cDNA克隆（精选十篇）
cDNA克隆 篇1
作为细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的受体，CD14在动物机体免疫过程的复杂反应中起着非常重要的作用，可介导细胞识别LPS，并引起细胞内酪氨酸磷酸化，从而触发细胞因子的释放和氧自由基的产生[6]。
水牛是我国南方的一种重要家畜，主要为役用，亦可为乳用。病原性革兰氏阴性菌的普遍存在，对水牛的生产利用造成了极大的危害，给养殖业带来了重大的经济损失。CD14作为革兰氏阴性菌LPS的重要受体，在介导整个病理反应过程中起着极其重要的作用。本研究以水牛为材料，克隆、表达了b CD14，为进一步开展革兰氏阴性菌对于水牛的感染机制研究奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
血液采自海南省定安县的兴隆水牛。
1.1.2 试剂
PET-28a原核表达载体，宿主菌株E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)由作者实验室保存。血液总RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Ta Ka Ra RNAiso Reagent、Ta Ka Ra LA Taq酶、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，限制性内切酶、Revert AidTMH Minus First Strand c DNA Synthesis Kit购自Fermentas公司，镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)购自Qiagen公司。小鼠抗His×6单克隆抗体购自德国Merck公司，辣根过氧化氢酶标记的山羊抗小鼠Ig G购自Invitrogen公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
台式高速冷冻离心机购自美国Thermo公司;PCR仪购自德国Eppendorf公司;LVF6恒温水浴锅购自宁波莱福科技有限公司，超净工作台购自苏州净化;Milli Q型纯水仪购自美国Millipore公司;电热恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，DYY-7C型电泳仪购自北京六一仪器厂;Chemi Doc XRS凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司;Mini-PROTEAN3蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 水牛外周血白细胞总RNA的提取
参照申明霞(2008)方法提取总RNA[7]。
1.2.2 RT-PCR
取5μl总RNA(含量约1μg)作为模板，利用Revert AidTM H Minus First Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA第一链。用琼脂糖凝胶电泳检测c DNA质量后，取2μL c DNA为模板，用上海生工生物工程技术有限公司设计合成的引物P1和P2进行PCR反应，引物序列如下:
下划线处分别表示添加的Eco RⅠ和HindⅢ限制性酶切位点。
反应程序如下:
采用降落PCR的方法，首先，94℃预变性3min;然后，94℃1min,66℃1min,72℃1min，以后每个循环退火温度降低2℃，当其降至48℃时，以94℃1min,48℃1min,72℃1min进行20个循环;最后，72℃延伸5min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收目的条带。
1.2.3 b CD14原核表达载体的构建
在T4DNA聚合酶的作用下，将回收的经Eco RⅠ和HindⅢ双酶切的PCR产物及经同样酶处理的p ET-28a载体，在16℃条件下，过夜连接，连接产物转化E.coli DH5α，涂板，挑选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后测序。
1.2.4 b CD14序列及氨基酸推导
测序样品送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果利用DNAMAN软件进行氨基酸序列推导。
1.2.5 b CD14的原核表达
1.2.5. 1 b CD14的诱导表达
将重组质粒p ET28a-b CD14转化入E.coli BL21，挑取单菌落，接种到3mL含适量卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。次日，将过夜培养物按1:100的体积比加入含卡那霉素的LB液体培养基中继续培养，当OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度1mmol/L的IPTG,37℃诱导4h后，取1mL菌液，测其OD值，离心去上清，用1×SDS上样缓冲液，煮沸溶解菌体沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白。
1.2.5. 2 p ET28a-b CD14表达蛋白的可溶性分析
参照1.2.5.1方法收集表达菌体。用TE(p H 8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1 g/L，再加入1/10体积的1%的Trixton-100，混匀，37℃水浴15～30min。超声破碎后，分别收集上清和沉淀。上清与等体积2×SDS上样缓冲液混合，沉淀用2倍上清体积的1×SDS上样缓冲液悬浮，并将混合液在沸水中加热5 min,12 000g离心1 min。取上清，SDS-PAGE电泳检测。考马氏亮蓝染色、薄层扫描，并根据目的蛋白表达带在菌体蛋白百分比确定其是否以可溶性形式表达。
1.2.5. 3 p ET28a-b CD14表达蛋白的Western blot分析
SDS-PAGE结束后，将蛋白电转移至PVDF膜。TBS中平衡10min，用含5%脱脂牛奶的TBS封闭过夜。一抗为抗His×6单克隆抗体(1∶2 500)，二抗为辣根过氧化氢酶标记的羊抗小鼠Ig G(1∶5 000)。先用一抗37℃孵育1h,TTBS洗涤后，二抗37℃孵育1h,TTBS洗涤，洗脱未结合二抗后，DAB显色。
2 结果与分析
2.1 p ET28a-b CD14的克隆
以水牛外周血白细胞总RNA为模板，通过RT-PCR，利用P1、P2引物扩增出一1 122bp的片段，将该片段用Eco RⅠ/HindⅢ双酶切处理后克隆入同样酶切处理的p ET28a载体，转化E.coli DH5α(DE3)，经测序确定为b CD14 CDS区后，提取质粒，Eco RⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，得到约4 000bp与1 122bp的条带(图1)。说明b CD14已成功连入p ET28a载体中，将该重组质粒命名为p ET28a-b CD14。
2.2 b CD14序列的分析
根据测序结果，应用DNAMAN软件分析其核酸、蛋白质序列(图2)。并与印度水牛(NM_174008)、挪威大鼠(NM_021744)和人(NM_000591)CD14的c DNA序列对比，同源性分别为97.95%、68.78%、78.60%，氨基酸同源性分别为96.78%、61.27%、72.34%。
M1:D2000 DNA marker;M2:λDNA/HindⅢDNA marker;1:Eco RⅠ单酶切结果;2:HindⅢ单双酶切结果;3:pET28a-b CD14经Eco RⅠ和HindⅢ双酶切结果;4:p ET28a-bCD14重组质粒。
M1:D2000 DNA marker;M2:λDNA/HindⅢDNA marker;1:pET28abCD14 digested with Eco RⅠ;2:p ET28a-b CD14 digested with HindⅢ;3:pET28a-bCD14 digested with Eco RⅠ+HindⅢ;4:pET28a-bCD14plasmid.
2.3 p ET28a-b CD14的原核表达
p ET28a-b CD14经测序鉴定正确后，转化入E.coli BL21中，在LB培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导4 h后，离心收集蛋白。通过SDS-PAGE检测发现，融合表达使目的蛋白多了包括His·Tag在内的51个氨基酸，从而使目的蛋白的分子量相应地增加了5kD左右，由于CD14在原核表达过程中未完成糖基化修饰，而使蛋白分子量小于文献中报道的55kD，经过诱导表达，得到一个约46kD的融合蛋白，与预计的结果一致。经IPTG诱导的转p ET28a空载体的E.coli BL21(DE3)、未诱导的E.coli BL21(DE3)没有相应的特异性条带(图3)。
超声波破碎重组菌菌体，取上清和沉淀SDS-PAGE电泳检测，发现目的蛋白主要存在于包涵体中(图4)。将获得的包涵体用8mol/L尿素溶解，溶解上清用SDS-PAGE电泳检测，在大小相对应的位置出现了一条纯度较高的目的蛋白条带。用此溶解的包涵体蛋白做Western Blot检测。
将SDS-PAGE中分离的条带转印到PVDF膜上，进行Western blot分析。在相对分子质量约为46 k D处有一条特异性抗体结合带(图5)。
3 讨论
CD14是革兰氏阴性菌LPS的受体，其作用机制是在LBP(LPS binding protein,LBP)存在或不存在条件下，结合LPS或LPS-LBP复合体，然后通过多种信号传导途径，如与TLR4和MD2蛋白结合将LPS信号传递到细胞内，从而激活下游通路NF-κB，导致细胞因子的合成与释放[8,9,10,11]。
CD14在多种疾病的发生、发展过程中起着重要作用。研究表明，CD14在人牙髓组织炎中表达，通过抗CD14抗体可有效阻断LPS与CD14结合，进而阻止LPS信号向靶细胞内传导，最终减轻LPS诱发的牙髓组织的炎症反应和病理损害，并促进其自身的修复[10]。在人坏死性小肠结肠炎中，NF-κB p65、CD14、TLR-4和MD-2等蛋白表达量均上调，使用CD14抗体能有效阻断下游炎症因子的释放，从而减轻炎症反应[12]。在革兰氏阴性菌引起的感染性休克中，CD14高水平表达，同时伴有败血症和急性期C2反应蛋白上升[13]。研究发现，CD14抑制肽(CD14 inhibitory peptide,CD14-IP)能够下调和抑制CD14的生物活性，对LPS诱导U937细胞产生TNF-α等炎症因子具有明显的下调作用，预示CD14活性抑制剂对于LPS引起的病理反应具有潜在的治疗作用[14]。正常情况下，肝巨噬细胞，如肝细胞、kupffer细胞等表面均少量表达CD14，肝损伤时，表达则上调，被激活的内皮细胞(Ecs)、平滑肌细胞、星形胶质细胞等自身不表达CD14的细胞，也会有少量表达，提示LPS在调节CD14表达中扮演重要角色[15,16,17,18]。杨慷等在小鼠胆总管内注入LPS复制急性胆道感染动物模型中发现，肝组织中CD14的表达显著增加，血浆TNF-α和IL-6含量明显增高[19]。Fuyumi Isayama等研究发现，实施胆道结扎术后，与野生鼠相比，CD14-/-及LBP-/-鼠肝损伤及肝纤维化程度减轻，证明在LPS引起的肝纤维化过程中需要CD14的参与[20]。勿庸置疑，针对CD14的功能的深入阐释，将对诸多LPS相关疾病的研究具有重要的理论价值和实际意义。
M:protein marker;1:E.coli BL21(DE3)阴性对照;2:37℃,转p ET28a空载体,1 mmol/L IPTG诱导4h的的E.coli BL21(DE3);3:转p ET28a-bCD14的E.coli BL21(DE3)经1 mmol/L IPTG,37℃诱导4h。
M:protein marker;1:negative control of E.coli BL21(DE3);2:E.coli BL21(DE3)transformed with p ET-28a induced at 37℃,4h by IPTG;3:E.coli BL21(DE3)transformed with pET28a-bCD14 induced at 37℃for4h by 1 mmol/L IPTG.
M:protein marker;1:转pET28a-b CD14的E.coli BL21(DE3)经1mmol/L IPTG、37℃诱导4h;2:上清;3:沉淀。
M:protein marker;1:E.coli BL21(DE3)transformed with p ET28abCD14 induced at 37℃,4h by IPTG(1mmol/L);2:The protein expressed in supernatant;3:The protein expressed in precipitatant.
M:protein marker;1:目的蛋白的Western blot分析;2:空载体的阴性对照。
M:protein marker;1:Target protein;2:Negative control.
