抑菌机理

关键词：

抑菌机理（精选三篇）

抑菌机理 篇1

1 开发具有抑菌特性的鱼源乳酸菌的重要意义

在鱼类养殖过程中大多依靠抗菌药物来预防和治疗细菌性疾病, 然而此类药物的大量使用所带来的负面效应十分突显。首先, 抗菌药易引发动物源细菌产生耐药性, 随即耐药谱迅速增宽, 对日后兽医临床诊断和治疗造成威胁。其次, 抗菌药在对病原菌起抑制作用的同时也对机体内的正常菌群的优势菌发挥作用, 不仅打破鱼肠道内微生态的平衡, 更使得一些潜伏的条件致病菌大肆繁殖造成内源性感染。

鱼类肠道有益菌要求定植于肠道黏膜的同时还能抑制肠道病原菌的生长, 肠道内的细菌可分为固有菌群和非固有菌群, 定植能力强的益生菌以从肠道固有菌群中筛选出的为佳。益生菌在动物体内外的作用对水产的养殖有深远的影响。水产养殖在益生菌的利用方面选择多样, 既可以直接添加在水产品的饵料中, 也可以投放到养殖的载体如水体中。无论是动物直接食用进入体内还是通过生长环境的控制, 都可以使得益生菌产生作用, 帮助水产养殖获得效益。

随着淡水养殖向着集约化和规模化的方向逐步发展, 应激因子增多, 鱼类养殖也出现了生存环境恶化等问题, 鱼类抵抗力逐渐下降。研究表明嗜酸乳杆菌可抑制人工养殖的吉富罗非鱼 (Oreochromis Niloticus) 肠道的大肠杆菌生长, 降低肠道细菌总数。在饲料中添加乳酸菌能有效提高吉富罗非鱼粗蛋白和粗脂肪的含量, 改善鱼肉的营养组分。

2 不同生境下的鱼源乳酸菌抑菌特性研究

海鱼生长力旺盛, 是一种营养丰富肉质鲜美的食品, 在全球拥有坚实的发展基础和广阔的市场需求。面对海鱼市场的迅猛发展, 不能只依靠化学药物来解决细菌性疾病带来的损失, 更需要一种来自海鱼的原籍菌群来取代化学药物。目前已从多种海鱼中分离出具有抑菌效果的乳酸菌应用于海鱼养殖。从斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides) 肠道中提取的乳酸菌能够耐受模拟人体胃酸、温度和肠道胆盐浓度, 并具备较强的繁殖能力, 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用, 产生了过氧化氢和细菌素类抑菌物质。在海鱼养殖中, 可以加入针对性的乳酸菌来改善胃肠道微生态环境, 根据其抑菌机理采用一定措施来调控抑菌效果。BYUN等在牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 的饲料中投放乳酸杆菌, 一个月后的增重率和特定生长率明显提高。SUZER等在黑鲷 (Sparus macrocephalus) 的仔鱼发育阶段中, 在仔鱼的活饵料或者水体中添加乳酸菌能提高仔鱼的生长性能。野生鱼类肠道乳酸菌能够反映河流湖泊的生态环境, 因此野生鱼肠道的菌组成十分复杂, 结构不尽相同。肠道菌群的控制直接影响不同水域鱼类的消化吸收, 减少肠道细菌疾病, 有利于优质鱼的捕捞。侯进慧等从鲫鱼体内分离出细菌菌株分泌淀粉酶和纤维素霉菌, 由此展开微生态制剂共生菌或载体疫苗的构想。从新疆冷水鱼肠道提取出耐低温的乳酸菌在4~37℃条件下均能正常生长繁殖, 且产生的细菌素在低温和高温下的抑菌性都不会被抑制。应用低温乳酸菌为气候条件剧烈变化下的野生鱼的生长繁殖提供了保障, 也可以在低温肉品的保藏中发挥巨大作用。关于养殖鱼类肠道菌群组成的研究在国内起步较晚。淡水养殖的特定操作, 如清洁、消毒或突然投放饲料, 容易破坏环境中微生物群落的稳定。鱼从幼苗就在外界环境中, 肠胃道系统还未发育完全, 受微生物影响极大, 因此淡水鱼肠道微生物的菌落结构和功能方面的研究需要学者加大重视。目前淡水鱼的研究主要集中在鲶鱼、鲤鱼、草鱼、鲫鱼等的肠道内容物好氧菌、兼性厌氧菌方面的研究。周玉法等就山东省平湖常见鱼肠道内菌群进行了研究, 单晓枫等从鲤鱼肠黏膜上分离的乳酸菌菌株, 通过药敏试验证明对部分抗生素具有耐药性, 对鲤鱼和小鼠无害。

