（1 ∶5 120）极显著高于单免疫组；淋巴细胞增殖试验表明，单免疫组和共免疫组刺激指数均极显著高于阴性对照组，共免疫组刺激指数又显著高于单免疫组；共免疫组γ-干扰素的表达水平极显著高于阴性对照组和单免疫组，cIL-2可显著提高CPV VP2 DNA疫苗的应答水平[26]。孙岩等将pcDNA-CD5-VP2和pcDNA-cIL-7共免疫小鼠，结果表明，小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于单免疫组，对IgG2a和IgG1抗体的产生有明显的促进作用；淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于单免疫组，cIL-7可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答[27]。陈慧慧等研究表明，cIL-7和cIL-2对VP2 DNA疫苗免疫原性的增强作用具有协同效应[28]。潘素敏等研究表明，IL-12可显著提高VP2 DNA疫苗的免疫应答水平[29]。

韩冬梅等研究证明，无论通过LTB基因表达载体与VP2抗原表达载体共免疫小鼠或利用LTB与抗原融合基因表达载体免疫小鼠，LTB基因均可明显提高小鼠对VP2基因疫苗的体液免疫应答水平，但以LTB与VP2融合基因免疫效果明显[19]。贾启恒等研究证明，犬GM-CSF可明显提高小鼠对VP2 DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答水平[30]。

5 展望

DNA疫苗是新兴的一种疫苗，以其独特地诱发机体高水平细胞免疫反应而倍受研究者关注，但是DNA疫苗在安全性的方面尚有争议，如遗传毒性作用即质粒DNA与宿主基因组整合的问题、表达抗原的载体自身可能有其他生物活性、致肿瘤性、自身免疫疾病等[31]。近年来，研究出的自杀性DNA疫苗，主要以甲病毒（主要是SFV和SINV）复制子为载体在基因免疫中得到广泛应用[32-33]。实践证明，这种以复制子为基础的DNA疫苗优于常规DNA疫苗[34]。自杀性DNA疫苗的裂解性表达消除了DNA疫苗的动物机体内长期存在所带来的各种隐患[35]。目前，犬细小病毒DNA疫苗的研究虽然道路曲折，但经过大量的实践研究，仍然认为是可行的，DNA疫苗是新的发展方向，随着科学研究的不断深入，DNA疫苗在犬细小病毒病的免疫预防中一定会发挥更重要的作用。

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疟疾疫苗研究进展篇7

关键词：疟疾,疫苗,候选抗原

人类对疟原虫灭活疫苗的研究已经有近一百年的历史了, 20世纪60年代出现的辐照子孢子的方法为疫苗的研究提供了巨大的帮助。在1983年环子孢子蛋白 (circumsporozoite protein, CSP) 一个主要的子孢子表面抗原称为了第一个被克隆的疟原虫基因, 并且以此为基础的疫苗很快出现[1]。如今一些抗原和佐剂组合, 已经进入了临床试验。本综述对于最近相关领域的一些进展进行总结。

疟原虫属于孢子虫刚真球虫目疟原虫科, 是人体疟疾的病原体。当疟原虫处于孢子时期时可借雌性按蚊通过吸血进入脊椎动物体内[2]。一些孢子顺血液进入肝脏并且感染肝细胞。到达裂殖子时期后它们可以裂解肝细胞并感染红细胞, 在随后的红内期会出现相关临床症状。在无性繁殖进行了几个循环之后, 一些被感染的红细胞形成配子母细胞, 一旦再次被雌性按蚊吸取, 则在其体内进行受精形成卵囊。在卵囊中产生的孢子移行到蚊体的唾液腺, 准备进入下一次感染。本文将根据疟原虫生活史, 分别从红前期 (Pre-erythrocytic stage, PE) 、无性繁殖期 (Asexual stage) 、传播阻断期 (Transmission blocking) 的角度进行相关概述。

1 红前期 (Pre-erythrocytic stage, PE)