目前，借助于不同细胞和动物模型，针对LPS受体CD14及其引起的信号转导通路相关基因的研究比较广泛，也取得了显著结果，但多局限于人和小鼠，水牛CD14基因及蛋白的相关研究还比较少;水牛布氏杆菌病等革兰氏阴性菌比较普遍，而对该病的预防主要依赖于疫苗的使用。因此，研究水牛CD14在革兰氏阴性菌引起的感染机制中发挥的作用，就显得尤其重要。本研究从水牛外周血白细胞中克隆获得1 122bp的CD14 CDS区后，选用大肠杆菌原核表达系统对该基因进行蛋白表达时，主要是考虑到该方法具有成本、操作简单、周期短、表达量高等优点。经IPTG诱导及Western blot鉴定后，在约46 k D处出现了一条特异性抗体结合蛋白带，从而证明应用原核表达系统成功地表达了b CD14。这些结果对于进一步揭示CD14的功能提供了重要的理论依据。
摘要：目的:克隆水牛白细胞分化抗原14(buffalo cluster of differentiation antigen14,bCD14)基因,表达bCD14蛋白,并进行Western Blot鉴定。方法:采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bCD14基因,构建重组质粒pET28a-bCD14,转化入Ecoli BL21,IPTG诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析及Western blot鉴定。结果:bCD14基因含有一个1 122bp的开放阅读框,编码373个氨基酸;与印度水牛、挪威大鼠和人CD14的cDNA序列同源性分别为97.95%、68.78%、78.60%,氨基酸同源性分别为96.78%、61.27%、72.34%;主要以包涵体形式表达,表达蛋白经Western Blot鉴定,得到了一条约46 kD的特异性条带。结论:该文成功克隆了bCD14基因,表达了bCD14蛋白,为进一步揭示水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的免疫机制奠定了基础。
cDNA克隆 篇2
人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析
根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的`hLYZ cDNA序列的同源性为99%.推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础.
作 者：何晓宁 彭树英 杨瑞锋 刘凤军 郑月茂 张涌 作者单位：西北农林科技大学生物工程研究所,陕西,杨陵,712100刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：200634(11)分类号：Q78关键词：人溶菌酶 cDNA 克隆 序列分析
cDNA克隆 篇3
关键词：有限稀释法；噬菌体；cDNA文库；CR
中图分类号： Q785文献标志码： A
文章编号：002-302（204）2-0026-03
基因克隆是基因工程和分子生物学研究的基础，随着2世纪生物技术的快速发展，基因克隆技术越来越多被广泛应用[-2]。976年，Hofstetter等通过杂交质粒的方法第一个成功构建cDNA文库[3]以来，cDNA文库构建和筛选日益成熟并普及，并成为基因克隆及功能基因组研究的基本技术[4-5]，是最普遍、最经典的克隆全长基因序列的基本方法之一。传统的筛库方法以标记核酸探针技术为基础，其优点在于准确性和灵敏度高，缺点是放射性标记探针容易造成污染且同位素半衰期短不稳定，非放射性标记探针以生物素和地高辛为基础，成本高且所需工作量大。以CR为基础筛选 cDNA 文库的方法具有快捷、灵敏等特点，备受广大科研工作者青睐，如杨晓明等以CR介导的cDNA文库矩阵排列法进行混合基因组文库筛选、瞿文全等建立SSS（subsection screening）篩选cDNA文库的方法、王志成等基于96孔板CR法筛选 cDNA 文库[6-8]，等等。本研究尝试构建一种以CR为基础，结合有限稀释法筛选cDNA文库的方法，在能够快速有效分离出目的基因的基础上，减少筛选cDNA文库的工作量。
材料与方法
材料
λ噬菌体cDNA文库筛选使用由新疆石河子大学生命科学学院构建并保存的中国美利奴羊混合组织cDNA文库，宿主菌株为XL-Blue MRF，hagemid Excision所用菌株为XLOLR，均含四环素抗性。cDNA 文库构建及宿主菌株来自ZA Express cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自Stratagene公司。
2试剂
LB液体和固体培养基、LB broth with supplement、NZY Agar，NZY Top Agar、5×NZY Broth、SM溶液、卡那霉素、四环素，均购自索莱宝公司；ITG和X-Gal，购自科百奥公司；琼脂粉、琼脂糖、低熔点琼脂糖、MgSO4，均购自Amresco公司；其余分子生物学试剂均为国产。
3引物
利用GenBank中公布的绵羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]预测基因EST序列，用SeqMan软件对EST序列拼接去载体，获得目的序列。将确定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比较基因组学方法，比对寻找3′和 5′-UTR区域内的高度保守序列，使用remier rimer 50软件和NCBI上rimer-Blast工具设计特异性引物，并提交北京华大基因生物工程技术服务有限公司合成。
4CR反应条件
采用天根2×Taq CR Master Mix试剂盒，CR反应体系为：0×CR buffer，25 μL；25 mmol/L MgCl2，20 μL；0 mmol/L dNTMix，05 μL；0 μmol/L 正、反向引物，各 μL；模板，2 μL；Taq酶， U；ddH2O，补至 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃延伸8 min。CR反应结束，用%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察并照相保存。
5λ噬菌体cDNA文库筛选
λ噬菌体cDNA文库筛选流程见图。
5宿主菌的制备用接种环蘸取XL-Blue MRF′菌液在含有四环素终浓度为2 μg/mL的LB平板上划线，37 ℃过夜培养；用接种针在平板上挑取个单菌落，于20 mL LB broth with supplement中30 ℃、220 r/min振荡过夜培养；培养菌液 000 g离心5 min，弃上清，加入0 mmol/L MgSO4溶液将菌株细胞重悬稀释调至D600 nm值为06～0，4 ℃保存备用。XLOLR菌制备过程与XL-Blue MRF′相同。
52λ噬菌体cDNA目的基因确定取λ噬菌体cDNA扩增文库菌液2 μL进行CR检测。
53λ噬菌体cDNA扩增文库的第轮有限稀释筛选根据CR检测结果能够获得特异性条带，将此扩增文库菌液E管编号0；另取0只5 mL E管并编号～0号管，加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次从各管中取00 μL培养菌液，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；取有限稀释的各管菌液4 μL进行CR检测，如～0号管CR检测中～9号管有特异性条带，而0号管无，则选取9号管为最大稀释倍数的阳性管。[FL）]
[FK（W7][TZLtif][FK）]
[FL（2K2]
54最大稀释倍数阳性管的培养吸取最大稀释倍数的阳性管噬菌体cDNA扩增文库溶液4 μL与400 μL XL-Blue MRF′宿主菌混合均匀，37 ℃温育20 min；加入600 μL LB broth with supplement培养基混匀，37 ℃振荡培养0 h；取培养菌液2 μL进行CR检测。
55文库第2轮有限稀释筛选经CR检测有特异性条带，则将对应E管编号为a；另取0支5 mL E管各加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次标号a～j，从培养过的最大稀释倍数阳性管取00 μL菌液加入到a号管，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；将a～j稀释完成的菌液 37 ℃ 振荡培养0 h，取各管培养液2 μL进行CR检测，确定最大稀释倍数的阳性管；将最大稀释倍数的阳性管37 ℃继续振荡培养2 h，平均分装成2管，第管进一步进行有限稀释，验证阳性克隆的稳定性，验证完成，第2管用于噬菌体单板的挑取。
6阳性噬菌体斑的挑取
经过2轮有限稀释筛选，取最大稀释倍数的阳性管菌液2 μL与200 μL振荡过夜培养的XL-Blue MRF′菌液（D600 nm≈6）混合，并吸打均匀，于37 ℃温育20 min；将混合菌液加入到8 mL，温育在48 ℃的NZY Top Agar中，混合混匀后将NZY Top Agar混合液均匀地倒入预热的NZY Agar平板上超过20 min，至平板凝固；将凝固后的平板倒置于37 ℃温箱中培养7～8 h，直至长出清晰的噬菌斑；逐个从平板上挑取噬菌体单斑于500 μL LB broth with supplement培养基，室温条件下温育～2 h，噬菌体溶液进行CR检测，鉴定为阳性后进行hagemid Excision。
7hagemid Excision
在0 mL离心管中，加入50 μL混匀的噬菌体溶液，37 ℃ 温育5 min；在离心管中加入2 mL LB broth with supplement培养基，37 ℃、260 r/min振荡培养25～3 h；菌液 65～70 ℃ 热激20 min，以 000 g离心5 min，收集上清于无菌离心管中；取00 μL上清与200 μL XLOLR细胞吸打混匀，37 ℃ 温育5 min；加入40 μL 5×NZY Broth，37 ℃恒温培养箱培养45 min；加入5 μL 20% ITG和40 μL 25 mg/mL X-Gal充分混勻，取00 μL涂板在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基上，倒置37 ℃培养过夜；用灭菌牙签挑取平板上白色单菌落进行CR鉴定，阳性单克隆经液体培养，送交北京华大基因生物工程技术服务有限公司测序。
2结果与分析
2引物的设计
设计引物为[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]-F：5′-AACCAAAGCTGTTGACAGATGAGAAC-3′；R：5′-GCGCTGCAGTCGACACTAGTGGATC-3′。
22λ噬菌体cDNA扩增文库目的基因的确定
取2 μL绵羊cDNA扩增文库38×08 FU/mL，利用[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]引物进行CR检测，经%琼脂糖凝胶电泳与CR marker对比，绵羊cDNA扩增文库在 800 bp 具有特异性条带（图2），表明文库中含有目的基因。
[FK（W][TZL22tif][FK）]
23有限稀释CR法目的基因筛选
由图3可见，在第轮有限稀释筛选中，～0号管均有特异性条带，且条带亮度逐渐降低，说明～0号管中总的克隆种类呈指数降低，目的基因克隆数在减少；9～0号管特异性条带微弱，说明9～0管中含有目的基因克隆且克隆数很少，9～0号管为最大稀释倍数阳性克隆管。
对9～0号管进行富集培养，取培养菌液2 μL进行CR验[CM（25]证，结果由图4可见，9～0号均有明显的特异性条带，能[CM）]
[FK（W8][TZL33tif][FK）]
[FK（W0][TZL44tif][FK）]
够进行第2轮筛选。
取0号培养管菌液00 μL进行第2轮有限稀释，取菌液经CR检测，结果由图5可见，a～j均出现特异性条带，各稀释管中均包含目的基因克隆；a～f条带亮度均一，g～j条带亮度逐渐增加，表明阳性克隆数在增加。这是有限稀释法的优点，经过第轮和第2轮筛选，非阳性克隆在减少，阳性克隆数经过富集扩大培养后大量增加，能够有效地筛选含目的基因的阳性克隆。
[FK（W9][TZL55tif][FK）]
为进一步确定j号管能够进行hagemid Excision，对j号管进行有限稀释验证。由图6可见，在有限稀释的j号管 ～6 份检测样本中均有特异性条带，表明第2轮有限稀释能够进行hagemid Excision。
[FK（W9][TZL66tif][FK）]
24hagemid Excision
经过2轮有限稀释筛选，经hagemid Excision，随机挑取6个单克隆进行CR鉴定，结果由图7可见，4个单克隆有明显的特异性条带，鉴定为含有目的基因的单克隆，将单克隆菌液送交测序。
[FK（W0][TZL77tif][FK）]
25测序结果
将测序得到的TORAI基因序列，运用DNAstar中Seqman进行拼接，在NCBI上载体搜索工具VecScreen去载体，对序列进行核苷酸序列比对，并将序列提交GenBank，GenBank登录号为KF779494。
