AMPK

关键词： 蛋白激酶 腺苷酸 糖尿病

AMPK（精选三篇）

AMPK 篇1

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种保守的异源三聚体蛋白质激酶,在各组织中均有分布。AMPK具有多种功能:调控细胞生长和增殖、建立和维持细胞极性、调节动物寿命、调节生物节律等。然而,AMPK最主要的功能是可以感受细胞内ADP/ATP比值的变化并激活,通过调控能量产生和消耗过程的平衡来维持机体能量状态稳定,是细胞内的“能量感受器”[1],因其可以作为治疗肥胖、2型糖尿病等疾病的药物靶点而受到广泛关注。本文针对AMPK在能量代谢方面的研究进展作一综述。

1 AMPK的分子结构

所有物种的AMPK均由α、β、γ三个亚基组成。α亚基是催化亚基,其N末端包含一个催化域及上游激酶结合域,可以受上游激酶的调控。γ亚基是核苷酸结合亚基,其上有AMP、ADP和ATP的结合位点。β亚基负责AMPK激酶的组装,其C末端具有α亚基及γ亚基的结合位点。另外,β亚基上还具有糖原结合位点,可以作为糖原感受器。AMPK的分子结构见图1[2]。

哺乳动物可以编码2种α亚基,即α1、α2;2种β亚基,即β1、β2;3种γ亚基,即γ1、γ2、γ3。尽管AMPK在所有组织中均有分布,但其亚基分布却具有组织特异性。研究发现,在慢抽搐的比目鱼肌中α2亚基特异性地与β1亚基结合,而在快抽搐的趾长伸肌中α2亚基既可以与β1亚基结合也能与β2亚基结合[2]。在骨骼肌中,只有α2亚基才能在运动时转移到细胞核中调节能量代谢,而在脂肪组织中主要的催化亚基为α1。因此,哺乳动物AMPK各亚基间的相互作用对其功能具有较大影响。AMPK在不同细胞中以不同亚型复合体存在,这可能与其下游靶基因的选择有关[3]。

AMPKα亚基Thr172位磷酸化直接决定着AMPK酶活力的有无。目前,在哺乳动物中已经发现两种AMPK激酶可以磷酸化AMPKα的Thr172位点:LKB1(liver kinase B1)和Ca MKKβ(Ca2+dependent protein kinase kinaseβ)[4]。LKB1与STRAD和MO25形成异型三聚体蛋白复合物,可以在体外直接磷酸化AMPKα亚基的Thr172[5]。研究发现,LKB1是骨骼肌和脂肪组织中的主要激酶,敲除LKB1基因导致骨骼肌中AMPKα2亚基Thr172磷酸化大幅降低[6]。Ca MKKβ可以受细胞内Ca2+浓度的调控,然而关于其在脂肪组织中对AMPK的调控作用还不是很清楚[6]。AMPK活性的调控见图2。

2.1 依赖AMP/ATP比值的调节

AMPKγ亚基是核苷酸结合亚基,具有3个结合位点,其中一个位点只能与AMP结合,而另外两个位点可以竞争性地结合AMP、ADP或ATP。AMP或ADP与γ亚基结合后,引起AMPK构象改变,促进AMPKα亚基Thr172位磷酸化;而ATP与γ亚基结合后,完全抑制AMPK的激活及AMP或ADP对AMPKα亚基Thr172位的磷酸化的促进作用[7]。因此,当机体经历缺氧、饥饿或者运动等导致AMP/ATP或者ADP/ATP比例升高时,AMPK被别构激活,并且通过增强AMPKα亚基Thr172位磷酸化进一步增强AMPK活性[8]。

5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)是目前广泛运用于研究的AMPK激动剂。AICAR被细胞摄取后,在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸衍生物ZMP。ZMP具有AMP样作用,可以激活AMPK。另外,二甲双胍(metformin)、白藜芦醇(resveratrol)、黄连素(berberine)和罗格列酮(rosiglitazone)等均可通过提高细胞中AMP/ATP或ADP/ATP的比值激活AMPK[9]。