由子孢子构成疟原虫感染的阶段, 它们是理想的一种理想的疟疾疫苗的靶点。红前期会延续几天, 是个非常特别的保护性免疫目标, 因为在这一阶段是无临床症状。在20世纪60年代, Nussenzweig、Va n d e r b e rg[3]做了一系列实验定点辐照孢子用来保护脊椎动物。但是对于大量的蚊虫叮咬和孢子, 就需要产生稳定的免疫应答。于是开始寻找保护孢子的表面抗原, 随后确定了以环子孢子蛋白 (circumsporozoite protein, CSP) 为靶点[4]。

猿猴疟疾寄生虫的环子孢子基因P.knowlesi H株是第一个被克隆的[5], 不久便在酵母中成功表达。并且根据蛋白结构推导出新的功能结构, 例如在中心部位有个有12个由12个氨基酸组成的重复区域的免疫结构域[6]。但是人们很快发现, 在P.knowlesi、第蟹猴和间日疟原虫中, 同一株保守的重复肽全部的重复区域可以分布在不同株中[7]。但一株产生的抗体与其他株却没有交叉反应[8]。在一些疟疾抗原上发现不同的重复域有相似的产生机制[9]。然而在恶性疟原虫CSP的基因中发现含有4个氨基酸重复肽 (4-amino acid repeat peptide, NANP) [10], NANP同样也在其他几个品种中出现, 但有一点微小的变化。在1987年进行了第一次基于NANP的疟疾疫苗实验[11]。该疫苗失败, 失败的原因是一个T细胞表位不足。但NANP仍是对孢子免疫反应最普遍的结构域。

生物学与技术的融合使CSP已经成为了最广泛的研究疫苗的靶点。通过基因敲除学研究表明它是一个重要的结构蛋白, 而疟原虫在缺少这种蛋白的情况下生长过程会被抑制[12]。但是CSP与肝细胞相互作用的结构域是是一个高度保守的细胞粘附序列与I型凝血酶的蛋白羧基末端的重复序列极其相似[13]。其他孢子抗原例如血小板相关黏附蛋白 (thrombospondin-related adhesion protein, TRAP) 和肝期抗原都被发现, 目前红前期疫苗的抗原表位由CSP, TRAP和一些肝阶段抗原组成。这是值得注意的NANP的CSP的结构域它是大部分亚基组分的组成部分。现在已经有众多组合的该抗原制剂的药效试验。

2 无性繁殖期 (Asexual stage)

由于人类对于疟原虫的天然免疫, 疾病症状在病程达到疟原虫血液期并进入红细胞中时出现。对疟原虫无性阶段的治疗方案大都没有针对疟原虫进行攻击, 而是更倾向于对疾病的严重程度的削弱。研究表明从被免疫过的成人体内提取出的γ-球蛋白等可以清除易感人群体内的疟原虫, 由此表明这种抗体的治疗潜力[14]。其中免疫球蛋白G亚型和单核细胞[15]被提出来发挥这种保护的重要作用。

对于无性阶段疟疾疫苗的发展源于Trager和Jensen确立的疟原虫人工培育, 以及肽生物学的确立。用人工培育过程中得到的肽片段, 确定了4个合成肽在小鼠模型中可以导致强烈的免疫反应, 于是产生了无性期第一阶段疫苗SPf-66[16]。它很快从灵长类中的实验过渡到临床实验。但是在非洲的实验结果显示有效率不是非常稳定。

如今裂殖子表面抗原介导的疫苗已经成为潜在的候选疫苗。其中首先被作为候选疫苗的研究裂殖子表面蛋白1 (merozoite surface protein1, MSP-1) 和顶膜抗原1 (membrane antigen-1, AMA-1) 。在夜猴的模型中观察天然亲和纯化的MSP–1在无性期的有保护作用。这表明为MSP–1在寄生虫中被处理, 于是MSP–1的前体蛋白裂殖子表面抗原基因首次被克隆。虽然该蛋白质被发现多态性, 但在羧基片的42和19 kDa处存在保守性和保护作用, 这些结构域组成了一些疫苗的部分结构[17]。AMA-1蛋白首次被发现时作为从P.knowlesi得到的66 kDa的保护性蛋白。于是该基因被克隆并发现其在P.knowlesi中为保守基因片段。