3结论与讨论
筛选cDNA文库是获取全长目的基因的基本方法之一。从cDNA文库中获得目的全长基因，建立该基因的结构、功能、表达调控等研究体系，是在基因组水平上研究特定生物器官、组织、发育时期基因表达的前提和基础。目前，基于CR法从混合文库中筛选阳性单克隆的方法[9，]越来越受到关注。本试验构建了一种快速筛选噬菌体cDNA文库的方法——有限稀释CR法，与常规CR筛选cDNA文库方法相比，具有操作简便、检测灵敏、筛选快速、经济有效等优点。该方法以特定基因组DNA为探针筛选噬菌体cDNA文库中该基因的全长序列，摆脱了传统噬菌体文库铺板培养、分板洗脱等较为繁琐的操作步骤，只经过2轮CR就可筛选到目的基因，并将目的基因富集到较高水平，整个过程只需4 d时间。利用此项技术，能够快速有效地筛选噬菌体cDNA文库中全长序列基因，在筛选过程中不需要探针标记，降低了成本，提高了安全性，同时也降低了假阳性对试验的干扰。
有限稀释CR法快速筛选噬菌体cDNA文库技术不仅原理简单，具有普遍适用性，而且具有一定的可行性和科学性，可以根据研究需要进行改进。如需要筛选大量已知基因，可在对库液的有限稀释时进行多对引物不同基因的统一筛选，这样使得筛选cDNA文库更加高效；如对于某些在文库中丰度比较低的基因，可以先有限稀释cDNA文库，找到最高的有限稀释倍数再进行培养，提高阳性克隆在稀释菌液中的分布，再按本试验步骤进行2轮有限稀释，可得到目的基因的单克隆。因此，在筛选文库之前，应确定文库中是否含有所要的阳性克隆，对文库进行滴定，再进行有限稀释确定基因的丰度；还可对λ噬菌体cDNA扩增文库进行MASS Excision protocol，将hagemid Excision菌液保存，并利用有限稀释CR法对大量基因进行筛选，达到高效筛选cDNA文库的目的。
目前，λ噬菌体cDNA载体系统构建的cDNA文库包括噬菌体文库和细菌质粒文库，具有装载容量大、灵敏度高、代表性好、质量高、适合长期保存等优点，对于细菌质粒文库，使用有限稀释CR法能够更高效快捷地筛选全长目的基因。
[FL）]
[KH4D]
[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]
[ZK（#]Searles L L，okerst R S，Binghham M，et al Molecular cloning of sequences from a drosophila RNA polymerase Ⅱ locus by Element transpose tagging Cell，982，3（3 t 2）：585-592
[2]Diatchenko L，Lau Y F，Campbell A ，et al Suppression subtractive hybridization：a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries roceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，996，93（2）：6025-6030
[3]Hofstetter H，Schambck A，van Den Berg ，et al Specific excision of the inserted DNA segment from hybrid plasmids constructed by the poly（dA） poly （dT） method Biochimica et Biophysica Acta，976，454（3）：587-59
[4]Ren B Z Biochemistry and clinical medicine[M] Changsha：Hunan Science and Technical ress，993
[5]瞿礼嘉 现代生物技术[M] 北京：高等教育出版社，2004
[6]Yang X M，Xie L，Hu Z Y，et al A method of screening an arrayed cDNA library by CR Chinese Biochemical ournal，997，3（5）：505-508
[7]杨晓明，谢玲，胡志远，等 CR介导的cDNA文库矩阵排列筛选方法 生物化学杂志，997，3（5）：4-7
[8]瞿文全，金治平，赵德修，等 快速简便筛选cDNA文库的SSS法 遗传，2003，25（5）：583-586
[9]王志成，蒋建雄，钟军，等 CR快速筛选棉纤维cDNA文库分离全长cDNA序列 湖南农业大学学报：自然科学版，2005，3（3）：272-275[ZK）]
[0][ZK（#]Israel D I A CR-based method for high stringency screening of DNA libraries Nucleic Acids Research，993，2（）：2627-263
Alfandari D，Darribère T A simple CR method for screening cDNA libraries CR Methods and Applications，994，4（）：46-49[ZK）][H][FL）]
[FQ）]
[HT5”SS〗江蘇农业科学204年第42卷第2期
[SQ5]
cDNA克隆 篇4
到目前为止, 钙调蛋白是真核细胞所有Ca2+结合蛋白中研究得最为透彻的一种。研究者们在牛 (Bos taurus) 、小鼠 (Mus musculus) 、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 等模式生物中, 对Ca M参与调控神经发育、心肌收缩、植物免疫等的研究工作已经进行得相当深入[9,10,11]。在海洋无脊椎动物中关于Ca M参与调控机制的研究还不多, 但也有一些进展。GAO等[12]研究发现在克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 蜕皮期间Ca M和Ca2+-ATPase存在某种调控关联。在合浦珠母贝 (Pinctada fucata) 等贝类动物中, Ca M被认为在贝类钙代谢中扮演重要角色, 参与贝壳的形成[13]。LUAN等[14]的研究表明, Ca M可能参与文昌鱼 (Branchiostoma belcheri tsingtauense) 消化道的分化。CHEN等[15]的研究表明Ca M可能参与纹藤壶 (Balanus amphitrite) 幼体的附着。然而, 海参中有关Ca M的研究尚未见报道。
棘皮动物与脊索动物同属后口动物, 是无脊椎动物中与高等脊椎动物进化上亲缘关系最近的类群, 在进化上拥有独特的地位。同时, 海参具有的吐脏、内脏再生和自溶等这些独特的生物现象, 长期以来倍受研究人员关注。花刺参 (Stichopus monotuberculatus) 俗称“黄肉参”, 隶属于棘皮动物门, 海参纲, 楯手目, 刺参科, 在中国台湾、广东、广西以及海南省的海域均有分布[16]。花刺参是中国热带海参中具有代表性的高经济价值种类, 不仅是名贵的食用种类, 也是重要的食品和医药原料, 特别用作香脂、擦剂油、奶油、牙膏和化妆品等的原料[17]。该研究在花刺参中克隆了Ca M的c DNA全长序列, 并分析其在花刺参不同组织中的表达特点, 以期为后续进一步研究Ca M在海参生命活动中所起的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
研究所用花刺参采自广西涠洲岛, 在实验室水族箱中暂养一周。水族箱为过滤循环水系统, 24 h充气, 光周期12 h∶12 h。从水族箱中取出花刺参冰上解剖, 体腔液经2 000 g离心15 min, 弃上清得到体腔细胞沉淀, 加入Trizol后放入-80℃保存;体壁、呼吸树和肠组织等经液氮迅速研磨成粉末, 加入Trizol后放入-80℃保存。
1.3 总RNA提取及c DNA第一链合成
Trizol (invitrogen) 法提取海参体壁、呼吸树、肠以及体腔细胞的总RNA, 按照Ta KaRa c DNA第一链合成试剂盒的说明进行反转录, -20℃保存。其中肠样品同时用于Ca M基因c DNA全长序列克隆。
1.4 花刺参钙调蛋白 (Stm Ca M) 基因的克隆
基于已获得的花刺参EST序列设计引物G-F/G-R, 用以扩增Ca M基因中间片段。扩增程序为94℃5 min, 预变性;94℃15 s, 52℃15 s, 72℃1 min, 共35个循环;72℃10 min延伸。PCR产物经回收、连接、转化后挑选阳性克隆送测序。
根据获得的Ca M中间片段序列, 用Primer 5软件设计3'-RACE引物 (F3-1和F3-2) 和5'-RACE引物 (R5-1和R5-2) 。根据3'/5'-Full RACE Kit (Takara) 说明书的指导, 结合巢式PCR技术扩增Ca M基因3'末端和5'末端序列。PCR产物用上面所述的方法进行回收、连接、转化克隆并测序。此研究所用的引物序列见表1。
1.5 序列分析
将测序得到的5'末端序列、中间片段序列和3'末端序列拼接起来, 获得花刺参Ca M基因的c DNA全长序列。利用NCBI比对所获得的c DNA全长序列, 并做同源性分析。应用Bio Edit软件寻找ORF并翻译成蛋白质。使用SMART在线软件分析蛋白质结构和功能。使用SWISS-MODEL分析蛋白质的三维结构。用Clustal X及Gene Doc软件做蛋白质序列比对分析。利用Mega 5.0软件根据不同物种的Ca M ORF序列以最小进化法构建系统进化树。
下划线为聚腺苷酸加尾信号;*代表终止密码子;加框的序列为4个EF手结构;Gen Bank序列号KJ624993The polyadenylation signal in 3'-UTR was underlined;the stop codon was marked by an asterisk, and four EF-Hand domains were included in rectangles.Gen Bank accession No.is KJ624993.
1.6 实时荧光定量PCR (real-time PCR) 的表达分析
设计荧光定量PCR特异引物q F1和qR1及内参引物Actin F和Actin R。qRT-RCR反应体系包括SYBR Rremix Ex TaqⅡ (12.5μL) 、q F1 (1.0μL) 、qR1 (1.0μL) 、c DNA模板 (2μL) 和灭菌蒸馏水 (8.5μL) 。采用2步法扩增标准程序:1) 预变性95℃30 s;2) 95℃5 s, 60℃30 s, 40个循环。反应在RG-3000荧光实时定量PCR仪 (Applied Biosystems) 进行, 每种组织c DNA样品及内参分别做3个重复。用RG-3000自带分析软件进行溶解曲线分析以确定单一扩增, 用2-ΔCT法分析花刺参Ca M基因的组织表达水平[18], ΔCT为目的基因CT值与内参基因CT值的差值, 然后用公式2-ΔCT计算相对表达量。
2 结果
2.1 花刺参Ca M c DNA克隆与结构分析
克隆得到的Stm Ca M c DNA全长1 394 bp (Gen Bank登录号KJ624993) , 其中包括138 bp的5'UTR, 806 bp的3'-UTR和450 bp的ORF。3'-UTR端聚腺苷酸加尾信号 (AAATAG) 位于poly A尾上游第21个碱基位点处 (图1) 。由ORF推导出的Stm Ca M含148个氨基酸, 预测分子量约16.7 k D, 理论等电点为4.1。与其他物种Ca M一样花刺参Ca M含4个EF手Ca2+结合域 (图1) 。利用SWISS-MODEL在线软件分析花刺参Ca M的三维结构 (图2) , 可见Ca M含4个螺旋-环-螺旋 (helix-loop-helix) 结构, 即代表4个EF手。每个EF手包括2个螺旋和连接2个螺旋的环状结构。使用Meg Align软件分析花刺参Ca M4个EF手结构域之间的相似度, EF1与EF3相似度为51.7%, EF2与EF4相似度为48.3%;这2个组合间相似度比其他任何两两组合之间, EF1和EF2 (31%) 、EF1和EF4 (37.9%) , EF2和EF3 (31%) 都要高。
2.2 花刺参Ca M进化与保守性分析
Meg Align软件对不同物种来源钙调蛋白进行相似度分析的结果, 表中显示花刺参Ca M与其他物种Ca M相似度从95.9%到98% (表2) 。其中作为脊椎动物代表的小鼠的钙调蛋白与花刺参钙调蛋白之间的相似度最低为95.9%。另外, 花刺参Ca M与真海鞘 (Halocynthia roretzi) 、白氏文昌鱼 (Branchiostoma lanceolatum) 、中间球海胆 (Strongylocentrotus intermedius) 的相似度最高 (均为98%) ;与秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 、绣球海葵 (Metridium senile) 、居蟹皮海绵 (Suberites domuncula) 的相似度分别为96.6%、97.3%和96.6%。图3比对了不同物种来源钙调蛋白之间发生氨基酸替换的全部氨基酸位点, 从低等无脊椎海绵到高等脊椎动物小鼠一共有9个位点发生氨基酸替换。表3具体列举了发生氨基酸替换的位点。花刺参Ca M与中间球海胆Ca M相比有3个氨基酸位点发生变换, 同合浦珠母贝相比也仅有4个氨基酸位点发生变换。