3 乳酸菌的抑菌机理研究

运用乳酸菌发酵可以增加食品的风味、延长食品的保藏期, 提高食品的营养价值和安全性。乳酸菌在食品中利用碳水化合物发生一系列的生化化学变化, 除了产生酒精、二氧化碳、乳酸、乙酸、过氧化氢等以酸性物质为主的化合物, 还产生抑制生物活性的抑菌素, 抑制其它有害菌的生长。

3.1 乳酸菌代谢物

乳酸菌的中间代谢产物和终级代谢产物中, 均有酸性物质抑制其他细菌的生长, 这些物质如乳酸、乙酸、叶酸等, 降低了环境中的pH值, 抑制有害微生物的生长代谢。CHERRINGTON等认为离解的酸亦可影响细胞膜的稳定性和传递功能。YUSOF在婴儿食品中添加了乳酸乳球菌产生的酸性物质和大肠杆菌来研究该酸性物质对大肠杆菌的抑制效果。李兴峰等指出乳酸菌的产物苯乳酸抑菌谱广, 抑菌过程中主要通过破坏细胞壁来作用于其它细菌。乳酸菌通过发酵产生的CO2对霉菌和革兰氏阴性菌都有一定的抑制作用, 其机理是CO2形成了隔氧厌氧环境, 造成了一些需氧微生物无法生长代谢, 其次CO2还会引起细胞酶活力减弱和细胞pH值下降, 削弱细胞膜的传递作用。乳酸菌代谢的过氧化氢中的羟基分子和其衍生物可以直接作用于细菌外层结构膜, 破坏细菌的通透性屏障, 细菌体内外物质不平衡而致死。过氧化氢的羟基基团不仅可以和蛋白质、核酸等生物大分子物质反应, 影响细菌的生理结构和遗传物质, 还会进入细菌细胞膜内作用细菌DNA链中的磷酸二酯键并使其断裂。此外, 过氧化氢的分解产物还会与酶链蛋白反应, 抑制酶的功能。

3.2 乳酸菌素

乳酸菌素是由乳酸菌产生的具有抑菌作用的多肽或蛋白质, 具有高等电点和亲水特性, 大部分乳酸菌素对近缘关系的细菌有抑制作用且热稳定性较高, 早在1926年就发现一些乳链球菌产生的代谢产物即Nisin乳链菌肽可抑制其他乳酸菌的生长, 近20年来, 世界范围的食物源性李斯特菌病不断发生, 而Ⅱ类乳酸菌素尤其是Ⅱa类可有效抑制单核增生李斯特菌。吴桂荣利用微量二倍稀释法证明了乳酸菌素在体外的抑菌作用, 并得出乳酸菌素本身就有抑菌作用, 且对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于对革兰氏阴性菌的效果。乳酸菌素在乳制品、肉制品和啤酒饮料等食品中的应用十分广泛, 而且在医药方面也用于改善肠道功能、提高免疫力和治疗妇科疾病。