2.1 对于怀孕期间妇女的相关疟疾疫苗

虽然生活在疟疾流行地区的人们成长到性成熟的时候可以获得临床免疫力, 但妊娠却仍十分危险。PAM是影响流行区域的产妇和围产儿发病率和病死率的重要因素之一。恶性疟原虫感染怀孕妇女的主要机制是, 被感染的红细胞累计在产妇胎盘的血管当中, 滋养体和裂殖题得以隐藏在胎盘当中。硫酸软骨素A (Chondroitin sulphate A, CSA) 一直被视为胎盘粘附受体的结构域, 当然更多受体的可能性仍不可忽视。Duffy’s实验室第一次提出证据表明胎盘中被感染红细胞的表面蛋白可以作为产生保护性免疫的靶点[18]。他们发现来自于感染过疟疾的经产孕妇飞血浆IgG可以抑制孕妇被感染的红细胞黏附于CSA上。在疟疾感染妊娠与易感性的关系表明寄生虫蛋白 (parasite protein, S) 是妊娠特异性并且是高度免疫原性提升了对于PAM的新的干预策略。经证明Pf EMP-1家族中的Var-1CSA和Var-2CSA是CSA粘附机制的候选抗原[19]。Var-2CSA在克隆株之间相对保守, 现在的主要策略集中在这些蛋白地表达和重组抗原上。

2.2 自身免疫, 保守的蛋白质, 抗毒性免疫和疟疾的疫苗

非洲热带罕见自身免疫紊乱和北美人对于自身免疫紊乱的易感性已经引起了更多人的注意。Greenwood等把这种差异归于非洲热带地区的居民经常接触多种寄生虫疾病 (包括疟疾) , 于是就可以假设这种成年人体内的自身抗体可以帮助他们防治疟疾[20]。临床上发现保护人们的自身抗体和自身免疫疾病的极其相似, 如系统性红斑狼疮, 类风湿关节炎等。

这些自身抗体中的一部分有可能为人类提供预防疟疾的保护。抗核糖体P蛋白抗体和抗烯醇化酶抗体可以防治疟疾同时可以使得P-蛋白和烯醇移位到细胞表面[21]。由于抗P蛋白抗体已知可以与双链DNA起交叉反应, 我们可以推断抗双链DNA抗体也可以起到保护作用。值得注意的是这些抗体的滴度在疟疾免疫的成年人中的分布频率比自身免疫疾病的患者低100到1000倍[22]。因此预计这些低水平的抗体交叉反应的累积可以预防疟疾。到目前为止, 疫苗仍是最好的免疫反应, 我们缺乏相关知识去控制免疫反应的强度。

3 传播阻断期 (Transmission blocking)

蚊体阶段阻断传播 (Mosquito stage transmission blocking, MSTB) 或叫做阻断传播疫苗 (transmission blocking vaccines, TBV) , 灭蚊阶段抗原的目标靶点为配子, 受精卵或动合子。这一策略可用于控制疟疾, 疟原虫在传输诱导和诱导寄生虫病理生物学特征现在两个不同的宿主中。1976年传播阻断这个主意被Gwadz[23]等提出, 并表明在鸟类的疟原虫由配子母细胞激起的抗体, 有能力杀死在蚊体中的配子体而不是禽类的宿主。

该TBV的最终目标是用人为因素的干扰疟疾在人类和蚊子之间传播, 通过预防寄生虫在蚊子中肠繁殖。在宿主体内产生抗体, 能杀死宿主体内的配子母细胞, 或者摄取配子母细胞并杀死刚从人体获得的配子。这些疫苗通常被称为“群体免疫”或“利他主义”的疫苗。

虽然有一些寄生虫蛋白被确定为传播阻断抗原, 特别是恶性疟原虫Pfs48/45和Pfs230和间日疟原虫基因存在于宏观和微观配子配子[24]分子, 如Pfs48/45, 对疫苗研制提供了一些特殊的优势。在另一面, 这样的抗体自然刺激是不发生在人体, 并且该疫苗将产生持久和有效的抗体水平。传播阻断的疗效将取决于该配子母细胞携带者在局部区域的免疫率在局部区域。对于任何传播阻断疫苗接种成功, 与携带者高比率疫苗免疫同样重要的是, 这些免疫过的人成功的得到预防能力。