利用Mega 4软件, 采用最小进化法构建Ca M系统发育树。结果显示, 花刺参Ca M与囊舌虫 (Saccoglossus kowalevskii) 、绣球海葵、加利福尼亚海兔 (Aplysia californica) 三者的Ca M亲缘关系较近, 聚为一簇。另外, 不同脊椎动物的Ca M聚为一簇, 居蟹皮海绵、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 和秀丽隐杆线虫聚为一簇;这2簇则与Stm Ca M亲缘关系较远 (图4) 。
注:A.丙氨酸;D.天冬氨酸;F.苯丙氨酸;I.异亮氨酸;K.赖氨酸;M.蛋氨酸t;Q.谷氨酰胺;R.精氨酸;S.丝氨酸;T.苏氨酸Note:A.Ala;D.Asp;F.Phe;I.Ile;K.Lys;M.Met;Q.Gln;R.Arg;S.Ser;T.Thr
2.3 花刺参Ca M基因在各组织中表达的差异
采用荧光定量PCR检测Ca M基因在花刺参不同组织中的表达情况。结果显示体壁中Ca M相对表达量最低, 2-ΔCT值为0.9。呼吸树中最高, 2-ΔCT为113.8, 其次是体腔细胞和肠 (图5) 。
3 讨论
前人已经克隆并描述了真海鞘、白氏文昌鱼、凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 、绣球海葵和居蟹皮海绵等不同进化地位的海洋无脊椎动物的钙调蛋白[19,20,21,22]。海参作为棘皮动物中代表性的一个类群, 其钙调蛋白尚未被研究发表过。该研究克隆了花刺参Ca M全长c DNA序列, 由其ORF推导出的花刺参Ca M与其他物种Ca M的相似度从95.9%到98%, 同样含有4个EF手结构域。比对花刺参Ca M内部4个EF手结构相互之间相似性的结果显示EF1与EF3相似度为51.7%, EF2与EF4相似度为48.3%;表明花刺参Ca M中EF1与EF3、EF2与EF4之间内具有很高的内同源性。这为WATTERSON等[2]和NOJIMA[3]曾提出的关于Ca M基因进化的假说提供了支撑证据。
研究对Ca M在花刺参不同组织中的mRNA表达水平作了定量分析。结果显示, Stm Ca M mRNA在呼吸树中表达量最高, 其次为体腔细胞和肠, 而体壁中则几乎检测不到其表达。刘晓云等[23]使用光学显微镜和电子显微镜观察刺参呼吸树超微结构, 发现刺参呼吸树由外向内依次为体腔上皮、肌层、血腔、内皮细胞和中央腔。内皮细胞与流经中央腔的海水进行气体交换, 同时里面含有丰富的囊泡 (吞饮小泡和质膜小泡) 可以吸收海水中营养物质。体腔上皮细胞游离面长有许多微绒毛, 胞内同样含有丰富的囊泡, 能与体腔液进行物质交换。前人对钙调蛋白功能的研究表明, 钙调蛋白在细胞分泌、细胞运动和Ca2+中起重要作用。SATIR等[24]在草履虫 (Paramecium tetraurelia) 、四膜虫 (Tetrahymena thermophila) 和淡水蚌 (Elliptio) 的纤毛基部都发现有Ca M存在, JAMIESON等[25]也证明钙调蛋白是纤毛轴丝复合物的组成成分;这些研究表明钙调蛋白可能参与纤毛的摆动[24,26]。LINDEN等[27]研究发现Ca2+/calmodulin复合体能特异的结合到有被囊泡上, 参与受体介导的细胞内吞作用。因此, 从Ca M在花刺参呼吸树中的高表达来推断, Ca M可能介导花刺参呼吸树表皮细胞中囊泡吸收营养物质的过程, 同时也可能参与微绒毛的摆动和Ca2+吸收。
cDNA克隆 篇5
银鲫Ran基因的cDNA克隆、表达特征及其在精核解凝中的作用
采用RACE-PCR技术结合SMART cDNA合成技术,从银鲫中克隆到Ran的全长cDNA并对其编码区全长进行了原核表达、相应抗体制备及其时空表达特征分析.RT-PCR结果表明,Ran基因除在脑组织的转录水平较低外,其它组织中的转录水平几乎相同;Ran基因在不同发育阶段的胚胎中都有mRNA转录,但其mRNA的量在原肠期以后呈下降趋势.Western blot结果表明,Ran在卵巢和精巢中均高水平表达,在心、脑、肝、脾、肾中有较低水平表达,在肌肉中则不表达.同时检测到Ran在不同胚胎发育阶段均有较强表达.这表明,Ran基因在银鲫中可能起着多种作用,尤其在生殖细胞的发生中具有重要作用.最后,采用免疫耗竭对该基因编码的蛋白在精核解凝中的`作用进行了初步研究,结果表明,Ran蛋白可能与精核解凝相关.
作 者：李常健 刘军 桂建芳 LI Chang-jian LIU Jun GUI Jian-fang 作者单位：李常健,LI Chang-jian(中国科学院水生生物研究所,湖北,武汉,430072;湖南科技学院生命科学与化学工程系,湖南,永州,425006)刘军,桂建芳,LIU Jun,GUI Jian-fang(中国科学院水生生物研究所,湖北,武汉,430072)
刊 名：水产学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA 年，卷(期)： 30(3) 分类号：Q959.468 S917 关键词：银鲫 Ran 时空表达 精核解凝cDNA克隆 篇6
苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud),又叫“中国草”,起源于中国,属荨麻科苎麻属的多年生草本植物。苎麻是优良的天然韧皮纤维作物,具有良好的可纺性能,是纺织工业的重要原料,目前我国苎麻栽培面积与总产量占世界的90%以上,是我国重要的出口创汇产品之一。苎麻是多年生无性繁殖作物,它的纤维主要在韧皮部。由于开花要消耗大量的养分,因而苎麻开花会降低它的韧皮纤维长度、结晶度和产量。所以三麻时苎麻的产量和质量都较差。通过研究苎麻的性别表达问题,进而研究调控它的开花,为生产中提供不开花的苎麻品种或为育种家提供材料。同时由于苎麻的杂合性,种子繁殖会造成后代的严重退化,通过研究苎麻性别表达,笔者期待找出苎麻通过单一性别繁殖的材料,以利于苎麻优良性状的固定以及苎麻的推广。另外,苎麻的性别决定研究,可以为那些无性繁殖为主的且是雌雄同株不同花的植物,如一些果树、林木等等,提供理论依据。相对于其他的无性繁殖为主的且是雌雄同株不同花的植物,苎麻是一个很好的模式作物。再者,通过研究苎麻的性别决定来人为地调控麻株的性别,可以改良优良苎麻品种使其表现单一性别用做杂种优势利用的母本或父本,免去杂种制种去雄的工序,提高制种的纯度。而这种单一性别的优良的苎麻品种还可以通过无性繁殖固定和繁殖,从而实现两系法育种[1]。
虽然现在可以人为地对植物器官和植物个体的性别进行一定的控制,但这种控制仍具有很大的盲目性,很难定向地驾驭某种植物的性别。尽管关于拟南芥、矮牵牛等植物两性花发育的模式已有较全面的了解,但是这些模式仍然无法充分解释一些物种花发育过程中的现象。不同物种间,器官的形成和发育途径如此复杂,那么,还有多少种鲜为人知的植物性别器官发育模式?因此,为满足人类生产和生活的需要,从分子水平上深入研究性别决定机制及性别表达机理,寻求控制植物性别的途径和方法,是十分必要的。
在植物的生活史中,性别决定是一个重要的发育过程。这一过程在什么时候出现,什么部位发生以及如何进行,在不同植物中有很大差异。植物的性别决定机制主要有三种:性染色体、基因平衡、性别决定基因。雌雄异株的开花植物一般是由性染色体决定其性别。对于雌雄同株的植物来说,一般它们的性别是由基因决定的。分子水平上的研究表明,植物的性别分化就是在特异信号作用下分化程序表达的结果。根据这一思路,可以把性别分化研究分为三个层次,即分化程序、诱导信号和性决定基因。一般认为性决定基因调节雄性或雌性分化途径的相对活性,在性别分化程序表达中发挥决定性作用。性决定基因的研究是性别分化中最高水平的研究,也是彻底解决性别表达机理的关键所在。近五年来,分离性别分化特异表达基因的研究异常活跃。其研究思路和方法主要有:(1)以特异蛋白质为基础的基因克隆方法。如Boissay根据山靛中存在与雄性相关的特异的过氧化物酶,用编码过氧化物酶特异位点的简并寡核苷酸探针从山靛的雄花中分离过氧化物酶基因。(2)已知基因的分离与表达研究。如以金鱼草的MADS-box基序序列为探针,分离白麦瓶草(Silene latifolia)和酸模(Rumex acetosa)中的MADS box基因,并用原位杂交法研究其表达。(3)根据特异表达性分离未知的性别分化特异表达基因。如Mat-sunaga等以差异筛选法分离了白麦瓶草的雄性器官特异基因Lsj,Delong等以转座子标签法分离了玉米的性别决定基因Ts2。
MADS基因名称来源于四种MADS-box基因的首字母,这四种基因分别为酿酒酵母的MCMI、拟南芥的AGMOUS、金鱼草的DEFICIENS及人类的SRF4,它们所编码的蛋白因子具有共同的保守序列[2]。典型的植物MADS基因包含MADS区、I区、K区和C-末端4个结构域[3],包括6个内含子和7个外显子[4]。其中外显子1编码60个氨基酸组成的高度保守的MADS区,是一个序列特异的DNA结合基元。外显子3~5编码半保守的K区,由70个氨基酸组成,是保守二级结构的区域,是植物MADS盒的特征序列,也是发生二聚体的结合基元。最后2~3个外显子编码C末端,C端位于K区下游,是由约30个氨基酸组成的非保守序列。I区由外显子2编码,位于MADS区和K区之间,是由31~35个氨基酸组成的非保守区。
MADS盒基因编码一类转录调控因子,是一类调节植物发育的重要基因,在决定植物开花时间和花形态建成中均起着非常重要的作用。它在植物中广泛存在,从拟南芥、金鱼草、白麦瓶草、玉米等作物中分离到有许多控制花形态建成的基因都属于MADS盒基因,其中部分MADS盒基因与植物性别决定相关。如已经报道的拟南芥基因AP3和PI基因与雄蕊的发育有关[5],玉米雄性性别相关基因Ts1和Ts2[6],与金鱼草雄性发育相关的基因DEF和GLO[7]。MADS是保守的序列,在不同作物中已经分离到的MADS盒基因有80几个,可以根据同源性分为14个亚家族,它们的同源性都在60%以上。有的在不同物种中都完全同源,表明MADS的保守性很强[8]。功能研究表明,它们可以调控花的形态建成和发育,我们可以利用基因的共线性设计简并引物结合RT-PCR技术分离苎麻的MADS-box基因来研究苎麻MADS-box基因对苎麻性别的影响,从而研究其功能与进化。
逆转录聚合酶联反应(reverse transcriptase,RT-PCR)是以RNA为起始材料经逆转录反应产生c DNA,再以c DNA为模板进行PCR扩增,而获取目的基因或检测基因表达的实验技术。RT-PCR的基本原理是:首先,RNA在逆转录酶作用下反转录为c DNA第一链;然后,在DNA聚合酶的作用下扩增目的基因:PCR第一个循环由正义引物和c DNA第一链退火结合,在DNA依赖的DNA聚合酶指导下合成第二链,从PCR第二循环起开始扩增目的片段。
本研究一方面通过对苎麻的田间调查,获得苎麻性别的数据,分析其性别表达的遗传规律;另一方面以苎麻为材料,针对MADS保守区设计引物,利用RT-PCR方法,试图从苎麻的花中分离出含有MADS基因的c DNA片段,为从分子水平上深入研究性别表达机理和探讨其与苎麻性别表达的关系提供研究材料。
1 材料与方法
1.1 材料
以国家种质长沙苎麻圃内苎麻种质为材料。
1.2 实验药品
Taq DNA聚合酶,β-巯基乙醇,Tris碱,琼脂糖,溴酚蓝,为上海生工的进口分装试剂,其他常规试剂均为国产分析纯,RNAplant试剂盒、M-MLV Reverse Transcripate试剂盒、DNA ladder购自北京天为时代科技有限公司,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 实验方法
1.3.1 田间调查
调查地点:国家种质长沙苎麻圃
调查时间:2011年5月
调查项目:全雌花,全雄花,雌雄同株,无花,总株数
调查对象:雌性自交系F1代1313和1394头麻
1.3.2 苎麻花的RNA的提取
RNAplant提取试剂小量法提取(样品<0.1g)。
RNAplant试剂可以从植物组织中,特别是富含多酚或淀粉的植物组织中提取高纯度的总RNA。本研究根据厂商说明书略作改良。
1.3.3 c DNA的合成
用M-MLV Reverse Transcripate合成第一链c DNA。M-MLV酶具有较高的催化反应温度和低RNase H活性,较好地保证了c DNA合成的完整性,利用随机引物为逆转录引物,以苎麻花的总RNA为模板制备c DNA。
1.3.4 苎麻MADS基因简并引物的设计
按照MADS-box结构域蛋白氨基端和羧基端的保守序列,利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计5’端引物:ATG GGN MGN GGN AAY GTN GA和3’引物:ATN ARN GCN ACY TCN GGR TC。加双蒸消毒水溶解成10umol/L的浓度,-20℃保存备用。