3.3 菌与菌的相互作用

肠道菌群系统十分复杂, 乳酸菌的抑菌性是否得益于其他菌群的辅助值得研究。中国农业大学就西藏牦牛发酵乳酸菌及酵母菌的相互作用做了研究, 证实了乳酸菌和酵母菌之间可能存在相互作用以共同影响产品的品质。在对开菲尔乳研究结果研究中发现, 酵母菌能提供氨基酸、维生素等其他化合物作为生长因子促进乳酸菌生长。GADAGA等对津巴布韦传统发酵乳的研究发现乳酸菌同时培育酵母菌乳酸菌活菌数比较稳定。因此在乳酸菌微生态制剂的开发时, 适量非乳酸菌菌群如酵母菌的添加能够使乳酸菌的抑菌作用最优化。

3.4 乳酸菌对病原菌的定植抗力作用

肠道乳酸菌对机体免疫调节的作用还体现在对病原微原菌的定植拮抗方面。定植能力表示条件致病菌在肠道中生存繁殖的数量和能力, 乳酸菌通过一系列的生理生化作用阻碍微生物的定植能力, 称为乳酸菌的定植抗力。首先乳酸菌会产生胞外物质, 隔离病原菌和胃肠道黏膜的接触;分泌抗菌代谢物, 发生凝集反应, 抑制病原菌生长, 杀死病原菌;竞争病原菌在肠道内的黏附位点和营养物质。乳酸菌自身的定植能力强, 对定植抗力有一定协助效果。关于乳酸菌黏附的研究在陆生动物中开展的较多, 而在水产动物中的研究却刚刚起步, 特别是乳酸菌在鱼体黏附定植及抗菌机理的基础研究还有待进一步深入。

4 展望

抗菌药物的泛滥已经对人体和生态系统的稳定造成负面的影响, 来自鱼类肠道的乳酸菌, 其抑菌作用和抑菌机理已经得到了科学研究的初步认证, 乳酸菌作为一种新型的益生素必定会得到广泛的认可和支持。鱼类生长的水质条件等千差万别, 海鱼的养殖在集约化的管理下力求得到产量的最大化;湖泊河流中的野生鱼受气候条件、当地固有微生物环境等影响较大;池塘人工养殖的清洁、投放饲料等操作决定了鱼类生存环境的变化多样。如何针对环境的特点开发保护鱼群免受有害微生物侵扰、提高鱼肉品质的乳酸菌微生态制剂具有较大的研究价值。乳酸菌的应用方式也是多种多样的, 目前以添加到饲料中喂养鱼群和投放到水体中两种应用最为广泛。

在实际应用中, 选择和使用乳酸菌的技术并不成熟, 乳酸菌微生态制剂的抑菌效果并不稳定。这说明我国乳酸菌抑菌的特性和机理的掌握和运用还处于理论阶段, 还需进一步开发微生态制剂应用于实际生产。要充分考虑鱼类消化道的结构和微生物组成、乳酸菌作用时辅助因子的调控以及该制剂对生态和人体的影响等方面, 才能开发出适用于生产的绿色高效鱼用益生菌制剂, 促进我国水产养殖业的发展。

摘要：鱼类肠道中具有抑菌效果的乳酸菌, 对增强鱼类免疫和促进生长具有重要的作用。对于海鱼、河流野生鱼、池塘养殖鱼肠道中乳酸菌的抑菌特性研究表明, 乳酸菌通过产生的酸性物质、肽类乳酸菌素 (II类) 、二氧化碳和过氧化氢等各类代谢产物, 来抑制一些腐败菌或致病菌, 并与其他菌群相互作用降低病原菌的定植抗力以达到抑菌作用。

