磷酸酯酶

关键词： 工艺

磷酸酯酶（精选十篇）

磷酸酯酶 篇1

比较两种复合磷酸酯酶制备工艺, 选择最佳提取工艺。

1 仪器

变速胶体磨, 浸泡槽, 离心机, 真空干燥箱

2 工艺1

工艺2

3 酶活测定法

取试管2支, 分别精密加入核糖核酸溶液[取核糖核酸 (含量80%以上) 1.0g, 加水30ml, 摇匀, 用氢氧化钠试液调节p H值至7.0~7.2, 再加水稀释至50ml]3ml、三羟甲基氨基甲烷缓冲液[取三羟甲基氨基甲烷1.2g, 加水50ml溶解后, 用0.1mol/L的盐酸溶液 (约85ml) 调节pH值至7.0~7.2, 加水稀释至200ml]1.5ml、0.01mol/L的氯化锌溶液0.5ml, 在70℃水浴中保温5分钟, 分别精密加入供试品溶液1ml, 摇匀, 置70℃水浴中准确反应30分钟, 再精密加入高氯酸钼酸铵试液, (取钼酸铵0.25g, 加70%~72%高氯酸3.5ml及水适量使溶解, 用水稀释至100ml) 5ml, 摇匀, 立即置冰浴中冷却15分钟, 滤过, 取续滤液2ml置100ml量瓶中, 加水稀释至刻度, 照紫外—可见分光光度法, 在260nm的波长处以水为参比测定吸收度A, 以水1ml代替供试品溶液, 同法操作, 测定吸收度A0按下式计算:

式中:W—供试品取样量, mg。

在上述条件下每分钟生成的产物, 在260nm的波长处使吸收度改变0.001为1个活力单位。

4 结果比较

每次以100g麦根为原料, 按照工艺1方法5次提取试验, 结果见表1:

每次以100g麦根为原料, 按照工艺2方法5次提取试验, 结果见表2。

研究表明, 工艺2制备的复合磷酸酯酶, 酶活及产酶量明显提高。

摘要：复合磷酸酯酶是多种酶的混合物, 含有多种生物活性物质。通过对两种复合磷酸酯酶提取工艺进行研究, 确定最佳提取工艺。

关键词：麦根,复合磷酸酯酶,酶活,产酶量

参考文献

[1]张宇红, 王学东.复合磷酸酯酶提取工艺的研究[J].山东医药工业, 2000, 19 (3) :2-4.

抗胆碱酯酶药物和胆碱酯酶复活药 篇2

b 兴奋膀胱平滑肌

c 缩小瞳孔

d 兴奋骨骼肌

e 增加腺体分泌d 2.新斯的明的药理作用是a 激活胆碱酯酶

b 激动m受体

c 抑制胆碱酯酶

d 阻断m受体

e 激动n受体c 3.有机磷农药中毒的机制是a 抑制磷酸二酯酶

b 抑制单胺氧化酶

c 抑制胆碱酯酶

d 抑制腺苷酸环化酶

e 直接激动胆碱受体c 4.下列哪个药物属于胆碱酯酶复活药a 新斯的明

b 氯磷定

c 毒扁豆碱

d 安贝氯铵

e 阿托品b 5.敌百虫口服中毒不能用下列哪种溶液洗胃a 高锰酸钾溶液

b 生理盐水

c 饮用水

d 碳酸氢钠溶液

e 醋酸溶液d 6.有机磷酸酯类中毒症状中，不属于m样症状的是a 瞳孔缩小

b 流涎流泪

c 腹痛腹泻

d 小便失禁

e 肌肉震颤e 7.男25岁，有机磷农药中毒后，经碘解磷定和阿托品治疗后，病人出现颜面潮红，脉搏加快，烦躁不安，瞳孔散大，对此应采取哪项措施a 立即停用阿托品

b 立即停用碘解磷定

c 加大阿托品的用量

d 加大碘解磷定用量

单纯胆碱酯酶降低1例报告 篇3

患者，男,55岁,因急性一氧化碳中毒,于2005年2月27日入住我院职业病科。肝功能检查:总蛋白72g/L,白蛋白36g/L,谷丙转氨酶34U/L,谷草轉氨酶46U/L ,碱性磷酸酶55U/L,γ谷氨酰转肽酶24 U/L, CHE 56U/L,隔日CHE结果58U/L，总胆红素12.0μmol/L,直接胆红素2.6μmol/L;乙肝6项全部阴性; HAV、HCV抗体阴性;AFP阴性。凝血：PT 11.3S，INR 73.6%，APTT 25.38S。尿常规检查正常。肝、胆、胰、脾彩超均未见异常。

讨 论

磷酸酯酶 篇4

1 低磷酸酯酶症的发病机制

正常情况下, 软骨和骨组织中富含碱性磷酸酶 (ALP) , 它可水解体内天然底物, 使磷酸根离子释放到软骨液和骨组织中, 与钙结合形成羟基磷灰石, 从而促进骨骼的矿化和牙齿发育[5]。而低磷酸酯酶症患者编码组织非特异碱性磷酸酶 (TNSALP) 的基因发生突变, 造成TNSALP功能异常, 从而使钙、磷向硬组织中的沉积减少[4]。

编码人类TNSALP的基因为ALPL (ALPL-liver) , 位于1p36, 包含12个外显子, 长度超过50kb[5]。该基因片段已报道的明确的致病突变至少有210种, 而基因多态性致病 (polymorphism) 至少有12种[6], 据统计[7], 基因突变类型中79%为错义突变, 10%为部分缺失, 3%为无义突变、4%为剪接位点突变以及少部分其他复杂类型的突变。

2 低磷酸酯酶症的分型及其临床表现

2.1 分型及临床特点

低磷酸酯酶症按照最早出现症状的年龄及临床和放射学检查表现分为围产期型、 婴儿型、 儿童型和成人型、牙型等几大类。

2.1.1 围产期致命型

是低磷酸酯酶症最严重的类型, 其首发症状出现在宫内或生后几天内, 有些婴儿几乎无骨形成, 多在产前或出生后几天即死亡。出生后可出现颅骨软化, 四肢短粗畸形, 易因胸廓无力和呼吸困难导致死亡。放射学检查对该型有诊断价值, 表现为几乎完全性的骨骼矿化低下、干骺端不规则的透光区延伸等[5]。

2.1.2 围产期良性型[6]:

该型在胎儿期可有明显的长骨弯曲畸形, 但没有重型的骨骼矿化缺陷的表现, 肢体的畸形在孕31+5周后可有显著减轻。出生后也可发生多处肢体畸形, 但不发生骨折, 骨骼的矿化和成骨正常, 骨骼畸形可自然痊愈, 因而被认为是良性的[5]。

2.1.3 婴儿型

其骨骼形成不良也是致命的, 严重性稍低于围产期型, 多在出生后6个月内发病。患儿表现为厌食、生长障碍, 亦可出现漏斗胸等佝偻病样表现及肺炎, 还可有眼部病变, 包括:青色巩膜、花斑眼眶和病理性睑退缩等。颅骨可观察到宽囟门和宽颅缝等现象, 在小颅畸形患儿身上可见囟门消失现象[8]。

2.1.4 儿童型

可表现为佝偻病:漏斗胸、前囟闭合延迟、骨软化、骨痛及应力性骨折, 身材矮小, 步履不稳等;也可由于牙骨质部分形成不全或无牙骨质, 导致不能形成牙周膜而引起牙齿早失[8,9], 因此常最先被口腔科医生诊断。用组织学的方法检查未发育成熟而松动的乳牙是一个重要的诊断手段。

2.1.5 成人型

可有足部疼痛、跖骨的应力性骨折等[6], 颅缝的过早融合, 可导致颅内压增高性突眼和脑损伤。关节内的焦磷酸钙沉积可导致软骨钙质沉着病或焦磷酸钙沉积 (或假痛风) [8]。未发育成熟的上下前牙脱落, 有乳牙早失病史。在未发育成熟而脱落的牙上, 可观察到釉质发育不全[8]。