1.3.5 PCR反应
由于使用简并引物需要优化PCR反应条件,设置了Mg Cl2浓度(5种Mg Cl2浓度:1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L),以获得适宜的PCR参数。
(1)Mg Cl2浓度梯度PCR 50ul反应体系用量。
(2)融化后的各试剂轻涡旋混匀并离心一下,于冰上加样。
(3)轻轻混匀反应液并在液体上加1~2滴(约50ul)矿物油。
(4)PCR反应程序:94℃加热变性2min,随后35个循环,每个循环94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃延伸10min。
(5)按设置的梯度体系进行电泳,分别取10ul PCR产物加入6×DNA Loading Buffer,于含EB1%的琼脂糖凝胶中电泳,100V,1小时,经凝胶成像系统紫外灯下数字化成像保存,比较不同条件下PCR结果的差异。
2 结果与分析
2.1 雌性系F1代性别表达
1313和1394后代是单性型苎麻(雌性系,只开雌花)自交的F1代。从表二结果来看,F1代有多种性别表现,包括雌株、雄株、雌雄同株和无花株。头麻时1313和1394各种性别表现均出现。其中,1313雌雄性比为0.5,雌雄同株数占总株数的11.4%;1394雌雄性比为0.56,雌雄同株数占总株数的8.8%。二麻时1313和1394雌雄同株几乎不出现,而1313雌雄性比为0.89,1394为1.14。三麻时雌株、雄株和雌雄同株都会出现,此时1313的以雌性为主,雄性只占很少一部分。1394的群体中雌雄性比大约是2.7。三麻时雌雄同株在群体中占大多数,达一半以上。从三季麻开花情况来看,1313和1394性别表达受环境的影响而变化,头麻以雄性为主,二麻雌雄差不多而雌雄同株则不多,三麻又以雌雄同株为主。三季麻平均结果来看,1313和1394的雌雄性比分别是0.63与0.59。
从这些性别表达类型可以看出,苎麻性别表达机制十分复杂,遗传变异类型丰富,我们推测控制苎麻基因全雌性状的基因不止一对,可能受多对基因控制。研究苎麻的性别表达,对选育优质高产苎麻新品种和强优势杂交组合具有重要的理论和应用价值。而以往这方面的研究工作尚未见报道,要完全明确其遗传变异规律,还应该做进一步深入的研究工作。
注:表二中的数据均为中国农科院麻类研究所多年生麻类资源项目组提供的二麻和三麻调查数据。
2.2 苎麻花RNA的分离
采用RNAplant试剂从田间生长旺盛的苎麻花组织中提取RNA。RNA琼脂糖凝胶电泳分析结果(如图一)显示28S r RNA、18S r RNA和5S r RNA共三条明显的带,从三条带的亮度判断,RNA有较好的完整性;用紫外分光光度法测得A260/A280为1.5~1.8,表明RNA纯度较高。以上结果表明,该方法提取RNA效果较好,可以用于RT-PCR实验。
1:1kb DNA ladder 2~6:Mg2+浓度分别为1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L注:箭头所指为凝胶电泳所获得的带。
2.3 RT-PCR方法分离出c DNA片段
本实验利用两个引物组合,在不同Mg2+浓度下用RT-PCR方法从苎麻的花中分离出了c DNA片段(如图二)。通过凝胶成像系统分析,当退火温度为72℃时Mg2+浓度在1.5mmol/L和3.0mmol/L时有比较明显的带,大小在1000bp左右。而Mg2+浓度在2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.5mmol/L时,带很模糊。综合考虑到Mg2+过高会产生非特异性带和错配以及退火温度对扩增产物的影响[9],选择出最适宜的Mg2+浓度为1.5mmol/L。而获得的最佳RT-PCR扩增程序为94℃加热变性2分钟,随后35个循环,每个循环94℃变性45秒,50℃退火45秒,72℃延伸45秒,最后72℃延伸10分钟。通过用本实验得到的c DNA片段与苎麻花总RNA进行Northern杂交,选择杂交信号较强的c DNA片段进行测序,可以分析其是否含有保守的MADS基因,这些工作还在进行当中。
3 讨论
RT-PCR要求高质量的RNA。苎麻属植物的组织中含有较多的酚和多糖[10],对其高质量RNA的提取产生干扰。酚类化合物易被氧化与RNA不可逆地结合,导致RNA活性丧失。多糖则会形成难溶的胶状物与RNA一起沉淀下来,还可以抑制许多酶的活性,污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究[11]。因此,能否有效地去除酚类化合物和多糖是提取高质量的植物RNA成败的关键。为防止酚类化合物被氧化,一般可以在提取缓冲液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或半胱氨酸[11]。高浓度Na+或K+离子存在的条件下,通过苯酚、氯仿抽提可以去除一些多糖,但效果不佳。用低浓度乙醇(10%~30%)是一个去除多糖效果的较好的方法。因为10%~30%乙醇能沉淀多糖,而RNA需要在75%的乙醇中才能沉淀下来。另外,还可以用5M醋酸钾沉淀多糖。也可以将上述两种方法结合使用,效果更佳。试剂盒提取RNA,方法简单,且不易被RNA酶污染,提取的RNA质量较高,可以用于分子生物学实验的研究。本实验通过改良试剂盒提取方法,适当延长各提取步骤的离心时间,并增加溶解RNA的时间,可排除多糖的干扰,得到高质量的总RNA。但试剂盒提取成本较高。
本研究虽然获得了较高质量的RNA,但RT-PCR结果还不太理想。影响结果的可能有以下两方面的原因:第一,Mg2+浓度和退火温度都是影响RT-PCR扩增产物产量的因素。本实验根据引物的Tm值和RT-PCR产物的Tm值算出的退火温度,设计RT-PCR Mg2+浓度梯度扩增程序,并根据实验结果找到了适宜RT-PCR扩增程序的Mg2+浓度。由于时间关系,我们没有设计温度梯度实验。而要找到最佳退火温度,还应该设计一个温度梯度RT-PCR,从比Tm值低的温度试起,逐渐升高温度,直至找到扩增产物的最佳温度。第二,能否有效地获得含有MADS基因的c DNA片段,引物是另一个关键因素。一般情况下需要设计10对以上的引物进行实验,从中挑选出扩增最有效的引物。
总体说来,本研究设计及通过实验过程中获得的经验对实验进行调整,是可以获得比较高质量的含有MADS基因的c DNA片段。
植物的性别表达是一个受多基因控制的复杂事件,从苎麻雌性系的性别表达看来苎麻的性别表达更是复杂多样,因而运用分子生物学方法研究苎麻的性别表达是一个漫长而艰难的探索过程。本实验仅仅是一个开始,为进一步的研究工作提供最基础的实验方法和实验材料。要进一步地研究MADS基因,就必须用本研究得到的c DNA片段与苎麻花总RNA进行Northern杂交,选择杂交信号较强的c D-NA片段进行克隆、测序,分析其是否含有保守的MADS基因。这是下一步需做的工作。
参考文献
[1]喻春明.苎麻性别特异材料的研究[D].北京:中国农业科学院,2001.
[2]胡丽芳,金志强,徐碧玉.MADS-box基因对花的发育及开花早晚的影响[J].生命科学研究,2004,8(04):7-12.
[3]田波,陈永燕,严远鑫,等.一个竹类植物MADS盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达[J].科学通报,2005,20(02):145-151.
[4]郑尚永.棉花花器官特异MADS-box基因GhMADS-1的克隆[D].重庆:西南农业大学,2003.
[5]Diatchenko,L.,Lau,Y.-F.C.,Campbell,A.P.,Chenchik,A.,Moqadam,F.,Huang,B.,Lukyanov,S.,Lukyanov,K.,Gurskaya,N.,Sverdlov,E.D.&Siebert,P.D.Suppression subtractive hybridization:Amethod for generating differentially regulated or tis-sue-specific cDNA probes and libraries.Proc.Natl.A-cad.Sci.USA,1996,93(12):6025-6030.
[6]Riechmann JL,Meyerowitz EM.MADS do-main proteins in plant development.Biol Chem,1998,(378):1079-1101.
[7]汪俏梅,孙耘子,于凤池.植物性别决定基因研究进展[J].细胞生物学杂志,2002,24(01):30-34.
[8]Sheppard L.A.,Brunner A.M.,Krutovskii K.V.,et al..A DEFICIENS Homolog from the Dioecious Tree Black Cottonwood Is Expressed in Female and Male Floral Meristems of the Two-Whorled,Unisexual Flowers[J].Plant Physiology,2000,(124):627-639.
[9]陈建荣.苎麻木质素合成关键酶CCoAOMT基因分离及遗传转化的研究[D].长沙:湖南农业大学,2005.
[10]郭安平,黄明,郑学勤,等.几种麻类作物及其近缘种植物总DNA的提取与鉴定[J].中国麻作,1997,19(04):4-10.
cDNA克隆 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料与菌株
植物材料是普通小麦品种EM12 (Triticum aestivum L.) , 感受态大肠杆菌DH5α, 均由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂
Ex Taq DNA聚合酶、LA Taq酶、RNase H、TdT酶和pMD18-T载体购自TaKaRa公司, M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂购自Toyobo公司, 植物组织总RNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司, 引物合成与DNA测序由北京奥科生物技术有限公司完成。
1.1.3 引物合成与测序
根据已知EST序列 (BG909132) , 设计合成引物如下:
GSP3-1:5'-CAGCAATCTTTTCCGCCTCA-3';
GSP3-2:5'-GGGCTCACCTGATGTTTACTTA-3';
3'AAP:5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC (T) 18-3';
3'AUAP:5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'。
GSP5-1:5'-TACCACCCCTGTCTTATG-3';
GSP5-2:5'-TGAGGCGGAAAAGATTGCTG-3'。
5'AAP:5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC (G) 12-3';
5'AUAP:5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取
剪取小麦幼叶 (约100mg) , 参照植物组织总RNA提取试剂盒的操作提取叶片总RNA。
1.2.2 3'-RACE扩增
以总RNA为模板, 用3'AAP引物进行反转录合成首链cDNA。以反转录液为模板, 用GSP3-1和3'AUAP进行PCR反应, 反应条件:94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 2min, 25个循环;将反应液稀释10倍作模板, 用GSP3-2与3'AUAP进行第二轮PCR, 退火温度改为61℃, 扩增30个循环。将第二轮PCR产物连接T-载体, 转化筛选DH5α阳性克隆进行测序。
1.2.3 5'-RACE扩增
参照末端脱氧核糖核酸转移酶法[7]进行5'末端序列的扩增, 方法上略有改动。以叶片总RNA为模板, 用GSP5-1反转录合成首链cDNA。反转录液中加入0.5μL RNase H, 37℃消化30min, 加无水乙醇沉淀, 再20μL ddH2O溶解。取15μL cDNA纯化产物进行dCTP加尾反应, 反应体系25μL。以该反应液为模板, 用GSP5-2和5'AAP进行首轮PCR, 用GSP5-2与5'AUAP进行第二轮PCR, 反应条件同1.2.2。将第二轮PCR产物连接T-载体, 转化筛选DH5α阳性克隆进行测序。
2 结果与分析
2.1 RACE扩增结果
3'-RACE电泳结果 (图1-A) 显示近1 200bp的条带, 测序为1 234bp。5'-RACE的电泳结果 (图1-B) 显示450～500bp间的条带, 经测序为496bp。
A:3'RACE PCR products; B: 5'RACE PCR products;M: DNA Marker.