抑菌机理 篇2

关键词：苦参；抑菌活性；作用机理；黄酮类化合物；病原真菌

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0170-03

收稿日期：2015-03-21

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303025）。

作者简介：韩宝艳（1987—），女，硕士研究生，研究方向为生物农药。E-mail：dongfangyuling@163.com。

通信作者：纪明山，博士，教授，主要从事农药毒理学研究。E-mail：jimingshan@163.com。苦参（Sophora flavescens）别称山槐子，为豆科槐属植物。苦参提取液的化学成分主要为生物碱、黄酮2大类[1]。近年来国内外研究苦参的重点在于生物碱，对黄酮类成分的研究较少。随着分离技术不断提高，进一步发现了苦参中黄酮类的多种药理活性，引起了广泛重视和兴趣[2]。贾利元等在研究苦参提取物对茄子黄萎病菌的化感效应时发现，苦参生物碱处理的抑菌率均低于同浓度黄酮类化合物处理的抑菌率[3]。李巍等研究苦参黄酮抗滴虫和抗菌等作用机制和构效关系时，分离出5 - 甲氧基-7，2′，4′ - 三羟基- 8 - 异戊烯基二氢黄酮和3β，7，4′ - 三羟基-5 - 甲氧基-8 - 异戊烯基二氢黄酮2个新化合物[4]。截至2014年，已从苦参中分离出108个黄酮类化合物[5]。黄酮类化合物是多酚类植物的次级代谢产物，具有许多潜在的药用价值和生物活性，其中抑菌活性是研究热点之一[6]。郑永权等以生物活性追踪试验为指导，从苦参提取物中分离出2个主要杀虫抑菌活性化合物苦参酮和槐属二氢黄酮G[7]。Kuroyanagi从苦参中分离出23种化合物，12种为新分离出的化合物，其中8种为异戊烯黄烷酮类，这些化合物都显示出明显的抗菌作用[8]。国内外对苦参黄酮类化合物抑菌作用的研究集中在抗菌能力测定，有关作用机理的研究甚少。本研究采用硅胶柱色谱法、HPLC、质谱、核磁共振对苦参黄酮类中抑菌活性成分进行分离鉴定，通过菌丝生长速率法检测其对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium ）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抑菌效果，并对该活性成分的作用机理进行初步研究，以期为后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1供试植物样品

苦参，自然晒干，用粉碎机粉碎备用。

1.2供试菌

番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌由沈阳农业大学农药学实验室提供。

1.3试剂

95%乙醇溶液、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等均为分析纯。

1.4活性成分的提取与分离

将苦参粉碎物分别与95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等按1 g ∶10 mL比例混合，静置1 h，超声频率为90 kHz，经超聲波清洗器振荡提取1 h。浸提后过滤留滤液，弃去废渣，并用旋转蒸发仪浓缩至浸膏[9-10]，分别进行生物活性测定。

选择苦参抑菌活性较强的乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，以体积比1 ∶10的甲醇-氯仿混合溶剂和体积比1 ∶15的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂依次进行等梯度洗脱，等体积（50 mL）收集馏分，经薄层层析检测，将相同斑点合并，最终获得2个馏分[11]。

经过抑菌活性测定，选择抑菌活性较强的馏分，采用反相制备HPLC（C18柱，5 μm，10 mm×250 mm；甲醇-水（体积比6 ∶4）等梯度洗脱，流速3 mL/min，柱温30 ℃，波长297 nm，采集时间1 h，进一步纯化，获得到化合物A。

3结论与讨论

在制备供试品时，本研究考察了不同溶剂（95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚） 超声提取方法，结果发现乙酸乙酯超声提取法获得的物质对番茄灰霉病菌的抑制作用最强。对粗提物进一步分离纯化，获得了苦参新醇X，查阅文献发现，Kuroyanagi等在1999年将苦参新醇X作为一种新化合物从苦参中分离出来[8]。

黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，不仅数量、种类繁多，而且结构类型复杂多样[16]。黄酮类化合物是苦参主要成分之一。本研究分离鉴定出的苦参新醇X即二氢黄酮醇（黄烷酮醇），已有研究表明，该物质对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等细菌有较强的抑制作用。本研究表明，该物质对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌均有抑制作用。在200 mg/L处理下，其对水稻稻瘟病菌的抑制作用最高，抑制率达83.13%。本研究对其作用方式进行初步探讨，发现该物质虽然可以抑制这3种病原真菌的菌丝生长，但并未将菌丝杀死，一旦抑制作用解除，菌丝就恢复生长能力。苦参新醇X不仅对这3种病原真菌的菌丝起到抑制作用，对其孢子产生也具有强烈抑制作用，200 mg/L下产孢抑制率均在80%以上。本研究仅针对苦参黄酮类化合物进行了初步抑菌试验及抑菌机理研究。苦参黄酮类化合物是否能够抑制病原真菌内部酶的活性，以及对病原真菌的能量代谢和物质代谢有何种影响，还须进一步研究。

nlc202309040406

抗菌试验使用的大多是粗提物，成分复杂，对黄酮单体的抑菌活性研究较少[6]。而且单体结构复杂，作用机理不明确，抗菌研究不深入。这些都是应用过程中必须解决的问题。

参考文献：

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抑菌机理 篇3

本研究采用体外抑菌法考察了不同分子量壳聚糖对阳性菌金黄色葡萄球菌的抑制作用;通过测定壳聚糖作用前后菌液中内酶碱性磷酸酶、β-糖苷酶活性和核酸、蛋白质含量、结合透射电子显微镜和激光共聚焦荧光显微镜,探讨了壳聚糖对St.aureus的作用位点,以初步揭示了壳聚糖对细菌作用的机理。该研究还鲜未报道,为壳聚糖的临床应用提供更加充分的实验依据。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

平均分子量3000,5万,14万,20万,100万的壳聚糖(浙江玉环壳聚糖有限公司,DD.98%),用1.0%的HAc溶解;荧光素异硫氰酸酯(简写FITC,美国Sigma公司),金黄色葡萄球菌(St.aureus,ATCC 26113),由天水中医院提供。

紫外可见分光光度计(UV-9200型,北京瑞利分析仪器公司);JEM-1230透射电子显微镜(JEM 3120);激光共焦荧光显微镜(Model:TSC-NT 165123,US)。

1.2 体外抑菌实验

将St.aureus标准菌株接种于固体琼脂培养基,37℃活化24h。挑取一环活化后的St.aureus接种于已经灭菌的液体培养基中,37℃摇床培养24 h,吸取15 mL和4 mL浓度为5.0mg/mL壳聚糖溶液混合,37℃下摇床振荡培养,测定不同时间内的OD610 nm值。以4mL1.0%HAc溶液为空白对照。光密度越小,其壳聚糖的抑菌性能越强。

1.3 细胞内容物的泄露

壳聚糖溶液和St.aureus菌悬液混合,使得壳聚糖最终浓度分别为0.05%、0.1%、0.25%(W/V),37℃摇床培养,于不同时间测定菌悬液中的碱性磷酸酶和β-糖苷酶活性。根据文献报道测定碱性磷酸酶活性[10]。以邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作为底物,壳聚糖作用后的St,aureus菌悬液和150μL浓度为30mM ONPG丙酮溶液混合,测定不同培养时间的OD420nm。

壳聚糖溶液和St.aureus菌悬液1:1(v/v)混合,使壳聚糖的最终浓度为0.1%(w/v),37℃摇床培养,以1.0%HAc作为空白对照,测定不同培养时间的OD260nm和OD280nm。

1.4 透射电子显微镜

吸取浓度为108菌落/mL的St.aureus菌悬液500μL,加入到壳聚糖溶液中,使壳聚糖最终浓度为0.1%,置于1.5 mL锥形离心管中摇床(120 r/min)37℃培养24h。离心取细菌沉渣,加入3%戊二醛4℃固定5h后,用5 mmol/L PBS缓冲液漂洗3次,每次10 min,再用1%的OsO4 4℃固定1 h,接着再用5mmol/L PBS漂洗3次。依次用系列乙醇(70,80,90,100%)4℃下脱水各10 min,再用纯丙酮脱水2次,每次10 min。加入纯丙酮与Epon 812(1:1)室温下放置3h后,用Epon812包埋剂包埋,在35℃、45℃、65℃下分别聚合4h、12h、24h。超薄切片,醋酸双氧铀、枸椽酸铅双染色,在JEM-1230透射电镜下观察。