2.1.6 牙型

该型患者可仅有牙骨质发育不全、牙齿早失等口腔表现, 血清碱性磷酸酶水平也仅有轻度降低[10]。

除上述分型外, 1969年, SCRIVER还首先报道了假低磷酸酯酶型, 这种类型很罕见, 其机制尚不清楚, 该型患者有类似于婴儿型的临床及放射学表现, 但不伴有典型的生化指标异常, 因此, 要作出正确的诊断更为困难[5]。

2.2 低磷酸酯酶症的口腔表现

一般认为该病的口腔表现主要为:牙齿早失, 根面牙骨质形成不全或发育不良;牙本质钙化不规则, 牙髓腔扩大;边缘牙槽骨的改变。其中牙根牙骨质形成不全或发育不良被认为是其主要表现。

EL-LABBAN等[11]发现低磷酸酯酶症患儿乳恒牙根表面结构的改变相似, 表现为根面牙骨质缺失, 牙本质表面存在深的吸收区, 吸收窝内有大量的细菌, 牙根表面存在一层厚的菌斑。T. VAN DEN BOS等[12]通过电子显微镜观察了7名患者早失乳牙的牙骨质及牙本质结构, 发现患者细胞性及非细胞性牙骨质形成均严重受损, 牙根面牙周膜附着较正常对照组明显减少, 且牙根表面有菌斑覆盖, 牙周膜胶原纤维在牙本质处被一约5nm厚的高电子密度层阻断, 但两组间牙本质的矿化组织无明显差异。该研究还通过实时PCR发现与焦磷酸盐代谢相关的酶NPP1在牙髓内的活力较牙周膜减少, 焦磷酸盐浓度也较牙周膜低, 而焦磷酸盐可抑制矿化, 因此认为牙本质的矿化受碱性磷酸酶活性的影响较小。秦满等[13]通过光镜及扫描电镜观察低磷酸酯酶症患者的早失乳牙, 发现牙根表面未见确定的细菌构成的膜性结构, 认为牙根牙骨质形成不全或发育不良是该病患儿乳牙过早脱落的根本原因, 但也有学者提出异议, 认为牙槽骨早期形成不全或发育不良, 而后细菌侵入造成其吸收才是牙齿过早脱落的根本原因[8]。

有学者认为低磷酸酯酶症与牙周病变有关, WATANABE等[14]对一名16岁男性低磷酸酯酶症患者的观察发现, 尽管患者保持相当良好的口腔卫生状况, 但仍有明显的牙齿松动、牙槽骨吸收等与局限性青少年牙周炎相似的表现。作者认为, 因为低磷酸酯酶症患者的牙骨质发育不良, 引起牙周组织异常, 其对细菌感染的敏感性增加, 导致这种相似于局限性青少年牙周炎的病理改变。GIUSEPPE VALENZA等[15]对7名男性儿童型低磷酸酯酶症患者研究发现, 患儿的牙周探诊深度 (PPD) 及探诊出血指数 (BOP) 较对照组高, 但差异无显著性, 除韦荣氏菌及侵蚀艾肯菌外, 两组间龈下菌斑的细菌组成也无明显差异, 而附着丧失可能是由于牙骨质发育不全造成的。

3 低磷酸酯酶症的诊断及鉴别诊断

一般认为, 低磷酸酯酶症最可靠的诊断指标是:临床和X线发现腿骨异常, 未成熟的乳、恒牙早失, 实验室检查主要包括以下几项: (1) 血清中钙浓度及碱性磷酸酶活性; (2) 磷酰乙醇氨 (PEA) :是针对该病使用时间最长的一项生化指标, 低磷酸酯酶症患者的血浆和尿液中PEA水平均很高, 尤其是尿中, PEA是正常值的10～50倍; (3) 无机焦磷酸 (inorganic pyrophosphate, PPi) :血中PPi水平不易被一般实验技术检出。高浓度的无机焦磷酸可抑制钙-磷结晶的生成, 从而影响骨骼的正常矿化, 但并不影响成骨细胞的功能[16]。 (4) 吡哆醛-5'-磷酸 (pyridoxal 5'-phos.phate, PLP) :是维生素B6的形式之一, 其水平在低磷酸酯酶症患者生长发育的各时期均很稳定, 可反映疾病的严重程度[4]。PEA、PPi、PLP均为ALP在人体内的天然底物, 其生化指标可用作低磷酸酯酶症的诊断依据, 也可用于诊断隐性基因的携带者。

鉴别诊断:围产期型低磷酸酯酶症应与围产期成骨不全、颅骨-锁骨发育不全及软骨发育障碍等鉴别, 影像学检查对低磷酸酯酶症和软骨发育不全有鉴别价值, 二者均有严重的椎骨骨化延迟, 前者神经弓骨化不良但锥体可见, 可形成发育不良的管状骨, 而后者的锥体骨化延迟并呈拉链状, 形成无规则的团状骨组织, 使手臂和腿呈鳍肢状[5]。

某些轻症型的低磷酸酯酶症患者也可无乳牙早失病史, 但可因细微骨折导致骨痛, 易误诊为骨质疏松、多灶性骨髓炎等[17]。

儿童型及成人型低磷酸酯酶症应与佝偻病、干骺端软骨发育不良症等鉴别, 低磷酸酯酶症的血清钙、磷水平均正常, 而血清ALP降低, 维生素D治疗无效[5]。

4 低磷酸酯酶症的治疗及预后

一般认为发病越早, 病情越重, 预后也越差。重症型患者常于出生后不久即死亡, 一些轻症型患者的骨改变可随生长发育逐渐恢复, 临床症状可减轻, 血、尿的生化指标也可有所改善, 但仍不正常。

高磷酸盐制剂 (中性磷酸钠) 持续治疗可使血磷轻度升高, 增加尿焦磷酸盐的排泄, x线显示骨钙化明显改善[5], 但也有学者提出患者血中无机磷水平偏高, 可抑制TNSALP活性, 应控制磷摄入[18]。对高钙血症可给低钙饮食或加用可的松治疗。骨骼畸形严重和颅缝早期愈合的病例可考虑采用外科手术治疗[5]。

WHYTE MP等[19]对一名婴儿型患儿行骨髓移植后, 患儿的骨表现型明显改善。MIKA TADOKORO等[20]在治疗一名围产期型患儿时, 进行了常规骨髓移植后, 还将间叶组织干细胞及其体外培养后分化形成的成骨细胞和骨样结构进行了移植, 改善了患儿的骨骼结构及呼吸功能。

但移植手术仍无法从根本上改变患者体内磷酸酯酶活性。M.D MCKEE等[10]应用基因敲除小鼠作为婴儿型低磷酸酯酶症的动物模型, 采用酶替代疗法, 从出生后即开始每日注射人组织非特异性碱性磷酸酶TNSALP (sALP-FcD10) , 显著改善了骨及牙骨质的矿化。此外, 早期即有科学家进行酶替代疗法的人体试验, 结果发现, 婴儿型患者的血循环中TNSALP水平有明显提高, 漏斗胸、干骺端骨矿化不良等症状也有明显改善, 但尿中PEA、PPi等生化指标并无明显改变[21], 也有的患者采用该疗法后除血循环中TNSALP水平提高外, 临床症状并未见明显的改善[22]。

目前大多数治疗方法只能缓解疾病的症状, 基因疗法才能从根本上治疗该病, 随着科学技术的发展, 该病在基因治疗方面也有了新的进展。SEIKO YAMAMOTO等[23]对基因敲除小鼠注射携带TNSALP基因的病毒载体, 直接针对变异基因进行治疗, 使小鼠血清TNSALP 维持在较高的水平, 临床症状如癫痫发作、骨骼矿化不良等均有明显的改善。

磷酸铁锂电池知识 篇5

磷酸铁锂电池是指用磷酸铁锂作为正极材料的锂离子电池。锂离子电池的正极材料有很多种，主要有钴酸锂、锰酸锂、镍酸锂、三元材料、磷酸铁锂等。其中钴酸锂是目前绝大多数锂离子电池使用的正极材料，而其它正极材料由于多种原因，目前在市场上还没有大量生产。磷酸铁锂也是其中一种锂离子电池。从材料的原理上讲，磷酸铁锂也是一种嵌入/脱嵌过程，这一原理与钴酸锂，锰酸锂完全相同。磷酸铁锂电池是用来做锂离子二次电池的，现在主要方向是动力电池，相对NI-H、Ni-Cd电池有很大优势。磷酸铁锂电池充放电效率，相对高一些。在 88%-90%之间。而铅酸电池约为80%。