4 小结

新型动物疫苗研究现状篇8

关键词：动物疫苗,活载体疫苗,核酸疫苗

动物在人类的物质生活和心理中占有重要的地位, 然而在与动物不断接触中, 人类将要面对被动物疫病传染的风险。2016年世界动物卫生组织的法定动物传染病共有118种, 其中能感染多种物种的25种, 美国食品安全与公共卫生中心统计的人畜共患病共有69种。近年来研究表明一些新发传染病自然宿主就是野生动物, 因此动物疫病问题成为人们关注的焦点。通过实践证明种疫苗是预防动物疾病行之有效的方法, 分子生物学手段的完善使新型疫苗层出不穷。因此本文对新型动物疫苗的现状进行分析, 为畜牧业的发展提供参考。

1 基因工程亚单位疫苗

运用基因重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因导入并在原核或真核受体细胞高效表达, 提取保护性抗原蛋白, 加入合适佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗。国内外学者通过对细菌和病毒的保护性基因的深入研究和分子生物学方法的不断完善, 通过基因扩增、克隆和调控表达, 获得病原微生物的保护性蛋白, 从而制成具有较好保护性的疫苗。这一方法采用的表达系统主要是大肠杆菌、酵母和昆虫表达系统。如杆状病毒表达新城疫亚单位疫苗、狂犬病核蛋白、糖蛋白亚单位疫苗, 均有较好的效果。

基因工程亚单位疫苗相较于传统疫苗在较难培养、高度危险、致病性强的病原体的免疫预防中效果明显好于后者, 对于外来病的预防也可起到良好的效果。同时相较传统疫苗, 其可避免常规疫苗难以避免的变应原、热原、免疫抑制原及其他有害反应原导致的不良反应。另外, 亚单位疫苗不能在宿主体内复制, 对免疫动物没有致病性, 是安全性和稳定性较好的一种疫苗。但该类疫苗产品研发需较高的科研基础, 开发费用相对较高、价格贵, 而且免疫原性通常比传统疫苗差。

2 多肽/表位疫苗

运用化学合成技术或基因技术合成病原体的保护性多肽或表位, 并将其与大分子载体相连接辅以佐剂制成的疫苗, 也称合成肽疫苗。如以结核分支杆菌热体克蛋白70为载体整合表达口蹄疫病毒VP1等多表位融合肽疫苗, 不但表现出明显的细胞免疫和体液免疫, 而且诱导IFN-γ和IL-4的分泌。本疫苗可以使一些隐藏表位与免疫增强基因相串联共表达, 通过暴露和非特异性的增强机体的免疫功能, 达到预防性的目的。另外合成疫苗时可同时串联不同病原体的保护性基因制备多价苗, 达到一次多防的功能。

相较于传统疫苗, 多肽苗不含致病微生物的基因组, 不会出现与宿主基因重组或整合的危险, 相对较安全。但其缺点与基因工程亚单位疫苗相似, 费用较高、免疫效果有待提高。目前常见的有口蹄疫疫苗、禽流感疫苗等。

3 基因缺失疫苗

利用基因工程手段将病原微生物致病相关基因部分或全部去除或突变, 使其致病力下降或消失构建的活疫苗, 也称基因突变苗。传统的弱毒苗和经典致弱方法制备的疫苗, 虽毒力下降, 但往往免疫原性有明显的改变, 或是在应用过程中易出现返祖, 有潜在导致大流行的风险。而基因缺失疫苗在保护其免疫原性基因上, 因基因缺失, 突变机率小, 相对更安全。目前研究较多的是猪伪狂犬病毒基因缺失苗、布氏杆菌基因缺失苗、致病性大肠杆菌基因缺失苗等。基因缺失疫苗其感染过程与自然感染相似, 且其抗原成份较多, 机体生成多种抗体, 因此免疫原性相对较好, 是未来疫苗主要发展方向之一。

4 核酸疫苗

核酸疫苗是将病原微生物的保护性抗原基因克隆于质粒或病毒载体上, 将其注射到动物体内表达出天然形式保护蛋白, 从而引起机体产生免疫应答的新型疫苗。核酸疫苗本身没有抗原性, 可反复利用, 并且免疫动物后可在体内长期存在, 不断表达保护性蛋白, 刺激机体产生较持久、较强的免疫应答, 对动物产生持久保护作用。但目前本疫苗的主要缺点是安全性和体液免疫水平有待提高。目前研究较多的核酸疫苗主要有猪II型圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等, 并收到一定的效果。