1.5 激光共聚焦荧光显微镜

1.5.1 FITC标记的壳聚糖的制备

将壳聚糖溶解在1.0%的醋酸溶液中,磁力搅拌器上剧烈搅动,用0.2mol/L的NaOH将其pH值调至6.8,形成絮状沉淀。将无水甲醇溶解的浓度为2.0 mg/mL的FITC (w/v)缓缓加入壳聚糖的絮状沉淀中,冰点下避光搅拌24h后,将絮状沉淀在12,000g下离心10 min,用70%的甲醇反复冲洗、离心,直至上清液在480 nm下无吸收。将FITC-壳聚糖齐聚物离心沉淀,用乙醇漂洗晾干,得FITC标记物。

1.5.2 激光共聚焦显微镜观察

将FITC-壳聚糖溶于培养基中,调节pH至7.0左右,加St.aureus培养液后在摇床上振荡培养24h,培养到FITC-壳聚糖齐聚物上的St.aureus用离心机收集,用生理盐水漂洗。漂洗后的St.aureus用生理盐水配成菌悬液,滴在无荧光玻片上(玻片经质量分数50%的含叠氮化钠、甘油水溶液处理后再用),最后用激光共焦显微镜观察荧光现象。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖分子量对其抑菌性能的影响

图1为不同分子量壳聚糖作用St.aureus的OD610 nm。可以看出,分子量是影响壳聚糖对St.aureus抑制作用的重要因素。壳聚糖作用St.aureus后,对应的光密度值均小于对照组,表明壳聚糖对St.aureus具有较好的抑菌性能,并且其抑菌性能与其分子量有关。尤其是分子量为50kDa的壳聚糖作用后,对应的OD610 mm值最小,且随着作用时间的延长这种趋势比较稳定。因此,选用分子量为501kDa的壳聚糖,研究其对St.aureus的抑菌机理。

由图2可看出,含壳聚糖样品组的菌体的生长要比不含壳聚对照组慢,且随着壳聚糖脱乙酰度的增高,其对菌体生长抑制作用更强。随着脱乙酰度的逐渐增大,壳聚糖的抑菌能力增强,说明脱乙酰度对壳聚糖的抑菌性能有影响。这是因为壳聚糖的脱乙酰化,实际上是其分子链上亲脂性基团NHCOCH3逐渐被亲水基团NH2取代的过程。在酸性条件下,-NH2易与H+结合形成NH3+随着脱乙酰度的逐渐增大,NH3+增多,对于细菌(带负电荷)的静电引力增强,更多的细菌被絮凝、聚沉,其生长繁殖也随之减慢。这也说明壳聚糖的抗菌活性与其-NH2有关,-NH2是壳聚糖的消毒因子。

2.3 pH值的影响

pH值对壳聚糖抑菌率影响如图3所示。当pH=6.5时,抑菌率最大,随着体系pH值的降低,壳聚糖对St.aureus的抗菌活性逐渐增强,这是由于壳聚糖的等电点为pKa=6.3,pH<6.3时,-NH2与H+结合以NH3+形式存在,显示较好的抑菌效果;pH>6.3时,壳聚糖开始在溶液中沉淀,NH3+数量减少抑菌效果下降。另外,有机酸也能抑制微生物的酶和代谢活性,当加入壳聚糖后,其抑制作用表现为二者的合力。