磷酸铁锂电极材料主要用于各种锂离子电池，自1996年日本的NTT首次揭露AyMPO4(A为碱金属，M为CoFe两者之组合:LiFeCOPO4)的橄榄石结构的锂电池正极材料之后, 1997年美国德克萨斯州立大学研究群也接着报导了LiFePO4的可逆性地迁入脱出锂的特性，美国与日本不约而同地发表橄榄石结构(LiMPO4), 使得该材料受到了极大的重视，并引起广泛的研究和迅速的发展。与传统的锂离子二次电池正极材料，尖晶石结构的LiMn2O4和层状结构的LiCoO2相比，LiMPO4 的原物料来源更广泛、价格更低廉且无环境污染。

磷酸铁锂电池*构造

正极：正极物质在磷酸铁锂离子蓄电池中以磷酸铁锂(LiFePO4)为主要原料;

负极： 负极活性物质是由碳材料与粘合剂的混合物再加上有机溶剂调和制成糊状，并涂覆在铜基体上，呈薄层状分布;

隔膜板： 称为隔板或称隔离膜片，其功能起到关闭或阻断通道的作用，一般使用聚乙烯或聚丙烯材料的微多孔膜。所谓关闭或阻断功能是电 池出现异常温度上升时阻塞或阻断作为离子通道的细孔，使蓄电池停止充放电反应。隔膜板可以有效防止因内、外部短路等引起的过大电 流而使电池产生异常发热现象。

PTC 元件：在磷酸铁锂电池盖帽内部，当内部温度上升到一定温度时或电流增大到一定控制值时，PTC 就起到了温度保险丝和过流保险的 作用，会自动拉断或断开，从而形成内部断路。这样电池内部停止了 工作反应，温度降下来。保证了电池的安全使用(双重保险)。

安全阀：为了确保磷酸铁锂电池的使用安全性，一般通过对外部电路 的控制或者在磷酸铁锂电池内部设有异常电流切断的安全装置。即使 这样，在使用过程中也有可能其他原因引起磷酸铁锂电池内压异常上 升，这样，安全阀释放气体，以防止蓄电池破裂或爆开。安全阀实际 上是一次性非修复式的破裂膜，一旦进入工作状态，保护蓄电池使其 停止工作，因此是蓄电池的最后的保护手段。

磷酸铁锂电池*原理

电池充电时，正极材料中的锂离子脱出来，经过电解液，穿过隔膜进入到负极材料中;电池放电时，锂离子又从负极中脱出来，经过电解液，穿过隔膜回到正极材料中。(注：锂离子电池就是因锂离子在充放电时来回迁移而命名的，所以锂离子电池又称“摇椅电池”

磷酸铁锂电池*优势

磷酸铁锂动力电池七大优势:

一、超长寿命，长寿命铅酸电池的循环寿命在300次左右，最高也就500次，而山东海霸能源集团有限公司生产的磷酸铁锂动力电池，循环寿命达到2000次以上，标准充电(5小时率)使用，可达到2000次。同质量的铅酸电池是“新半年、旧半年、维护维护又半年”，最多也就1—1.5年时间，而磷酸铁锂电池在同样条件下使用，将达到7-8年。综合考虑，性能价格比将为铅酸电池的4倍以上。

二、使用安全，磷酸铁锂完全解决了钴酸锂和锰酸锂的安全隐患问题，钴酸锂和锰酸锂在强烈的碰撞下会产生爆炸对消费者的生命安全构成威胁，而磷酸铁锂以经过严格的安全测试即使在最恶劣的交通事故中也不会产生爆炸。

三、可大电流2C快速充放电，在专用充电器下，1.5C充电40分钟内即可使电池充满，起动电流可达2C,而铅酸电池现在无此性能。

四、耐高温，磷酸铁锂电热峰值可达350℃—500℃而锰酸锂和钴酸锂只在200℃左右。

五、大容量。

具有比普通电池(铅酸等)更大的容量。5AH-1000AH(单体)

六、无记忆效应。

可充电池在经常处于充满不放完的条件下工作，容量会迅速低于额定容量值，这种现象叫做记忆效应。像镍氢、镍镉电池存在记忆性，而磷酸铁锂电池无此现象，电池无论处于什么状态，可随充随用，无须先放完再充电。

七、绿色环保。该电池不含任何重金属与稀有金属(镍氢电池需稀有金属)，无毒(SGS认证通过)，无污染，符合欧洲RoHS规定，为绝对的绿色环保电池证。铅酸电池中却存在着大量的铅，在其废弃后若处理不当，将对环境够成二次污染，而磷酸铁锂材料无论在生产及使用中，均无污染。因此该电池又列入了“十五”期间的“863”国家高科技发展计划，成为国家重点支持和鼓励发展的项目。随着中国加入WTO，中国电动自行车的出口量将迅速增大，而现在进入欧美的电动自行车已要求配备无污染电池.可见与传统电池相比，磷酸铁锂电池只在价格方面处于一定劣势，其他各项指标明显占据优势。但如果考虑电池寿命，磷酸铁锂电池的价格却是最低的。磷酸铁锂除了振实密度、克容量两个指标略有不足，其他各项指标均占很大优势，尤其是在循环性能、环保性、安全性能、原料成本及应用领域方

磷酸铁锂电池*劣势

磷酸铁锂电池也有其缺点：例如低温性能差，正极材料振实密度小，等容量的磷酸铁锂电池的体积要大于钴酸锂等锂离子电池，因此在微型电池方面不具有优势。而用于动力电池时，磷酸铁锂电池和其他电池一样，需要面对电池一致性问题，以下具体分析：

1、导电性差、锂离子扩散速度慢。高倍率充放电时，实际比容量低，这个问题是制约磷酸铁锂产业发展的一个难点。磷酸铁锂之所以这么晚还没有大范围的应用，这是一个主要的问题。

2、振实密度较低。一般只能达到0.8-1.3，低的振实密度可以说是磷酸铁锂的很大缺点，这决定了它在小型电池如手机电池等没有优势，所以其使用范围受到一定程度的限制。即使它的成本低，安全性能好，稳定性好，循环次数高，但如果体积太大，也只能小量的取代钴酸锂。但这一缺点在动力电池方面不会突出。因此，磷酸铁锂主要是用来制作动力电池。

3、一致性问题严重。单体磷酸铁锂电池寿命目前超过2000次，但是制作出来的电池一致性不佳，进而影响到电池组的使用性能和整体寿命，因此应用在动力汽车上存在一定障碍。

4、磷酸铁锂电池低温性能差。磷酸铁锂材料的固有特点，决定其低温性能劣于锰酸锂等其他正极材料。一般情况下，对于单只电芯，其0℃时的容量保持率约 60～70%，-10℃时为40～55%，-20℃时为20～40%。这样的低温性能显然不能满足动力电源的使用要求。

5、制造成本高。磷酸铁锂具有安全性、环保性、循环次数高等优点是毋庸置疑的，但目前的制造成本相对铅酸电池、锰酸锂电池要高，其主要原因是：

1)材料物理性能和其他锂电材料相差较大，其粒度小，振实密度小，比表面积大，材料的加工性能不好，涂敷量低，导致电池成本增加;

2)磷酸铁锂电池只有 3.2V，比其他的锂电低20%左右，单体电池要多用20%，导致电池组成本上升较多。

随着技术的发展，磷酸铁锂材料上的这些缺点正在逐步得到解决，其性价比也逐步得到提高，应用范围也逐渐扩大，我们相信，磷酸铁锂电池技术已经进入一个飞速发展阶段，正在带动整个产业从市场的培育导入期进入一个高速增长阶段。

磷酸铁锂电池*性能及应用

电动车动力电池主要有四种：铅酸电池、镍氢电池、镍镉电池和锂动力电池，其中，前三种电池由于电池寿命短，并没有被广泛使用，未来将会逐渐退出历史舞台。锂动力电池虽然性能优势明显，但是因为所用电极材料体系不同，致使其性能又有着千差万别，研究较为成熟的正级材料钴酸锂，由于其安全性较差，基本上不具备制作大容量高功率动力电池的可能性。