5 活载体疫苗

利用分子生物学手段将致病微生物的保护性基因重组到非致病性病毒或细菌基因组中制成活疫苗。免疫动物后在宿主体内产生保护性蛋白, 刺激机体免疫系统产生保护。常作为载体的病毒有腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒、金丝雀痘病毒等, 其中金丝雀痘病毒是FDA最早批准的活病毒载体。细菌载体主要为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌等。活载体疫苗的免疫诱导过程与自然过程相似, 即可诱导细胞免疫, 也可诱导体液免疫, 因此免疫效果较好。但由于载体为活细菌或病毒, 在二次免疫时会对载体产生较强烈的免疫应答, 因此二次免疫尽量采用不同的载体。

6 植物疫苗

将致病微生物的保护性抗原基因重组到植物细胞内, 利用瞬时表达或稳定表达保护性蛋白的植物, 提纯或加工成具有免疫效果的疫苗免疫动物。自1992年Mason等提出利用转基因植物生产疫苗, 1998年Tacket首次报道了成功利用烟草中表达链球菌抗原蛋白A以来, 这一领域受到极大的重视。植物疫苗采用两种方式进行免疫-提纯注射或制成植物性饲料进行黏膜免疫。利用植物作为抗原表达和递送的载体已经成为当今生物技术研究的热点之一, 植物食用性疫苗因其便利性受到国内外学者的广泛关注。

相较于前几种新型疫苗, 植物疫苗培养条件宽松, 田间不需要专业人员和特异培养基, 后期无需严格的加工和纯化, 因而生产成本较低。如获得稳定遗传的植株, 即可大面积种植, 便于推广。植物的细胞壁还具有缓释的作用, 可使其长期存在于体内, 不断的释放和刺激, 产生相对的长期免疫效果。同时本疫苗还可避免细胞培养中动物制品污染和活载体疫苗中的风险, 是一种安全, 有效的疫苗。

7 其他新型疫苗

除上述新型疫苗外, 利用反向遗传学手段制备的嵌合疫苗、专业抗原提呈细胞树突细胞制备的树突细胞疫苗、T细胞苗等新型疫苗也在不断的研究和完善之中。

8 动物疫苗研究展望

猪瘟疫苗的研究进展篇9

1 常用的猪瘟疫苗

目前, 在我国由于制作工艺的不同, 利用猪瘟兔化弱毒株生产的常用猪瘟疫苗有猪瘟脾淋苗、猪瘟乳兔苗和猪瘟细胞苗。

猪瘟脾淋苗是兔化弱毒株接种成年兔无菌收获含毒量高的淋巴结、脾脏制备而成的疫苗。其特点是免疫原性强, 免疫效果最好;免疫后抗体产生快, 持续时间长;脾淋苗中含有某些免疫相关因子, 起到免疫增强作用;可用于紧急预防接种, 效果好于细胞苗;使用计量相对较小, 一般是1~2头份;但由于用活体动物生产, 生产量非常少, 所以成本高。

猪瘟乳兔苗是猪瘟兔化弱毒株接种乳兔, 无菌收获乳兔的肌肉及实质脏器制备的疫苗。其特点是免疫原性较强, 免疫效果较好;免疫后抗体产生较快, 持续时间较长。

猪瘟细胞苗是猪瘟兔化弱毒株接种犊牛睾丸细胞培养, 收获细胞培养物, 冷冻干燥制成的疫苗。其特点是免疫后抗体产生慢于组织苗;一般使用剂量相对较大, 头份2~4, 甚至更多;细胞生产量大, 价格便宜;可用于超前免疫。

2 新型的猪瘟疫苗

近年来由于猪瘟兔化弱毒疫苗免疫失败时有发生, 提示随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖, 疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移。数十年来猪瘟病毒在免疫接种的压力下出现抗原变异, 现有的传统疫苗已不能完全适应新形势的需要, 研究和开发新型猪瘟疫苗成为大势所趋, 而分子生物学的发展, 为新型猪瘟疫苗的开发和研究奠定了基础。