2.2 测序结果分析
将克隆结果拼接, 得到长2 150bp的cDNA序列, 其ORF序列长1 707bp, 可编码568个氨基酸, 预测蛋白质分子量62.5kDa, 理论等电点 (pI) 6.80, 具体序列如图2所示。根据软件SingalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 分析, 该氨基酸序列中包含一段19个氨基酸残基的信号肽序列, 该信号肽序列是麦类作物所特有的。
选取13个ZDS基因序列作为参考, 应用DNAstar软件进行序列比对与同源进化分析。核酸序列比对显示, 小麦ZDS基因与其他植物ZDS基因的核酸序列一致性均在73%以上, 其中与禾本科作物玉米和水稻ZDS基因的序列一致性分别为87%和89%;氨基酸序列比对结果显示, 小麦ZDS蛋白与其它植物ZDS蛋白的氨基酸序列一致性均在77%以上, 同源性在89%以上, 其中与玉米、水稻的序列一致性分别为86%和93%, 序列同源性分别为91%和97%。由此, 可以推断该段小麦基因序列确为ZDS基因序列。该序列已经登录到GenBank数据库, 登录号为FJ169496。进化树分析显示 (图3) , 小麦ZDS蛋白与水稻、玉米等单子叶植物的ZDS蛋白同源性更高, 而与柑橘、番茄等双子叶植物的ZDS蛋白的同源性相对低些, 这符合物种进化的规律。
3 讨论
在植物类胡萝卜生物合成途径中, 从Phytoene到Lycopene是PDS、ZDS与CRTISO三个酶共同作用的结果[8], 但早期的研究主要集中在PDS的功能与生物调控研究。近年来, ZDS的研究也逐渐展开。2004年, Rodrigo Maria-Jesus等[9]克隆成熟柑橘果实PDS和ZDS的cDNA序列, 并发现ZDS对柑橘果实中类胡萝卜素的积累起重要的正调控。而Jérémy Clotault等[10]的研究也证实, 胡萝卜根组织中番茄红素和叶黄素含量与ZDS基因的表达有直接关联, 认为ZDS基因是影响番茄红素积累的关键酶。同年, Ji Jing等[11]在烟草中过量表达Gentiana lutea的ZDS基因, 使叶片β-胡萝卜素含量提高了91%, 花中β-胡萝卜素含量提高了49%。
目前, 小麦类胡萝卜素研究主要是研究硬粒小麦类胡萝卜素含量与小麦品质间的关系, 而对于生物合成途径的研究仅限于基因的染色体定位[6,12]和QTL位点的研究[13,14], 至今得到全序列的基因仅有PSY基因[15,16]。本研究利用RACE技术成功地克隆了小麦ZDS基因的cDNA全序列, 为进一步深入研究ZDS基因及其他类胡萝卜素生物合成基因在小麦类胡萝卜素生物合成途径中的功能提供了研究基础, 也为进一步利用基因工程改良小麦营养品质的研究提供了条件。
The GenBank accession number of ZDS genes as follow: Arabidipsis thaliana, ATU38550; Capsicum annuum, X89897; Chrysanthemum, AB205052; Citrus unshiu, DQ309869; Daucus carota ZDS1, DQ222430; Daucus carota ZDS2, DQ192189; Gentiana lutea, AB017370; Helianthus annuus, AJ438587; Lycopersicon esculentu, DQ412572; Narcissus pseudonarcissus, AJ224683; Malus×domestica, AF429984; Oryza sativa, NM001065680; Zea mays, AY641394.
摘要：目的:从普通小麦品种EM12中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶 (ζ-carotene desaturase, ZDS) 基因的cDNA全长序列。方法:根据已报道的EST序列, 应用cDNA末端快速扩增 (RACE) 技术, 对EST两端未知序列进行扩增、克隆和测序。结果:克隆得到cDNA全长序列2150bp, 其ORF序列为1707bp, 预测编码568个氨基酸残基, 推测蛋白质分子量62.5kDa, 带有一段19aa的信号肽序列。结论:根据同源序列分析, 该序列与水稻ZDS蛋白的同源性为97%, 与玉米ZDS蛋白的同源性为91%, 而且与其他高等植物的ZDS都具有较高的同源性。该基因序列的分离与克隆为进一步开展小麦β-胡萝卜素生物合成机制的研究和利用转基因技术提高小麦β-胡萝卜素含量的研究奠定了基础。
cDNA克隆 篇8
钙依赖型蛋白激酶 (Calcium Dependent Protein Kinase, CD-PK) 在生物中研究较多, 但莲藕尚未报到。该激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶类型, 其活性不需要钙调素 (Ca M) 参与而直接受Ca2+激活[1]。植物中, CDPK参与多种代谢途径, CDPK存在于多种亚细胞器中, 表明CDPK在植物发育过程中起到非常重要的作用[2]。尤其逆境环境下, 该蛋白激酶对植物的适应性反应至关重要植[3]。Ca2+作为植物细胞转导中的第二信使, 在植株受到外界逆境胁迫时, 其水平会发生明显变化, 依赖于Ca2+的CDPK基因表达量也会随之上升, 从而促进响应蛋白的产生。由此可知, CDPK基因在植株遭受逆境胁迫时, 对促进蛋白磷酸化进程, 起了重要作用[4]。植物中CDPK是一个多基因家族, 家族中很多成员参与植物逆境信号的转导[5]。该家族成员从蛋白质的N端到C端, 存在4个典型的功能域, 即可变区、催化区、连接区和调控区。一般来讲, 不同物种在可变区内氨基酸的同源性很低, 然而催化区却表现出高度的同源[6]。CDPK激酶调控区的氨基酸序列在物种之间差异很大, 同源性较低, 是Ca2+和CDPK激酶的结合位点[7]
莲藕 (Nelumbo nucifera Gaertn) 是睡莲科多年生水生草本植物。近年来, 随着自然灾害范围的不断扩大, 已严重影响莲藕栽培品质和产量[8,9]。到目前为止, 还没有莲藕CDPK的相关研究, 因此拟通过PCR-RACE克隆技术得到基因全长, 为下一步研究莲藕CDPK功能提供必要的数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
试验材料为莲藕主栽品种“美人红”, 种植于扬州大学水生蔬菜试验基地。栽培管理同普通大田。
1.1.2 试剂
5’-Full RACE Kit试剂盒、LA Taq酶、DNaseⅠ、DL2000DNA Marker、p MD18-T载体、DNA凝胶回收试剂盒
1.1.3 实验仪器
PCR仪 (mastercycler-pro, 德国Eppendorf公司) ;离心机 (TGL-20m, 湖南赛特湘离心机仪器有限公司) ;水浴锅 (K-S26, 上海精宏实验设备有限公司) ;电泳槽 (JY-CXAB, 北京君意东方电泳仪器有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 莲藕幼叶总RNA的提取及RT-PCR反应
选择生长健壮“美人红”的植株, 取其的幼嫩叶片置于液氮速冻。采用CTAB法提取叶片的总RNA。利用Tarkara公司的反转录试剂盒进行反转录, 合成c DNA。反应条件为42℃, 60min→70℃, 15min。反应结束后反应液于-20℃保存。CDPK引物:GSP1:AGGTGTTGAAGCGGAATTATG;GSP2:TCAACAGGTGCTCGAACATTC (图1) 。
1.2.2 CDPK基因全长c DNA克隆
运用套式PCR反应对CDPK基因3’端进行克隆。Outer PCR反应体系包括上述反转录液2μl, 1×c DNA Dilution BufferⅡ8μl, Gene Specific Outer Primer 2μl, 5’RACE Outer Primer (10μmol/L) 2μl, 10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+Plus) 5μl, Ta KaRa LA Taq (5U/μl) 0.5μl, 用dd H2O补足至50μl;反应条件为:94℃下10min, 94℃变性下60s, 57℃下45s, 72℃下1.5min, 72℃下10min, 35个循环, PCR产物4℃下保存。Inner PCR反应体系包括Outer PCR反应液1μl, d NTP Mixture (2.5mmol/L each) 8μl, 10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+Plus) 5μl, Gene Specific Inner Primer 2μl, 5’RACE Inner Primer (10μmol/L) 2μl, Ta KaRa LA Taq (5U/μl) 0.5μl, 用dd H2O补足至50μl;反应条件为, 4℃下10min, 94℃下0.5min, 58℃下0.5min, 72℃下1.5min, 35个循环, 72℃下10min, PCR产物4℃保存。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.2.3 PCR扩增产物的克隆与测序
PCR产物的纯化使用的是Ta KaRa的DNA凝胶回收试剂盒。操作方法与试剂盒说明书相同。取纯化后的PCR产物进行TA克隆, 提取质粒, 通过PCR和酶切反应鉴定获得阳性克隆, 测序工作由上海生工生物有限公司完成。
2 结果与分析
2.1 全长基因的获得
根据设计的引物, 利用槽式PCR方法进行基因3’端未知序列进行克隆。由图2可以看出莲藕CDPK基因3’端PCR-RACE后出现的条带大小在1 100bp左右, 目的条带都非常清晰明亮, 可以进行下一步的基因克隆
2.2 基因序列分析
选择鉴定好的克隆, 送到上海生工生物工程股份有限公司进行测序, 结果表明, 莲藕CDPK基因通过3’RACE技术扩增得到一条片段长度为1 115bp的序列。将3’RACE-PCR测序结果与莲藕数字转录组测序所得序列进行拼接, 得到一条含有poly (A) 尾, 长度为2 039bp的全长c DNA序列, 包括374bp的3’非编码区和1 665bp的开放阅读框, 编码554个氨基酸 (图3) 。
2.3 Lr CDPK与其他物种CDPKs的同源性分析
将此核苷酸序列在NCBI网站上进行Blast比对, 发现其与大豆CDPK10相似蛋白 (XM 003522299.1) 、CDPK30 (XM003528129.1) 相似蛋白的c DNA序列的最大序列相似度均为80%, 与蓖麻CDPK基因 (XM 002511460.1) 、皱叶烟草CDPK8基因 (AJ699160.1) 的c DNA序列的相似度为78%、71%。将莲藕CDPK基因编码的氨基酸序列在NCBI上进行Blast分析, 结果发现其与葡萄CDPK30 (XP 002266733.1) 、大豆CD-PK10相似蛋白 (XP 003522347.1) 、蓖麻CDPK (XP002511506.1) 、曼陀罗CDPK1 (ABY28389.1) 的同源性较高, 分别为84%、82%、83%和81%。 (图4所示) 。但从基因进化来讲, 其亲缘关系要远于其他单子叶植物和双子叶植物 (图5所示) 。
3 讨论
研究表明, CDPK参与植物多种代谢过程, 其中包括物质代谢、水分运输、离子运输、细胞骨架调节、气孔运动调节、生长发育调节等, 尤其在逆境应答方面, 钙离子信号蛋白激酶被认为是启动细胞中原初免疫反应的重要物质[10]。另外, CD-PKs还能能够通过自身磷酸化或调节其他酶的活性完成植物某些代谢反应[11], 例如, 大豆根瘤共生膜蛋白26[12]、液泡膜上的水通道蛋白[13]、磷酸肌醇4激酶[14]、叶片硝酸还原酶[15]、保卫细胞液泡膜的阴离子通道[16]、质膜的内向K+通道蛋白等[17]都受CDPKs的调控。近年来发现CDPKs在植物抗逆过程具有不可替代的作用。盐和干旱胁迫后的拟南芥植株中CDPK的表达量急剧增加, 其主要原因是逆境胁迫下改变细胞的渗透势, 进而诱导CDPKs的快速合成[18]。拟南芥植株中过表达CDPK后能够显著提高植株的抗逆境胁迫能力[19,20]。CDPKs不仅在非生物胁迫信号转导过程中起到重要的作用, 还能够通过改变生物胁迫后植株体代谢途径, 减少生物带来的伤害。植物接种真菌后质膜H+-ATPase发生脱磷酸化现象, 这种脱磷酸化的H+-ATPase还能被CDPK重新磷酸化, 进而改变代谢途径, 提高植物的免疫能力[21]。本实验从莲藕中分离到1个CDPK基因, 其与大豆、蓖麻和烟草CD-PKs同源性很高, 因此被命名为Lr CDPK。该基因的发现将为今后研究基因的功能, 尤其对逆境环境适应方面奠定基础。综上所述, CDPKs对植物的生长发育和提高植物对外界胁迫的能力均有重要的意义。