而磷酸铁锂电池，具有循环寿命长、结构稳定、安全性能好、成本低廉等诸多优势，并且磷酸铁锂材料无任何有毒有害物质，不会对环境构成任何污染，被世界公认为绿色环保电池材料。国内外电池技术研究专家普遍指出，磷酸铁锂电池作为动力型电源，必将成为铅酸、镍氢及锰、钴等系列电池最有前景的替代品。

正是因为相对其他几种电池，磷酸铁锂电池具有无可比拟的优越性，国内外车企都看到了磷酸铁锂电池的应运潜力，纷纷将磷酸铁锂电池应用于电动车中。磷酸铁锂的研发开始时间，国内外几乎同步，而量产速度中国甚至超过海外。据了解，截止2011年，比亚迪作为全球最先实现磷酸铁锂电池产业化的车企之一，已在惠州市已经投资总计12.01亿元资金，用于磷酸铁锂电池基地建设，并最先将磷酸铁锂电动车投放市场，使电池的性能优势得到了充分证明。国家电网上海公司负责人评价说：“与其他电动车企业相比，比亚迪的电动车运行最稳定，运行效率也最高。”

锂离子动力电池的性能主要取决于正负极材料，磷酸铁锂作为锂电池材料是近几年才出现的事，国内开发出大容量磷酸铁锂电池是2005年7月。其安全性能与循环寿命是其它材料所无法相比的，这些也正是动力电池最重要的技术指标。1C充放循环寿命达2000次。单节电池过充电压30V不燃烧，穿刺不爆炸。磷酸铁锂正极材料做出大容量锂离子电池更易串联使用。以满足电动车频繁充放电的需要。具有无毒、无污染、安全性能好、原材料来源广泛、价格便宜，寿命长等优点，是新一代锂离子电池的理想正极材料。

本项目属于高新技术项目中功能性能源材料的开发，是国家“863”计划、“973”计划和“十一五”高技术产业发展规划重点支持的领域。

锂离子电池的正极为磷酸铁锂材料，其安全性能与循环寿命有较大优势，这些也正是动力电池最重要的技术指标之一。1C充放循环寿命可做到2000次，穿刺不爆炸，过充时不容易燃烧和爆炸。磷酸铁锂正极材料做出大容量锂离子电池更易并串联使用。

磷酸铁锂电池*电池安全问题

磷酸铁锂电池同样有危险性。因为，磷酸铁锂也是一种锂离子电池。从材料的原理上讲，磷酸铁锂也是一种嵌入/脱嵌过程，这一原理与钴酸锂，锰酸锂完全相同。

而锂的化学性质非常活泼，很容易燃烧，当电池充放电时，电池内部持续升温，活化过程中所产生的气体膨胀，电池内压加大，压力达到一定程度，如外壳有伤痕，即会破裂，引起漏液、起火，甚至爆炸。

从技术理论来看，磷酸铁锂电池，对电池的，起火，爆炸，等危险性有小部分的改善，但很不彻底，危险性一样突出。

在各种情况下，电池，外部短路，内部短路，过充。电池，都存在发生危险的可能。

磷酸铁锂电池*使用常识

一、锂离子电池充电

1、对锂离子电池充电，应使用专用的锂离子电池充电器。

2、锂离子电池充电采用“恒流/恒压”方式。

3、充电电压：最大充电电压是4.2V*n(n：串联电池数)

4、充电电流：推荐的充电电流0.5C(如标称容量为1500mAh的电池，充电电流0.5*1500=750mAh)

5、充电温度：电池应在0°C—45°C范围内进行充电。

二、锂离子电池放电

1、放电电流：放电电流应该在1.0C或更小。(如果您希望用大于1.0C的电流对电池放电，请与我们联系)

2、放电温度：电池应在-20°C到+60°C温度范围内进行放电(工作)。

3、放电终止电压：电池的放电终止电压不应小于2.5V*n(n：串联电池数)。电池过放会使电池寿命缩短，严重时会导致电池失效。

磷酸铁锂电池*储存方法

电池可贮存在环境温度为-5°C—35°C，相对湿度不大于75%的清洁、干燥、通风的室内，应避免与腐蚀性物质接触，远离火源及热源。电池电量保持标称容量的30%到50%。推荐贮存的电池每6个月充电一次。

磷酸铁锂电池*市场剖析

磷酸铁锂原料

磷酸铁锂材料原料行业属于资源性行业，全球各地的锂资源基本已为各大公司圈地所占，我们认为在锂资源行业对风险投资已经失去战略性进入的价值。磷源化合物属于传统的化工消耗品，已经具有非常成熟的供应商。相对而言，高质量的铁源化合物国内暂无占有绝对优势的供应商，存在一定的投资机会，投资者可以关注深圳硕田科技，合肥亚龙等在这一领域领先的企业。

国内磷酸铁锂正极材料厂商情况

目前国际上磷酸铁锂材料知名的厂商主要是美国A123、加拿大的Phostech以及美国Valence。这些厂商都已经发展出十分成熟的量产技术，其中最大的产能5000吨/年以上。中国企业从2001年就陆续启动磷酸铁锂材料开发，历经6年时间，北大先行终在2007年突破了磷酸铁锂从实验室技术到中试生产技术的一系列技术及工程问题，并在完善相关工艺过程中，使得磷酸铁锂电池的安全性得到了较大程度的提高与保证，奠定了磷酸铁锂产品系列化和规模产业化的基础。总体来看，国内对磷酸铁锂的技术研发水平及产业化程度与国际基本同步。在产能方面中国的材料供应商与国外大厂差不多，售价比国外要低，但材料加工性能和稳定性略逊一筹。现阶段全国约有50多家电池材料生产厂商，其中真正进入工业化批量生产的仅有天津斯特兰、北大先行、苏州恒正等十余家。虽然真正具备供货能力的企业为数不多，但表明中国企业抓住了此次锂电池发展机遇，使中国锂电在动力电池的产业化走在世界前列。可以看出，国内所有磷酸铁锂材料厂家的产品均各有优缺点，没有一家厂家在技术上绝对的优势，也未有厂家能大规模的量产。

锂电池电解液厂家情况

湿法磷酸二氢钙生产工艺探讨 篇6

关键词：磷酸二氢钙；废酸；湿法磷酸法

中图分类号：TQ126.3 文献标识码：A 文章编号：1671-864X（2015）12-0286-01

磷酸二氢钙，无机化合物，是无色三斜片状、粒状或结晶性粉末，广泛用于水产养殖动物及畜禽养殖动物的饲料添加剂，用作膨松剂、面团调节剂、缓冲剂、营养增补剂、乳化剂、稳定剂等品质改良剂。磷酸氢钙生产的主要方法分为四种：骨胶副产法、普钙水萃法、热法磷酸法及湿法磷酸法。

骨胶副产法由于近年来对动物骨胶需求量的下降及杂骨来源困难，使这一方法生产的磷酸氢钙数量减少；普钙水萃法其产品质量不稳定，生产强度小，规模小，且副产大量水淬渣，做磷肥使用养分不够，堆放又会造成污染，因而这是一种落后的工艺；热法磷酸法能耗大，成本高，导致热法磷酸生产的磷酸氢钙成本高。而湿法磷酸法比热法成本低很多

一、实验部分

（一）仪器和试剂。

试剂：磷矿粉、工业废酸（含7～25%HCl）、工业硫酸（98%）石灰（含CaO85%以上）

（二）實验过程

在一个装有搅拌器的1000mL烧杯中，加入7%HCl 84g、98%H2SO4 43.3g，再加水到300mL，总酸含量为17%，这时温度升得很高（加入顺序最好调整为先加水，再加盐酸，再加硫酸）。开动搅拌器搅拌5分钟使其混合，再加入磷酸粉100g，加料时间为15分钟，加料时注意温度不能超过50℃，加料完毕后搅拌90分钟，加入KCl 3g，再搅拌30分钟，加入70mL50PPM的PPA，搅1分钟出料，立刻抽滤，滤渣用50mL水洗一次，抽滤干。渣作为肥料，清液进入下一步合成。

将上步清液放入1000mL烧杯中，开始搅拌，慢慢加入比重1.06～1.07的石灰乳中和，温度不超过40℃，用精密试纸测试，PH值为2.5～3为终点，放置120分钟后，抽滤。渣作为肥料，清液进入下一步合成。