2.1 活载体疫苗

某些病毒基因组的某一核苷酸序列, 将其切除、突变或在该区域内插入外源性基因片段后, 不影响病毒复制。利用基因工程将该核苷酸序列克隆出来, 改造后将异源性抗原基因和启动子插入其中, 获得重组病毒。该重组病毒免疫动物, 可同时提供针对异源病毒与载体病毒的保护。目前, 用于表达外源病毒基因的载体包括PRV、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、乳多空病毒和口疮病毒等。

伪狂犬病毒基因组全长150 kb, 基因内包括多个非必需区, 适合作为载体病毒, 且由于伪狂犬本身也是猪的一种重要传染病, 所以利用活载体苗获得猪瘟、伪狂犬的双重保护很有意义。Van Zijl和Hooft构建了PRV/HCV的活载体疫苗毒株。Van将E2基因的不同片段插入到PRV的g G启动子构建了3个重组病毒, 其中2株可以抵抗强毒攻击。Hoof分别将E2基因置于PRVg D启动子, 人的CMV启动子及PRVg E启动子控制下构建了3株病毒, 攻毒试验证明只有E2置于人的CMV启动子下才能抵抗PRV和CSFV的强毒攻击。Peeter (1997) [10]等构建了表达CSFVE2蛋白的g D/g E双缺失的伪狂犬病毒重组疫苗, 免疫接种实验表明, 该疫苗能提供猪瘟、伪狂犬的双重保护。

2.2 核酸疫苗

核酸疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的重组表达质粒, 以配有原核复制组件和真核表达调控组件的质粒为载体, 将免疫原基因插入该质粒中, 用裸核酸接种动物即可产生免疫保护。

核酸疫苗是近年来兴起的一种新的疫苗, 在猪瘟疫苗研制领域也取得了一些可喜的成果。Markowska D I等[11]对猪瘟病毒核酸疫苗进行了测试, 经临床观察证明, 可以抵抗强毒攻击但是会出现40℃以上的高烧, 免疫后可以检测出轻微的T、B细胞反应。余兴龙等[12]分别构建了包含猪瘟病毒E2基因的重组表达质粒, 并且证明它们对猪有较好的保护作用。周鹏程等[13用构建的真核表达质粒pc E2肌肉接种小鼠可诱导产生CSFV中和抗体。

重组质粒可通过发酵培养方式大量制备, 又具有相对较好的稳定性, 并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因, 因此, 这项制苗技术具有很大的研究价值。核酸疫苗免疫的最大优点是可以在同一时间, 通过质粒携带的编码不同病毒抗原基因进行免疫, 若同时将编码细胞因子的基因插在质粒上, 不但可以提高免疫反应, 而且可以调整反应从Th1型向Th2型过渡[14]。这样通过使用合适的启动子、细胞因子和载体, 不但可以产生终身免疫, 还可以调控免疫反应的类型。因此, 核酸疫苗的研究对于新型非复制型疫苗预防猪瘟具有十分重要的意义。

2.3 标记疫苗

CSFV标记疫苗的最大优点在于能检测出疫苗接种猪群中的感染猪, 还能预防或减少免疫猪间病毒的传播, 防止临床病例的出现提供针对所有已知致病毒株的终身免疫保护, 防止带毒状态存在, 还有性状稳定、无直接副作用和不影响鉴别诊断等优点。Dewulf等[15]发现, 用E2亚单位标记疫苗对猪群进行2次免疫能提供临床保护, 但缺点是不能阻止CSFV间接接触感染, 而且免疫后抗体产生较慢。An等[16]发现在E2亚单位标记疫苗中融入细胞因子可以进一步提高疫苗免疫效果。Rouma (1999) [17]对用杆状病毒表达的E2基因亚单位疫苗的有效性和稳定性做了试验, 结果表明, 用32μg E2蛋白给猪接种1次, 3个月后以致死量强毒攻击, 95%的猪得到保护而不发病。

2.4 猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗

病毒编码毒力的基因可以删除当某些与病毒复制无关的毒力基因缺失突变后, 病毒毒力丧失或明显减弱但病毒复制能力并不丧失, 同时还保持着良好的免疫原性, 因此, 通过基因工程技术使病毒基因组中的毒力基因缺失, 可以获得基因缺失型弱毒疫苗株[18]。