2.4 细胞内容物的泄露

细胞壁的功能之一就是保持细胞内物质在菌体内不泄露至菌体外,因此,菌液中细胞内酶活可以作为表征细胞壁功能是否完好的一个参数。碱性磷酸酶存在于细胞膜和细胞壁间隙中,β-半乳糖苷酶存在于细胞膜的内部,而核酸存在于质膜内部,正常情况下它们不会分泌到细胞外部。但当细胞膜遭到破坏后,细胞膜通透性增加,碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和核酸将泄漏到细胞外部,通过检测细胞外两种酶的活性、核酸的含量及释放的顺序,即可反映细胞壁和细胞膜的通透性变化以及壳聚糖的抑菌途径[11]

碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶活性如图4所示。可以看出,与壳聚糖作用后菌液中碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶活性远高于对照组,随着反应时间的延长,酶的活性呈增加趋势,分别在30min和60min后趋于稳定,提示碱性磷酸酶首先释放,而后是β-半乳糖苷酶的泄漏。结果表明壳聚糖的抑菌机理并非只与细胞壁作用,同时还进而会影响细胞膜磷脂双层结构,改变了细胞膜渗透性,进而细胞内容物会泄露出来。

通过测定260 nm和280nm吸收值的变化,反映从细胞质中释放出DNA、mRNA和蛋白质含量的变化,可以推测细胞膜的完整性变化。如图5是壳聚糖与st.aureus作用不同时间的OD260nm和OD280nm。壳聚糖作用St.aureus后,OD260nm和OD280nm均大于对照组,说明从细胞质中释放出DNA、mRNA和蛋白质。随着时间的延长,OD260nm和OD280nm不同程度的减小,可能是壳聚糖使释放出的DNA、mRNA和蛋白质变性所致。

2.5 透射电镜(TEM)

壳聚糖作用金黄色葡萄球菌的透射电镜如图6所示。对照菌体细菌切面多呈葡萄球状,细胞壁、细胞膜完整,表面光滑,细胞质与细胞膜界限明显。壳聚糖处理过的菌体细菌形态发生变化,细胞膜变厚,细胞质与细胞膜的界限变得模糊,外围有液体溢出的痕迹,还可见缺乏任何细胞内结构的细菌碎片。

2.6 FITC-标记壳聚糖与受试细菌的作用

图7 (a)是壳聚糖对St.aureus作用30min的细胞剖面图。可以看到围成了一个荧光圈,表明壳聚糖无法进入到St.aureus细胞内部;图7 (b)是对St.aureus作用24h的细胞剖面图,可以看出有很多具有荧光的碎片,围成了轮廓呈不规则,表明壳聚糖完全杀死了菌体,使整个菌体结构瓦解。

3.1 体外抑菌法研究了不同分子量的壳聚糖对St.aureus的抑制作用。

结果表明壳聚糖具有较好的抑菌性能,并且随着壳聚糖分子量的不同而有所不同,其中分子量为50kDa的壳聚糖对St.aureus的抑菌活性最强。

3.2 细胞膜是壳聚糖对St.aureus作用位点。

壳聚糖改变了St.aureus细胞膜的渗透性,使得细胞内容物依次发生泄露;壳聚糖作用后的St.aureus形态发生变化,细胞膜变厚,细胞质与细胞膜的界限变得模糊,外围有液体溢出的痕迹,还可见缺乏任何细胞内结构的细菌碎片。

摘要：体外抑菌法研究了壳聚糖分子量、脱乙酰度以及pH值对金黄色葡萄球菌(St.aureus)抑制作用的影响。通过测定壳聚糖作用前后菌液中碱性磷酸酶、β-糖苷酶活性和核酸、蛋白质含量,研究了细胞内容物的泄露以及细胞膜完整性;运用透射电子显微镜和激光共聚焦荧光显微镜从超微结构探讨了壳聚糖对St.aureus的作用位点。结果发现细胞膜是壳聚糖对St.aureus作用的位点,壳聚糖改变了细胞膜的渗透性而使细胞膜破坏,伴随大量细胞内容物泄露。

关键词：壳聚糖,抑菌,超微结构,细胞膜

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