将上步清液放入1000mL烧杯中，加入60～70g 35%H3PO4，开动搅拌，用比重为1.06～1.07的石灰乳中和到PH6.5～7为终点，抽滤。用水洗两次，烘干，即为产品。，

二、结果与讨论

1.饲料级磷酸二氢钙质量要求指标

饲料级磷酸二氢钙是一种重要的饲料矿物质添加剂。磷和钙是构成畜禽骨骼和牙齿的重要元素，在动物的生长发育过程中起着非常重要的作用。

湿法磷酸法生产的磷酸二氢钙质量指标分析

对比表1和表2可知，湿法磷酸法生产的磷酸二氢钙质量指标分析结果完全满足国标的要求

三、结论

1.本技术能使饲料级磷酸氢钙达到GB 22548-2008标准要求，产品质量稳定，操作简单。

2.本技术可使湿法磷酸中的P2O5回收率提高到80%～96%生产成本低，技术经济指标国内领先

3.本技术可适应各种中品位磷矿制取饲料级磷酸氢钙

4.本技术虽已应用中品位磷矿粉制取饲料级磷酸氢钙获得成功但对诸多较低品位磷矿脱氟尚需进行深入地研究

参考文献

[1]张永志.重视磷石膏的综合利用 促进磷肥工业可持续发展[J]. 磷肥与复肥. 2009（02） .

[2]余静，刘代俊，徐碧.低品位磷矿在变浓度磷酸中酸解动力学[J]. 四川大学学报（工程科学版）. 2009（02） .

[3]黄隐华，胡锋波，薛文静，张允湘.湿法磷酸生产饲料级磷酸二氢钙的研究[J]. 化学研究与应用. 2007（12） .

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[5]莫桂英，贾振宇.湿法磷酸干法直接生产饲料级磷酸二氢钙（MCP）中试试验研究[J]. 湖北化工. 2002（06） .

[6]邓维平，夏代宽.磷酸分解磷矿的工艺条件研究[J]. 硫磷设计与粉体工程. 2002（06） .

用次磷酸钠废渣制备饲料级磷酸三钙 篇7

本工作采用高温煅烧工艺,使需要堆存或深埋处理的有毒固态次磷酸钠废渣转变为具有较高市场价值的饲料级磷酸三钙[8,9],避免了含磷废渣造成的环境污染,具有显著的环保效益、社会效益和经济效益。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

工业生产次磷酸钠过程中所产生的废渣主要成分见表1。

SX2-4-10型箱式电阻炉:天津中环实验电阻炉有限公司;ICAP-9000型电感耦合等离子体发射光谱仪:美国热电公司;DX-120型离子色谱:美国DIONEX公司;722型光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂;DGG-101-0型恒温干燥箱:天津市天宇实验有限公司。

1.2 实验原理

对次磷酸钠废渣进行煅烧,废渣中的主要成分亚磷酸钙在高温和氧气存在的条件下氧化为磷酸三钙,反应方程式如下。

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1.3 实验方法

废渣的预处理。取一定量的工业生产次磷酸钠废渣,在105 ℃下干燥至恒重,再用研钵粉碎,过30 目实验标准筛后备用。

高温煅烧实验。称取一定量的经预处理的工业生产次磷酸钠废渣于瓷坩埚中,在箱式电阻炉中进行高温煅烧处理。反应过程中不断补充氧气,使其充分反应,最终得到同一时间不同温度和同一温度不同时间的两组产品。

(1) 分别称取5

g经预处理的工业生产次磷酸钠废渣至瓷坩埚中,在350～1 050 ℃的不同温度下进行高温煅烧20 min后取出备用。

(2) 分别称取5

g经预处理的工业生产次磷酸钠废渣至瓷坩埚中,在600 ℃的温度下煅烧10～60 min后取出备用。

1.4 分析方法

亚磷酸钙的测定。取1 g经预处理的工业生产次磷酸钠废渣和1 g无水碳酸钠置于烧杯中,加50 mL水溶解。在80 ℃水浴中加热4 h后抽滤,用1 ∶1的盐酸调节滤液pH至中性,定容于100 mL容量瓶中。参考HG/T 3253—2000《工业次磷酸钠》中的分析方法,对产品中亚磷酸钠含量进行测定,再换算成亚磷酸钙含量。

磷酸三钙的测定。取1 g经预处理的工业生产次磷酸钠废渣溶于10 mL 1 ∶1的盐酸中,待其充分溶解后抽滤,取滤液定容于100 mL容量瓶中。参考《水和废水监测分析方法》[10]中钼锑抗分光光度法,对产品中的正磷酸盐含量进行测定,再换算成磷酸三钙含量。

氟含量采用离子色谱法进行测定[11];重金属铅和砷含量采用等离子体发射光谱仪进行测定[12]。

2 结果和讨论

2.1 煅烧温度对产品中亚磷酸钙和磷酸三钙含量的影响

经预处理的工业生产次磷酸钠废渣由于水分蒸发,亚磷酸钙的质量分数在80%左右。在350～1 050 ℃的不同煅烧温度下,对经预处理的工业生产次磷酸钠废渣进行高温煅烧,所得试样中亚磷酸钙和磷酸三钙的含量见图1。由图1可知:随煅烧温度的升高,亚磷酸钙的含量逐渐降低,600 ℃时亚磷酸钙的质量分数小于1%;煅烧温度继续升高,亚磷酸钙的质量分数变化不大。这说明600 ℃时亚磷酸钙已反应完全。随煅烧温度的升高,磷酸三钙的含量逐渐增加,到达600 ℃后磷酸三钙的含量基本保持不变。综合考虑,经预处理的工业生产次磷酸钠废渣的最佳煅烧温度为600 ℃。

亚磷酸钙; 磷酸三钙

2.2 煅烧时间对产品中亚磷酸钙和磷酸三钙含量的影响

煅烧温度为600 ℃时,煅烧时间对亚磷酸钙和磷酸三钙含量的影响见图2、图3。由图2可知:高温煅烧10 min时亚磷酸钙的质量分数低于1%;随时间的延长,亚磷酸钙的含量逐渐降低,20 min时亚磷酸钙的含量明显降低;时间继续延长对亚磷酸钙含量的影响不大。从图3可知:高温煅烧10 min后,磷酸三钙的含量随煅烧时间的延长而急剧增加;高温煅烧20 min时,磷酸三钙的质量分数达到87%;煅烧时间从20 min延长到60 min时,磷酸三钙的含量略有增加。结合图2和图3,经预处理的工业生产次磷酸钠废渣的最佳煅烧时间为20 min。

2.3 产物分析

目前我国磷酸三钙尚无化工行业标准,只能参考国外标准和国内一些省份的标准[13,14]。按照Q/YHY 01—2003《饲料级磷酸三钙》产品质量企业标准中的分析方法检测本实验所得产品的质量,各项技术指标见表2。

3 结论

a)经预处理的工业生产次磷酸钠废渣最佳煅烧温度为600 ℃,最佳煅烧时间为20 min,所得产品中磷酸三钙的质量分数为87%。

b)通过此工艺制取的饲料级磷酸三钙中磷的质量分数为16%～18%,达到Q/YHY 01—2003《饲料级磷酸三钙》产品质量企业标准,品质优异。

c)本工艺减少了废渣的填埋、堆存处理所引起的二次污染,具有良好的环境效应。

摘要：采用高温煅烧工艺,以工业生产次磷酸钠的废渣为原料,制备饲料级磷酸三钙,并对最佳工艺条件进行探讨。最佳工艺条件:煅烧温度600℃、煅烧时间20min。制得的饲料级磷酸三钙中磷的质量分数为16%～18%,符合Q/YHY01—2003《饲料级磷酸三钙》产品质量企业标准。

磷酸酯酶 篇8

磷酸二酯酶 (Pde) 在植物病原菌G蛋白信号通路过程中发挥着重要作用, 其功能主要在于将c AMP转化为5’-AMP以及将c GMP转化为5’-GMP, 从而实现对于信号传递的调节。c AMP、c GMP均是生物体内普遍存在的感受外界激素和营养信号的第二信使[5], 在生物生命活动中发挥着重要的生化作用。现已明确酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中含有2个Pde[6]。另外, 在模式真菌盘基网柄菌[7]以及致病真菌稻瘟菌[8]、禾谷炭疽菌 (韩长志, 另文已发) 等诸多真菌中已见相关报道。通过深入探析该酶所具有的生物学, 有利于更加深入了解病菌信号传导以及致病机制。