3 结论
本文通过PCR-RACE方法克隆到全长的莲藕CDPK基因。该基因长度为2 039bp, 含有一个1 665bp的开放阅读框, 能够编码554个氨基酸。利用BLAST软件比对后发现, 莲藕CDPK基因与其他作物CDPK基因的同源性为80%、80%、78%和71%, 其氨基酸序列葡萄、大豆、蓖麻及曼陀罗的同源性分别为84%、82%、83%和81%。
摘要：目的:克隆莲藕CDPK基因的cDNA全长并对其进行序列分析。方法:根据已有的ESTs序列, 设计3’端RACE引物, 运用RACE技术克隆莲藕CDPK基因cDNA全长。结果:克隆得到一条含有poly (A) 尾, 长度为2 039bp的全长cDNA序列, 包括374bp的3’非编码区和1 665bp的开放阅读框, 编码554个氨基酸。其核苷酸序列与其他作物CDPKs的同源性为80%、80%、78%和71%。其氨基酸序列与NCBI数据库中葡萄CDPK、大豆CDPK、蓖麻CDPK及曼陀罗CDPK1的同源性较高, 分别为84%、82%、83%和81%, 因此把研究得到的基因命名为LrCDPK。结论:CDPK基因的分离, 为进一步研究该基因在莲藕生长发育过程中的功能奠定基础。
cDNA克隆 篇9
榕江小香羊又名黔东南小香羊,属于肉皮兼用经济类型,已被列入《西南四省区畜禽品种遗传资源多样性补充调查报告( 贵州篇) 》。中心产区位于黔东南苗族侗族自治州榕江、雷山两县交界的塔石。榕江小香羊个体小,体型紧凑,结构匀称,该品种繁殖性能高,平均产羔数为2. 10只[11]。在分子水平上,关于榕江小香羊GnRHR基因的研究国内外未见报道,试验以榕江小香羊为研究对象,通过分子克隆技术对GnRHR基因c DNA进行克隆测序,并对结果进行生物信息学分析,以期为进一步研究小香羊GnRHR基因的表达调控以及与繁殖性状相关分析研究提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1. 1试验动物
小香羊母羊3只,采自贵州省雷山县。屠宰过程中,立即采集垂体组织,将新鲜的组织样置于液氮中保存。所采样品带回实验室于 - 80 ℃ 保存,用于后续试验。
1. 2 主要试剂及仪器
EASY dilution、DL - 2 000 Marker,均购自鼎国生物工程技术有限公司; DEPC、c DNA反转录试剂盒、胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒、p UCm - T载体、大肠杆菌DH5α 感受态细胞,均购自上海生工生物工程技术服务有限公司; RNA提取试剂盒 ( TRIzol) ,购自Life technologies公司; 凝胶成像系统、PCR仪,均购自美国Bio - Rad公司。
1. 3 引物的设计与合成
参照Gen Bank收录的GnRHR c DNA基因序列( 登录号为NM_001009397) ,运用Primer Premier 5. 0和Oligo 6. 0软件对特异性引物进行分析设计,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列: 上游引物5' - GCCAGAAACAGGAGTCTTGAAGC - 3',下游引物5' - TGCTTTGCGTTTCTCATTCCCG - 3',扩增片段大小为1 103 bp。
1. 4 总 RNA 的提取和 c DNA 合成
利用TRIzol法对每个品种羊组织样的总RNA进行提取,用分光光度计对260 nm、280 nm条件下的吸光度进行测定,并对RNA的浓度和纯度进行计算。采用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。在总RNA反转录前,用RQ1 RNase - Free DNase Ⅰ消化上述制备的RNA样品中的基因组,消除基因组DNA的污染。按照M - MLV First Strand Kit反转录试剂盒进行反转录,反应总体积( 20 μL) : 50 μmol/L Oligo( d T) 20 1 μL,10 mmol / L d NTPs混合物1 μL,5 × 第一链合成缓冲液4 μL,0. 1 mmol / L DTT 2 μL,M - MLV逆转录酶1 μL,总RNA ( 最大为500 ng) ,RNase Free dd H2O补至20 μL。反转录条件为37 ℃50 min,70 ℃ 15 min。将反转录产物至于 - 20 ℃ 保存,备用。
1. 5 克隆及重组子筛选与鉴定
以上述c DNA为模板,分别对GnRHR基因进行PCR扩增。 扩增体系总体积 ( 20 μL ) : 2 × Es Taq Master Mix 10 μL,10 mmol / L上、下游引物各1 μL,c DNA 1 μL,用灭菌超纯水补充至20 μL。反应程序如下: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,共34个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳,按照胶回收试剂盒说明书回收目的DNA片段。将目的DNA与p UCm - T载体连接,转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞,涂布于含氨苄西林( Amp) 、X - gal和IPTG的LB琼脂平板中,37 ℃培养14 ~ 16 h。挑选白色菌落进行培养,经抽提质粒和PCR鉴定为阳性克隆,送英潍捷基贸易公司测序。
1. 6 序列分析
利用在线软件对GnRHR基因蛋白二级结构、跨膜区域和信号肽进行预测。
编码蛋白的二维结构预测软件: Predict Protein在线工具 ( https: / /www. predictprotein. org /) 。
氨基酸的跨膜结构区域预测软件: TMHMM在线工具( http: / /www. cbs. dtu. dk /services/TMHMM/) 。
氨基酸序列理化性质预测: Protparam在线工具( http: / /www. expasy. org /tools/protparam. html) 。
2 结果与分析
2. 1 总 RNA 的检测
RNA模板的完整性是获得全长c DNA及RT -PCR扩增成功的基础,采用分光光度计检测提取的总RNA样品,OD260/ OD280比值在1. 8 ~ 2. 0之间,表明样品质量较好。1% 的琼脂糖凝胶检测提取小香羊垂体组织总RNA,可见18S和28S条带清晰,无条带弥散现象( 见图1) 。表明所提取的总RNA中蛋白质和其他污染较少,纯度较高,符合反转录的要求。
2. 2 RT - PCR 的扩增及重组子的鉴定
选取较好的单克隆菌落培养,经PCR法鉴定阳性重组子与目的片段一致。RT - PCR扩增,采用1%的琼脂糖凝胶检测结果,可见扩增片段与预期片段( 见图2) 大小相符,经克隆测序获得序列长度为1 103 bp。
M. DL - 2 000 Marker ; 1. RT - PCR 产物 。
2. 3 GnRHR 基因 c DNA 序列分析
利用DNAMAN 4. 0软件根据测序结果进行拼接,得到产物长度为984 bp,与预期片段大小相符。包含GnRHR基因全部编码序列。小香羊GnRHR基因c DNA编码328个氨基酸,利用DNAMAN 4. 0软件对小香羊GnRHR基因分析可知,碱基组成A + T =55. 18% ,C + G = 44. 82% 。
2. 4 GnRHR 基因蛋白二级结构预测
应用在线软件Protparam对GnRHR基因蛋白二级结构进行预测,结果表明,GnRHR二级结构中 α -螺旋占47. 56% ,延伸链占20. 43% ,无规则卷曲占32. 01% ,无 β - 转角( 见293页彩图3) 。
2. 5 GnRHR 基因蛋白的基本理化性质分析
GnRHR基因编码 的蛋白相 对分子质 量为37 708. 6,理论等电点为9. 39。对氨基酸组成进行分析,其中亮氨酸最多有49个( 14. 8% ) ,其次为苯丙氨酸有28个( 8. 5% ) ,丝氨酸24个( 7. 3% ) ; 疏水氨基酸169个,亲水氨基酸159个; 正电荷氨基酸残基数为27个,负电荷氨基酸残基数为15个; 分子式为C1726H2696N432O446S20。
2. 6 编码蛋白结构分析
使用TMHMN在线软件进行跨膜区域预测分析( 见293页彩图4) ,该蛋白属于G蛋白偶联受体家族,具有7次跨膜结构,1 ~ 38构成跨膜蛋白的N末端,39 ~ 58,79 ~ 101,116 ~ 137,158 ~ 180,209 ~ 231,270 ~ 292,307 ~ 326组成7次跨膜域结构,59 ~ 78,138 ~ 157,232 ~ 269组成3个胞内域结构,102 ~115,181 ~ 208,293 ~ 306组成3个胞外域 结构,327 ~ 328构成跨膜蛋白C末端。使用signal P4. 1在线软件进行信号肽预测( 见293页彩图5) ,表明所编码氨基酸不存在信号肽。
3 讨论
基因是细胞内染色体上具有遗传效应的DNA分子片段,真核生物基因组由成千上万个基因组成。目前,已测定人、鸡、大鼠、小鼠、斑马鱼等动物的全基因组,并已分离、鉴定出大量的功能结构基因,一些基因已应用于动物育种[12,13,14]; 但仍有大量的基因未被分离、鉴定。GnRHR基因是G蛋白偶联受体超家族一类重要的功能蛋白,在Gen Bank数据库中,还未见山羊的GnRHR基因序列。彭亮[15]利用RT - PCR和RACG方法,在番鸭上成功得到GnRHR基因的全长c DNA序列,长度为1 690 bp。研究利用绵羊GnRHR基因的mRNA序列设计1对特异性扩增引物,成功克隆出羊 的GnRHR基因序列,其片段大 小为984 bp,进一步说明采用序列的高度同源性设计PCR引物进行基因克隆是可行的。
G蛋白偶联受体是动物体内最大的蛋白质超家族,包括胞外环( ECL) 3个、胞内环( ICL) 3 ~ 4个、跨膜 α 螺旋( TM) 7个以及胞外的N末端和胞内的C末端。7 ~ 595个疏水氨基酸残基组成N末端,12 ~359个疏水氨基酸残基组成C末端,20 ~ 27个疏水氨基酸残基构成一个跨膜区,胞内环和胞外环分别含有5 ~ 230个疏水氨基酸残基不等[16]。试验通过TMHMM在线软件对小香羊GnRHR基因的跨膜螺旋结构进行预测,结果表明,小香羊GnRHR基因编码的蛋白有7个跨膜螺旋区域,其中38个氨基酸的胞外N端和含有1个氨基酸的胞质C端。
糖基化是在酶的控制下,蛋白质或脂质附加上糖类的过程,发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质,和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用,形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要修饰作用,具有调节蛋白质功能作用,如提水合性、高凝胶性、乳化性等,拓宽蛋白质的应用领域和范围[17]。研究表明,小香羊GnRHR没有蛋白糖基化位点。
试验在小香羊上成功克隆出GnRHR基因序列并进行序列分析,为今后开展山羊GnRHR载体构建、基因表达及转基因研究提供了基础资料; 但其理化性质参数、跨膜肽段及结构是否是预测的理论结果还需要进一步试验证实。
cDNA克隆 篇10
1 材料与方法
1.1 试验动物与试剂盒
在怀化学院生命科学系养殖场选择健康的黔邵花猪,屠宰后,分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏、肌肉7个器官/组织,用DEPC灭菌水洗净样品表面残留的血液及污物,立即放入液氮中保存,带回实验室,于-80℃冰箱保存,备用。