Widjojoatmodjo M N等[19]建立了能够表达猪瘟病毒糖蛋Erns的细胞系SK26c26, 构建了两个Erns缺失突变株Flc23和Flc22, 经检测证明SK26c26所产生的Erns蛋白和其他猪瘟病毒Ern蛋白具有相同的生化特性, 分别用两个突变株免疫试验猪, 均可抵抗致死量猪瘟病毒Brescia株强毒的攻击, 而且Erns的缺失可用于感染猪和免疫猪的鉴别。Gennip H G等[20]构建了3个E2基因缺失的感染性DNA, 这3个缺失突变均不能产生活病毒, 表明E2的每一个抗原区对猪瘟病毒的生存都是必要的, 这些缺失突变株接种猪后, 均会产生不同程度的免疫作用, 并且用血清学试验可以区别于正常毒株, 说明基因缺失型弱毒疫苗可能是发展猪瘟标记疫苗的有效途径之一。

3 猪瘟疫苗的使用误区

猪瘟疫苗如果使用不当, 不仅不能有效的预防猪只猪瘟的发生还有可能造成严重的后果。许多养殖户在对猪瘟疫苗的认识和使用存在着一些问题。主要有一下几个方面:

3.1 重复注射

有些养户的猪已经由兽医注射了一次猪瘟疫苗, 而时过不久又自行注射1~2次猪瘟疫苗, 心想预防效果更好, 结果往往适得其反。因为猪瘟疫苗是一种致病能力较弱的病毒, 注射后引发抗体而产生免疫力, 具有一年以上的免疫期。如果在短期内又重新注射此种疫苗, 其抗体就会与疫苗中致病病毒相互作用, 中和抗体, 从而导致猪容易感染猪瘟, 所以每年只要给猪注射一次猪瘟疫苗就行了。

3.2 过早注射

有些农户对刚生下几天的仔猪注射猪瘟疫苗, 然而初生仔猪能从母乳中获得母源抗体可预防猪瘟, 这样就会干扰破坏母源抗体, 使仔猪容易发生猪瘟。据试验, 在仔猪断奶前40~45日龄, 当母源抗体开始消失时注射猪瘟疫苗的效果最好。

3.3 怀孕注射

有些农户在母猪怀孕或者临产时注射猪瘟疫苗, 这样会因为猪瘟是一种弱毒疫苗, 能通过怀孕母猪的胎盘引起仔猪死胎、流产或早产。如果要注射猪瘟疫苗也只能在怀孕前或产仔后进行。

3.4 注射失效疫苗

如猪瘟疫苗放在高温地方, 一段时间后疫苗变质失效才拿来注射。这样做不仅是徒劳无益的, 而且还容易引起猪群感染猪瘟。

3.5 注射不换针头

在给猪注射猪瘟疫苗时, 没有更换针头, 从而导致好猪、病猪相互感染, 造成死猪的恶果。因此在注射时一定要更换针头, 严格按照一只猪一个针头, 并做好注射器械的消毒, 这样才能有效的防止猪瘟的发生[21]。

4 猪瘟的接种方法

一直以来, 人们注射猪瘟疫苗都是采用颈部或臀部肌肉注射方法, 然而经研究发现采用后海穴接种法, 用3~5头份, 临床证实这种接种法远优于肌肉注射法, 可以增强猪体的提抗能力[22]。

后海穴接种法可以增强猪的免疫力, 因为后海穴具有丰富的神经分布, 该穴位注射疫苗后, 药液和针具刺激激励神经经络, 使机体的网状内皮系统产生更多的猪瘟抗体, 同时可刺激猪体的免疫系统产生大量的干扰素, 可抵抗病毒和病原微生物, 使猪的抗病能力提高。并且此种方法产生抗体生成快, 免疫力产生早, 有利于增强免疫力。

本种方法不仅使用于健康猪的免疫接种, 也适于已发生猪瘟的同群猪的紧急接种, 而且还可用于猪瘟病猪的接种治疗, 但对病猪应加大用量。可用10~15头份, 隔3 d加免1次。此种方法很安全, 虽然疫苗超量注射, 但不会引起毒副作用和不良反应[23]。

5 结语