本研究创新之处在于利用模式生物S.cerevisiae中已经报道的Pde, 通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析, 以及通过Pde关键词搜索, 获得与C.higginsanum中的Pde, 并通过对该蛋白的氨基酸序列进行保守结构域分析、理化性质、疏水性分析以及亚细胞定位等生物信息学分析, 同时, 基于上述发现的Pde氨基酸序列, NCBI在线进行同源序列搜索, 通过遗传关系分析, 以期为进一步开展同属于炭疽菌属但其基因组序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

根据S.cerevisiae S288c中含有的2个Pde氨基酸序列, 利用炭疽菌属蛋白质数据库在线Blastp比对[9], 所有参数均选择默认值, 获得C.higginsanum中所含有的典型Pde, 同时, 通过输入“Phosphodiesterases”、“PDEase”等关键词, 在上述数据库中进行Pde检索;另外, 利用NCBI明确该菌中Pde蛋白质登录号信息。

1.2 方法

1.2.1 保守结构域预测

利用SMART网站在线实现[10]。

1.2.2 蛋白质理化性质及疏水性预测

利用Ex Pa Sy在线进行预测[11]。

1.2.3 蛋白质转运肽及信号肽预测

利用Target P 1.1 Server、Signal P 3.0 Server在线分析分别实现转运肽的预测[12]、信号肽的预测[13]。

1.2.4 蛋白质二级结构及跨膜区结构预测

采用PHD、TMHMM 2.0 Server在线分析分别实现二级结构[14]、跨膜区结构预测[13]。

1.2.5 亚细胞定位分析

利用Prot Comp v9.0实现[15]。

1.2.6 系统进化树构建

通过在NCBI中Blastp同源搜索, 获得来自于不同物种的同源蛋白质序列, 并利用Clustal X[16]进行多种比对, 采用MEGA 5.2.2中邻近法构建系统进化树, 同时, 各分支之间的距离计算采用p-distance模型, 系统可信度检测采用自举法重复1 000次进行[17]。

2 结果与分析

2.1 C.higginsanum中存在2个Pde

结果显示, C.higginsanum中各存在一个与酿酒酵母Pde1、Pde2同源的序列, 其ID为CH063_03640.1、CH063_10269.1, 同时, 通过保守域分析, 结果显示, Sc Pde1与CH063_03640.1具有相似的保守结构域, Sc Pde2与CH063_10269.1具有相同的HDc保守结构域 (图1) , 基于此, 对CH063_03640.1、CH063_10269.1进行命名为Ch Pde1、Ch P-de2 (表1) 。此外, 利用NCBI保守结构域分析, 结果表明, Sc Pde1与Ch Pde1均含有PDEase_Ⅱsuperfamily保守结构域;Sc Pde2与Ch Pde2均含有HDc保守结构域 (结果未显示) , 这与通过SMART分析结果一致。

2.2 氨基酸组成情况

结果表明, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde在不同类别的氨基酸数量以及所占比例方面均存在着较大的差异, 具体而言, S.cerevisiae中Sc P-de1、Sc Pde2所含最高比例的氨基酸均为Leu, 所占比例分别为11.70%、11.60%;所含最低比例的氨基酸为均为Trp, 所占比例分布为1.10%、1.50% (韩长志, 另文已发) ;C.higginsanum中Ch Pde1、Ch Pde2所含最高比例的氨基酸分别为Ala、Leu, 所占比例分别为9.90%、9.40%;所含最低比例的氨基酸分别为Met、Trp, 所占比例均为0.80% (表2) 。

2.3 理化性质分析

结果显示, C.higginsanum中Pde理论等电点范围在5.5~6.5, 属于酸性范围内 (表3) 。上述Pde在所预测的半衰期较为一致, 均为30 h, 其稳定性系数尽管不同, 但数值均大于40, 同时, 总平均亲水性 (GRAVY) 均为负值, 上述结果表明C.higginsanum中的Pde属于亲水性不稳定性蛋白 (表3) 。

2.4 转运肽和信号肽特征

结果表明, C.higginsanum中Pde1、Pde2均显示定位于分泌途径上, 其预测值分别为0.930、0.740, 而对于预测可靠性方面所处的概率有所不同 (表4) 。无论是根据经网络方法进行计算, 还是根据隐马可夫模型进行计算, 上述2个Pde均不含有信号肽 (结果未显示) 。

*:1~5, 数值越大可靠性越差。1表示其概率为大于0.8, 2表示其概率在0.6~0.8, 3表示其概率在0.4~0.6, 4表示其概率在0.2~0.4, 5表示其概率为小于0.2。

2.5 C.higginsanum中Pde均为亲水性蛋白

通过Protscale预测分析, S.cerevisiae和C.higginsanum不同物种间以及同一物种不同Pde间在亲水性最强氨基酸残基、位置以及疏水性最强氨基酸残基、位置方面均存在着较大差异, 有待于今后进一步进行试验验证。

对Ch Pde1、Ch Pde2进行疏水性、亲水性数值进行统计分析, 结果显示, 上述Pde均属于亲水性蛋白, 这与通过GRAVY计算所得结果一致 (表5、图2) 。

2.6 亚细胞定位特征

结果表明, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde定位不尽相同, 前者中的Sc Pde1、Sc Pde2定位相同, 均定位于细胞质中 (韩长志, 另文已发) , 而后者中的Ch Pde1、Ch Pde2分别定位于细胞质、细胞核中 (表6) 。由于Pde作为G蛋白信号通路上重要的效应酶, 一般在细胞质中发挥作用, 这与Sc Pde1、Sc P-de2、Ch Pde1定位于细胞质中相一致, 然而, 预测Ch Pde2定位于细胞核, 其功能有待于后期进一步研究。

2.7 二级结构分析

结果显示, S.cerevisiae与C.higginsanum中的Pde在二级结构组成方面具有较大的差异性, 具体而言, Sc Pde1含有近乎相同比例的α螺旋, β折叠结构和无规则卷曲三种形式组成, Sc Pde2则具有较高比例的α螺旋, 所占比例为65.0%;Ch Pde1、Ch P-de2均具有较高比例的无规卷曲, 所占比例分别为44.0%、48.0%, Ch Pde2具有较高比例的α螺旋 (图3) 。

2.8 系统进化树分析

以Ch Pde1、Ch Pde2为基础序列, 通过在NCBI中Blastp同源性搜索, 获得与上述Pde具有一定同源性的不同物种的氨基酸序列, 根据其同源关系数值, 选择8条序列, 并结合Sc Pde1、Sc Pde2序列, 利用MEGA 5.2.2进行系统进化分析, 结果表明, Ch P-de1与禾谷炭疽菌 (Colletotrichum graminicola) Cg P-de1亲缘关系较近, 并与同属于炭疽菌属的其他真菌Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum gloeosporioides聚为一类;与此相同, Ch Pde2也与属于与Sc Pde1同源关系与Ch Pde2亲缘关系较近, 并与同属于炭疽菌属的真菌聚为一类 (数据未显示) 。

3 讨论

炭疽菌属真菌包括约600个种, 可以侵染超过3 200种单子叶植物和双子叶植物[18]。目前, 生产上对该属病菌的防治药剂主要有多菌灵、甲基托布津、苯菌灵等, 特别是与C.higginsanum同属的C.gloeosporioides对多菌灵的抗药性受到广泛关注[19—21], 而生产上尚未有新的有效药剂用于炭疽病的防治。

前人关于Pde的研究多见于对其进行抑制剂的筛选工作[22,23]、基因功能[8]等方面。随着对G蛋白信号通路众多效应酶研究的不断深入, 有关磷酸二酯酶的研究已在酵母、稻瘟病菌等诸多真菌中相关研究, 而对于危害十字花科植物造成严重损失的C.higginsanum的Pde研究尚不够深入, 有待于进一步开展以Pde亚细胞定位、基因功能等相关基础研究。