RNA提取试剂盒、c DNA合成试剂盒、Taq酶、克隆载体p MD19-T载体、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、菌种JM109、DNA相对分子质量标记、T4 DNA连接酶、荧光定量试剂盒(SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit)及电泳类试剂等,均购自Ta KaRa公司。
1.2 引物的设计
所有引物采用Oligo 6软件设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据NCBI/Gen Bank中登录的人INSIG2基因序列(NM_016133)设计1对猪INSIG2的特异性克隆引物,序列为:上游引物F5'-GCCGGATCCATGGCAGAAGGAGAGACA-3',下游引物R 5'-ACCGAATTCTCATTCTTGATGAGATTT-3'。采用实时荧光定量PCR检测猪INSIG2基因表达水平的引物序列为:上游引物5'-TACCACCGT-GCTGTGGCACGG-3',下游引物5'-GAGAGA-CAACTGTATGTTGT-3'。以GAPHD为参照基因,其特异性引物是根据NCBI/Gen Bank中登录的猪GAPHD基因(NM_001206359)序列设计,序列为:上游引物5'-CACTGACACGTTGGCAGTGG-3',下游引物5'-CATGGAGAAGGCTGGGGCTC-3'。
1.3 RNA的提取与c DNA的合成
猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏、肌肉RNA提取方法按照TRIzol试剂说明书进行,将提取到的总RNA分装,取少量电泳测定其纯度和浓度,检测合格的RNA于-80℃保存,备用。c DNA的合成根据试剂盒说明书进行,反转录产物分离、纯化后置于-20℃保存,备用。
1.4 猪INSIG2基因的克隆与测序
PCR扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性50 s,55℃退火50 s,72℃延伸50 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min。对PCR产物进行回收,连接于p MD19-T载体,并转化JM109感受态细胞,通过蓝白筛选后,挑选白色菌落过夜培养,获得重组子后,用Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,将阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.5 猪INSIG2基因及其蛋白质的生物学特征分析
应用NCBI的ORF Finder分析克隆序列的开放阅读框;用Prot Param预测猪INSIG2蛋白质的分子质量和理论等电点等;用Signal P分析猪INSIG2蛋白质的信号肽;用Prot Scale程序预测猪INSIG2蛋白质的疏水性;用TMHMM分析猪INSIG2蛋白质的跨膜结构;用SOPMA程序和SWISS-MODEL预测猪IN-SIG2蛋白的高级结构;用MEGA 6软件分析猪IN-SIG2与其他物种的亲缘关系。
1.6 猪INSIG2基因组织表达特异性分析
以GAPDH基因为内参,SYBR为荧光染料,采用实时荧光定量PCR检测猪INSIG2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏、肌肉7个器官/组织中的相对表达量。于ABI 7500实时定量PCR仪器上进行检测,其反应体系为:模板c DNA 2μL,2×SYBR Premix Ex TaqTM10μL,上、下游引物(10μmol/L)0.375μL,50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL,加dd H2O(RNase free)至总体积20μL。反应条件为:95℃预变性3 min;95℃变性20 s,60℃复性30 s,共35个循环。每个试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 猪INSIG2基因的PCR扩增结果
猪肝脏总RNA用琼脂糖凝胶电泳检测到28 S、18 S和5.8 S 3条带(图略),OD260/OD280平均值为1.92,表明RNA完整性较好,没有受到蛋白质或DNA的污染,且纯度和浓度适合进行RT-PCR。经特异性引物PCR扩增的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。
由图1可见,DNA片段为1 000 bp左右,与预期片段大小相符,条带清晰且特异性良好,可以切胶回收用于克隆。
2.2 猪INSIG2基因克隆及重组子的鉴定结果
提取质粒并用Bam HⅠ和EcoRⅠ内切酶双酶切鉴定重组质粒,得到1条约3 000 bp的p MD19-T线性片段和约1 000 bp的插入片段(见图2),与预期相符。
2.3 猪INSIG2基因的序列测定结果及分析
将双酶切鉴定正确的阳性重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序,得到1段998 bp的序列。应用NCBI的ORF Finder程序分析克隆序列的开放阅读框,结果表明,INSIG2基因含有1个长度为678 bp的开放阅读框,编码225个氨基酸,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA。见图3。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR产物。
M.DL-5 000 Marker;1.双酶切片段。
2.4 猪INSIG2蛋白的生物信息学分析
2.4.1 猪INSIG2蛋白的理化性质
使用Prot Param程序[6]对猪INSIG2蛋白进行基本理化性质分析,结果表明,蛋白分子质量为24.730 9 ku,理论等电点为8.64;含有20种基本氨基酸,其中含量最高的是Leu(10.7%),含量最低的是His(1.8%),有带负电荷的残基13个,带正电荷的残基17个,分子式为C1135H1758N290O303S13;280 nm的摩尔消光系数为42 440 mol/cm;半衰期为30 h,不稳定系数为35.23,属于稳定蛋白;脂肪系数为103.51,蛋白的平均亲水系数为0.455。利用Signal P 4.1 Server软件[7]分析猪INSIG2所编码的氨基酸序列,发现该序列不含信号肽,属于非分泌蛋白。
2.4.2 猪INSIG2蛋白的亲水性和疏水性分析
运用Expasy服务器中Prot Scale程序对猪INSIG2的亲水性和疏水性进行了分析,见图4。该蛋白存在4个高分值(Score>2)峰,分布在32~47位、83~87位、112~115位和159~165位,而6个低分值(Score<0)峰位于56,101,126,149,179,212位氨基酸附近,其中第37位苯丙氨酸(Phe)疏水性最强(最高分值为3.211),第101位苯丙氨酸(Phe)亲水性最强(最低分值为-2.467)。
2.4.3 猪INSIG2蛋白的跨膜区分析
利用TM-HMM程序对猪INSIG2进行跨膜区分析,见273页彩图5。
由273页彩图5可见:该蛋白有5个跨膜区,即1~26位氨基酸为胞外部分;27~49位氨基酸为第1个跨膜螺旋;50~61氨基酸在胞内;62~84氨基酸为第2个跨膜螺旋;85~130为胞外部分;131~148为第3个跨膜螺旋;149~152为胞内部分;153~175为第4个跨膜螺旋;176~184为胞外部分;185~207为第5个跨膜螺旋;208~225为胞内部分。
2.4.4 猪INSIG2蛋白的高级结构预测
用SOPMA程序[8]预测其二级结构为:α-螺旋占34.67%,β-转角占7.11%,伸展链占19.56%,无规卷曲占38.67%(见274页彩图6)。利用SWISS-MOD-EL[9,10,11,12]对其三级结构进行预测,结果见274页彩图7。
2.4.5 猪INSIG2氨基酸序列的一致性及亲缘关系分析
将本试验推导的猪INSIG2氨基酸序列与NC-BI中收录的东非狒狒(NP_001162382)、人(NP_057217)、小耳大婴猴(ACG64312)、水牛(NP_001277873)、山羊(NP_001272667)、北极狐(AEK31179)、貉(AEK31178)、马铁菊头蝠(ACC62101)、小鼠(EDL39789)、苏门答腊猩猩(CAH92729)、褐家鼠(NP_835192)、中国仓鼠(NP_001231007)、原鸡(NP_001292394)的INSIG2氨基酸序列的一致性分别为99%、99%、98%、98%、97%、98%、97%、97%、96%、99%、95%、94%和92%,表明INSIG2基因编码蛋白与其他物种INSIG2基因编码蛋白具有较高的一致性,说明其在进化过程中具有一定的保守性。应用MEGA6软件进行多序列比对,采用邻位连接法构建系统进化树,见图8。绘制的蛋白进化树显示,猪与苏门答腊猩猩和东非狒狒的亲缘关系最近,与人和小耳大婴猴的亲缘关系次之,而与非哺乳动物原鸡的亲缘关系相对较远。
2.5 INSIG2基因在猪7个器官/组织的差异表达结果
采用GAPDH作为参照基因,SYBR为荧光染料,采用荧光定量PCR方法分别检测了INSIG2在猪不同组织中的表达情况,包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏和肌肉共7个器官/组织,结果表明,INSIG2基因在肺脏中的表达量最高,其次为肝脏,再次为胃,心脏和肌肉中表达量最低(见274页彩图9)。
3 讨论
INSIG2是内质网上的一种膜蛋白,它在胆固醇合成过程中与SCAP/SREBP复合物结合,阻止SCAP将SREBP运送至高尔基体进行蛋白酶解加工,从而阻断胆固醇的合成[4,13,14]。Y.Jo等[15]和A.D.Nguyen等[16]的研究表明,INSIG2还能促进胆固醇合成当中的还原酶HMG-Co A快速降解从而抑制胆固醇合成。而在酵母中,INSIG2蛋白直接与固醇敏感结构域SSD的跨膜区域结合,抑制酵母HMG-Co A还原酶活性[17,18]。
人INSIG2蛋白包括225个氨基酸[4],通过6个跨膜螺旋锚定在内质网膜上[19,20],而西农萨能羊INSIG2蛋白仅有5个跨膜螺旋[21]。本研究克隆得到的猪INSIG2基因编码区序列具有特定的起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA),是猪INSIG2基因编码区全长序列,含有678 bp的开放阅读框,编码225个氨基酸。猪INSIG2蛋白跨膜结构分析结果表明,猪INSIG2蛋白与西农萨能羊一样只有5个跨膜区,比人INSIG2蛋白少了1个跨膜区。根据氨基酸分值越低亲水性越强、分值越高疏水性越强的规律可知,IN-SIG2蛋白整体疏水性较强。
将克隆序列与NCBI收录的其他物种INSIG2的序列进行一致性对比分析发现,猪INSIG2基因的CDS区与其他物种间存在高度一致性,将猪INSIG2基因编码的氨基酸序列与其他物种相比,一致性均在92%以上,与东非狒狒、人、苏门答腊猩猩的氨基酸一致性很高,与原鸡的一致性较差。通过构建系统进化树发现猪与苏门答腊猩猩的亲缘关系最近,与原鸡的亲缘关系最远。
有研究表明,INSIG2在人体气管、胸腺、食道等17个组织中均有表达,其中脂肪组织中的表达量居中[22]。西农萨能羊INSIG2基因在被检测的小肠、乳腺及肾脏等10个组织/器官中也均有表达,但表达水平差异很大,在肺脏中的表达量最高,心脏中的表达量最低[21]。H.Qiu等[23]发现INSIG2基因在猪的心脏、脑、脾脏等10个器官均有表达,并将其定位于猪染色体的15q14-15区域。本研究检测到INSIG2在猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏和肌肉7个器官/组织均有表达,且在肺脏中的表达量最高,在肝脏、心脏和肌肉中表达量较低,此结果与西农萨能羊INSIG2基因差异表达结果类似,这可能与其在动物生命活动中所发挥的作用有关。
4 结论