4 结论

磷酸酯酶 篇9

PA-PLA 1首先由华盛顿大学G lom set的实验室从牛的睾丸和脑组织中分离纯化并克隆[1,2,3]。我们从人的肾脏组织克隆了人的PA-PLA 1基因 (G en Bank accession no.D Q 315474) , 该基因定位于14q22, m R N A长2923 nt, 编码一个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽, 分子量为83141D。通过序列比对分析, 发现该基因与K IA A 0725p和p125蛋白具有一定的同源性。K IA A 0725p和p125蛋白均能水解膜PA生成LPA, 进而影响高尔基体分泌小泡的形成, 并在细胞转运小泡介导的物质运输中发挥调节作用[4,5]。PA-PLA 1是否涉及细胞转运小泡介导的物质运输尚不清楚, 但PA-PLA 1在人不同的组织中呈差异性表达[3]。我们用荧光定量PCR方法检测17种人组织发现PA-PLA 1基因在胰岛组织中具有极高的表达水平 (另文发表) , 提示PA-PLA 1可能参与了胰岛β细胞功能的调节。本研究用葡萄糖刺激胰岛素分泌 (glucose-stim ulated insulin secretion, G SIS) 实验研究小鼠分泌胰岛素细胞株M IN 6的PA-PLA 1基因表达与胰岛素分泌的关系, 为PA-PLA 1生理功能的阐明提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胰岛瘤细胞株M IN 6由解放军总医院邢军老师馈赠;高糖D M EM (H yclone美国公司) ;胎牛血清 (北京元亨金马生物公司) ;小鼠超灵敏胰岛素ELISA检测试剂盒 (M ercodia A B, Sweden) ;R N A提取试剂盒Trizol (美国invitrogen公司) ;Protein A ssay D ye R eagent Concentrate (美国Bio-R ad公司) ;逆转录试剂盒 (美国Ferm entas公司) ;荧光定量PCR试剂盒 (日本Takara公司) ;小鼠PA-PLA 1和β-actin引物均由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 M IN 6细胞的培养

在37℃、5%CO2条件下, 用含15%胎牛血清、青霉素100 U/m L、链霉素100μg/m L、50μm ol/Lβ-巯基乙醇的高糖D M EM培养, 细胞生长融合度达80%后, 按每孔5×105个细胞植入24孔板中, 培养48 h后备用。

1.2.2 葡萄糖刺激胰岛素分泌 (G SIS) 实验

以含不同浓度葡萄糖 (0、5、10、15、20、25和50 m m ol/L) 的K rebs-R inger Bicarbonate (K R BB) 缓冲液按文献所述方法刺激M IN 6细胞分泌胰岛素[6], 每种浓度设3个复孔, 刺激时间为2 h。或以含25 m m ol/L葡萄糖的K R BB刺激M IN 6细胞分泌胰岛素, 刺激时间分别为2、6、12、18和24 h, 每个刺激时间设3复孔。收集细胞上清液, 酶联免疫吸附法测定胰岛素分泌量变化。

1.2.3 细胞总R N A提取、逆转录及总蛋白质的提取和定量

以PBS冲洗胰岛素分泌实验后的细胞2次后, 每孔加入500μL Trizol, 按Trizol试剂说明书分别提取细胞总R N A及总蛋白质。1%琼脂糖凝胶电泳检测总R N A完整性, 紫外分光光度法检测其纯度和含量。以提取的总R N A 3μg为模板, oligo (d T) 18为引物逆转录合成c D N A, 存于-20℃备用。提取的总蛋白以酶标板微孔法考马斯亮蓝检测其浓度, 用每孔细胞总蛋白质的浓度校正胰岛素分泌量。1.2.4荧光定量检测PA-PLA 1基因表达水平 (1) 引物的设计:根据G en Bank小鼠PA-PLA 1基因m R N A序列 (登录号:D Q 272481) 设计引物P1:5′-TCTTG A TG G A G A CA CA G TTG A TTCC-3′, P2:5′-TTA CA CA CCCCA A G G A A TG G-3′扩增小鼠PA-PLA 1基因, 产物长度为250 bp。以小鼠β-actin基因作为内参, 引物分别为P3:5′-G TCCCTCA CC-CTCCCA A A A G-3′, P4:5′-G CTG CCTCA A CA C-CTCA A CCC-3′, 扩增产物长度为266 bp。 (2) 内参照基因与目的基因扩增效率检测:将M IN 6细胞空白组c D N A进行倍比稀释, 获得原倍、2-1倍、2-2倍、2-3倍、2-4倍、2-5倍、2-6倍浓度的c D N A, 并将其作为模板, 用上述引物分别扩增β-actin与PA-PLA 1。每个样本设3个平行管, 20μL反应体系为:2×SY BR Prem ix Ex Taq 10μL, 上下游引物各1μL, c D N A 3μL, R O X R eference D ye II 0.4μL, ddH2O 4.6μL。反应条件为:95℃60 s;95℃10 s, 55℃20 s, 72℃20 s, 72℃时收集荧光信号, 共进行46个循环。PCR扩增结束后, 从55℃~95℃全程读取荧光信号获得融解曲线, 以确定扩增产物的特异性。以稀释倍数的2的对数值为X轴, β-actin和PA-PLA 1的CT值为Y轴, 做线性回归图, 观察两条线的斜率, 以确定内参β-actin基因与目的基因PA-PLA 1的扩增效率是否一致。 (3) G SIS实验对内参表达量的影响检测:以不同浓度葡萄糖刺激下所得的细胞c D N A为模板, 分别扩增β-actin基因, 获得Ct值后, 计算基因表达改变倍数2-ΔCT, 其中ΔCT= (CT处理组-CT空白组) , 以A N O V A计算基因表达改变倍数的P值, 以检测葡萄糖对内参照基因表达的影响。 (4) PA-PLA 1 m R N A的表达水平与细胞胰岛素分泌量相关性检测:空白组、G SIS组的c D N A分别以β-actin和PA-PLA 1引物进行荧光定量PCR, 获得CT均值后, 计算ΔCT (CTβ-actin-CT PA-PLA1) 和ΔΔCT (G SIS组ΔCT-空白组ΔCT) 。并计算胰岛素分泌实验组PA-PLA 1 m R N A表达改变的倍数 (2-ΔΔCT) 。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件分析数据。计量资料的统计描述用表示, 采用线性相关分析PA-PLA 1m R N A的表达水平与细胞胰岛素分泌量的相关性, P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄糖刺激胰岛素分泌 (G S IS) 实验

2.1.1 不同葡萄糖浓度G SIS实验结果

K R BB刺激2 h后, 检测到培养基上清有胰岛素分泌, 经相应孔内细胞总蛋白校正, 得出不同葡萄糖浓度的K R BB溶液刺激M IN 6细胞分泌胰岛素实验结果, 如图1A所示。随着葡萄糖浓度的增加, 胰岛素分泌量亦增加, 当葡萄糖浓度为25 m m ol/L时胰岛素分泌量达到最大值 (23.10±0.80) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的1.47倍。当葡萄糖浓度为50m m ol/L时, 胰岛素分泌量有所下降, 为 (22.83±0.78) pm ol/ (m L·m g蛋白质) 。

2.1.2 不同时间G SIS实验结果

随着葡萄糖K R BB溶液刺激时间的延长, 胰岛素分泌量增加。刺激时间为6 h时, 胰岛素分泌量为 (34.76±4.20) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的1.67倍;当刺激时间为24 h时, 胰岛素分泌量最大为 (99.57±6.90) pm ol/ (m L·m g蛋白质) , 是空白对照组的4.77倍 (图1B) 。

2.2 荧光定量检测P A-P LA 1基因表达水平

2.2.1 内参照基因与目的基因扩增效率

以M IN 6细胞倍比稀释的c D N A为模板分别扩增β-actin及PA-PLA 1基因, 得到平滑的扩增动力学曲线, 融解曲线呈单峰, 琼脂糖凝胶电泳结果证实其PCR产物符合目的片段大小, 提示β-actin基因及PA-PLA 1基因均扩增良好, 无非特异性扩增。以稀释倍数的2的对数值为X轴, β-actin、PA-PLA 1基因的扩增CT值为Y轴, 做线性回归图 (图2A) , R 2均大于0.98。

2.2.2 G SIS实验对内参表达量的影响

荧光定量PCR检测空白组、G SIS组M IN 6细胞的c D N A中β-actin的m R N A的表达水平, 以A N O V A计算ΔCT间的P值, 结果显示 (图2B) M IN 6细胞中β-actin的m R N A的表达水平并不受葡萄糖浓度的影响 (P>0.05) 。

2.2.3 不同葡萄糖浓度G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平

随着葡萄糖浓度的增加, PA-PLA 1 m R N A的表达水平亦增加。当葡萄糖浓度为25 m m ol/L时PA-PLA 1 m R N A的表达水平达到最大值, 是空白对照组3.95倍;而当葡萄糖浓度为50 m m ol/L时, PA-PLA 1 m R N A的表达水平稍有下降, 为空白对照组的2.63倍 (图3A) 。

2.2.4 不同刺激时间G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平

随着葡萄糖K R BB溶液刺激时间的延长, PA-PLA 1 m R N A的表达水平亦增加。6 h PA-PLA 1 m R N A的表达水平为空白对照组的1.21倍;当刺激时间为12 h时, PA-PLA 1m R N A的表达水平为空白对照组的3.06倍;24 h时, PA-PLA 1 m R N A的表达水平为空白对照组的6.48倍 (图3B) 。

2.3 P A-P LA 1 m R N A表达水平与胰岛素分泌相关性分析

线性相关分析的数据显示, 不同葡萄糖浓度G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平与胰岛素分泌具相关性, 其相关系数r为0.89, P<0.01;不同刺激时间G SIS实验中M IN 6细胞PA-PLA 1 m R N A的表达水平与胰岛素分泌同样具相关性, 其相关系数r为0.98, P<0.01。

3 讨论

PA-PLA 1自被华盛顿大学G lom set的实验室首次报道以来, 人们对其酶学功能与基因结构已有了较深入的了解, 但对其生理功能却知之甚少。PA-PLA 1在细胞内水解PA生成LPA, 其酶活性影响细胞内PA和LPA两种脂类信号分子的水平, 因而它的生理功能可能涉及细胞内的信号转导, 并通过细胞信号转导途径对多种细胞生理过程发挥调节作用。PA-PLA 1有特定的组织分布, 在成年牛的睾丸和脑组织中具有较高的酶活性, 其中成年牛睾丸组织比新生牛的高10倍。而在肝脏、心脏、脾脏和血液中则检测不到该酶活性。因此有研究推测PA-PLA 1参与的信号转导过程与精子的发生和神经元的相互作用有关[3]。我们的研究首次表明, 小鼠分泌胰岛素细胞株M IN 6中PA-PLA 1基因表达与胰岛素分泌有关。不论是不同葡萄糖浓度G SIS实验, 还是不同刺激时间G SIS实验, M IN 6细胞的PA-PLA 1基因表达均与细胞的胰岛素分泌呈显著的正相关, 提示PA-PLA 1对M IN 6细胞的胰岛素分泌可能具有促进作用。PA-PLA 1对胰岛素分泌的影响及其机制尚待研究。鉴于PA-PLA 1在细胞内水解PA生成LPA, 其活性影响PA和LPA两种分子在细胞内的水平, 因而PA-PLA 1对胰岛素分泌的影响或调节有可能是通过PA和LPA两种分子发挥作用。

有研究表明, PA参与细胞内转运小泡介导的物质运输过程。SCH M ID T等人[7]报道, 分子呈倒锥形的LPA脂酰化生成分子呈锥形的PA的分子结构改变可使质膜高度卷曲, 从而促使转运小泡的生成。W EIG ER T等人[8]报道这种分子结构改变也诱导高尔基体管道形成。抑制PA的合成可导致高尔基体结构的改变和内分泌细胞分泌功能的抑制[9]。此外, PA还通过与N-乙基马来酰亚胺敏感因子 (N-ethylm aleim ide-sensitive factor) 、A D P-核糖基化因子 (A D P-ribosylation factor) 和激蛋白 (kinesin) 等与转运小泡介导的物质运输过程相关的蛋白结合而对细胞的物质运输过程发挥调节作用[10]。但PA这种对细胞膜泡运输过程的影响显然不能解释PA-PLA 1对胰岛素分泌的正调节作用。

近年的研究文献显示, LPA作为信号分子通过其特异的G蛋白偶联受体发挥作用, 其信号反应包括活化蛋白激酶以及磷脂酶C和D、动员Ca2+、抑制腺苷环化酶、促使花生四烯酸释放和刺激D N A合成等, 在血小板聚合、平滑肌收缩、细胞增殖以及肌动蛋白细胞骨架的重排等细胞过程中发挥关键调节作用[11,12]。有报道[13]指出, 一种与LPA同类的脂类信号分子溶血磷脂酰胆碱 (lysophosphatidylcholine, LPC) 能通过一种新发现的G蛋白偶联受体促进胰岛素的分泌。新近的研究[14]发现, PA-PLA 1在大脑细胞内生成一种新的大麻受体-G蛋白偶联受体55 (G protein-coupled receptor 55, G PR 55) 的激动剂2-花生酰-溶血磷脂酰肌醇 (2-arachidonoyl-2-arachidonoyl-lysophosphatidylinositol) , 并可能通过PA-PLA 1-溶血磷脂酰肌醇-G PR 55轴参与大脑功能的发挥。基于这些研究报道, 可以假设PA-PLA 1可能通过在胰岛β细胞内水解PA生成LPA, 进而激活某种G蛋白偶联受体而参与胰岛素分泌的调节。

磷酸酯酶 篇10

1 小试部分

1.1 仪器及试剂

磁力电动搅拌器,三口烧瓶,油浴锅,真空泵。

盐酸、甲醛、亚磷酸(固体,98%)(均为工业级)。

IDA.HCl(自制,IDA含量60.16%)。

液体亚磷酸(亚磷酸含量55%)。

1.2 试验

在2000 mL三颈烧瓶中按确定的比例和量加入亚氨基二乙酸盐酸盐、亚磷酸和盐酸,油浴加热,待温度升至加料温度开始滴加甲醛,控制2.5 h加完,然后恒温2 h,之后真空蒸馏至浆糊状,加水出料,静置8 h,过滤烘干[4,5]。实验中保持亚磷酸的总量不变,改变固体亚磷酸和液体亚磷酸的投料比例,考察收率的影响及总成本变化。

2 结果和讨论

不同固体亚磷酸和液体亚磷酸比例对收率及成本的影响见表1。

从表1实验数据看,随着液体亚磷酸的量的增加,双甘膦的收率在不断降低,且收率下降呈加速之势,含量也在不断的降低,在比例达到3∶1左右,质量已经达不到优质品标准。在整个原料成本中IDA.HCl和亚磷酸占最大比重,其它原料所占的成本比例基本不变,综合比较改变固、液亚磷酸投料比的收率变化和前后总成本变化,确定中试的投料配比为4∶1,进行中试验证。

3 中试

按表1中的条件进行中试放大,考察中试的效果。每批次的IDA.HCl分析含量后投料。中试结果见表2。

根据中试结果进行成本核算,仅使用固体亚磷酸的PMIDA其t成本为15504元,2至6批次的PMIDA平均t成本为15022元。从原料成本看,每t PMIDA约节省482元,而且在和仅使用固体亚磷酸的情况下相比,工艺设备不需要改动,仅增加1台自吸泵便可,也没有因此造成其他成本的增加。

由此可见,在IDA.HCI合成PMIDA中,使用部分液体亚磷酸替代部分固体亚磷酸从而降低生产成本是可行的。

摘要：探讨在IDA.HCl合成PMIDA中,使用部分液体亚磷酸替代部分固体亚磷酸从而降低生产成本的可行性,并确定较佳的替代比例,比较实际生产的经济性。

关键词：亚磷酸,双甘膦

参考文献

[1]钟化.草甘膦市场迎来旺年,出口价格创出历史新高[J].中国化工报市场信息,2007,9(10):3.

[2]翁国娟.草甘膦市场迎来金猪旺年[N].江苏农业科技报,2007-9-19(4).

[3]谭文涛,杨溪绿.用固体亚磷酸、纯二酸生产草甘膦工艺条件的探讨[J].贵州化工,2003,28(6):10-12.

[4]茅建明.草甘膦生产的两大工艺及技术进步[J].农药,2003,42(11):16-18.