2.2 不依赖AMP/ATP比值的调节

瘦素(leptin)和脂联素(adiponectin)是脂肪细胞分泌的多肽类激素,在调节摄食、能量消耗和神经内分泌功能方面起着重要作用。研究发现,在骨骼肌中,瘦素选择性地激活AMPK的α2亚基,早期通过直接作用于肌肉组织激活AMPK,晚期则通过下丘脑—交感神经系统发挥作用[9]。脂联素可以在骨骼肌和肝脏中激活AMPK,并促进其葡萄糖摄取和脂肪酸氧化。另外,adiponectin可以通过激活AMPK促进血管生成和抑制内皮细胞凋亡[10]。它们的作用均不导致AMP/ATP比值的升高,但其激活AMPK的具体信号转导机制仍不清楚。

3 AMPK对糖代谢和脂代谢的调节作用

能量代谢紊乱是造成肥胖、2型糖尿病及心血管疾病等代谢综合征的根本原因。AMPK能够调节机体能量代谢,维持能量的供求平衡,从而改善机体的能量代谢状态。近年来研究发现,AMPK可以作为治疗肥胖、2型糖尿病及某些癌症的药物靶点。因此,寻找可以调控AMPK活性的活性成分可能是预防和治疗肥胖、2型糖尿病等代谢综合征的一种新的手段[11]。

3.1 AMPK对脂代谢的调节作用

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶,可以催化乙酰辅酶A合成丙二酰辅酶A。AMPK被激活后,可以磷酸化ACC的Ser79位点抑制其活性,从而抑制脂肪合成。用AICAR或者瘦素长期作用于大鼠脂肪细胞可以增强ACC的磷酸化并降低其表达量,证明AMPK可以负调控ACC,降低脂肪酸合成过程[10]。AMPK还可以抑制脂肪酸合成酶(FAS)、丙酮酸激酶(PK)和甘油磷酸酰基转移酶(GPAT)等与脂肪合成有关的酶类的表达[12]。羟甲基戊二酸单酰Co A还原酶(HMGR)在胆固醇合成中发挥关键作用,是胆固醇合成的限速酶。研究表明,HMGR可以被AMPK磷酸化,抑制其功能,从而抑制胆固醇的合成。AMPKα2敲除小鼠的体重和脂肪积聚明显增加,提示AMPK的激活对肥胖有调节作用,AMPK激动剂有望应用于肥胖的治疗。

丙二酰辅酶A是脂肪合成的第一步产物,可以通过负反馈抑制CPT-1的活性,从而抑制线粒体的脂肪酸氧化。ACC活性的降低可以减少丙二酰辅酶A的表达,进而减弱其对CPT-1的抑制作用,加速脂肪酸氧化过程。研究表明,当用AICAR长时间激活AMPK时,AMPK上调PPARα及PPARδ的表达,进而增加线粒体数量,促进脂肪酸氧化过程。然而,当用AICAR短时间激活AMPK时,脂肪酸氧化受到抑制[13]。因此,AMPK对脂肪酸氧化过程的作用效果可能与其激活时间长短有关。

脂肪分解是脂肪细胞内中性脂质水解释放出甘油和游离脂肪酸的过程。ATGL和HSL是脂肪分解的主要限速酶,其中前者主要催化三酰甘油水解,后者主要催化二酰甘油水解。研究表明,AMPK在Ser406位磷酸化ATGL使其激活,促进脂质分解[14]。然而,AMPK可以磷酸化HSL的Ser565位点,阻止其被PKA激活,从而抑制其活性[15]。AMPK的这种作用是为了控制脂解作用不超过脂肪酸的氧化速率,防止过量堆积的脂肪酸重新合成脂肪,有利于减少脂质的异位沉积。当用AICAR短时间激活大鼠脂肪细胞中AMPK时,脂质分解速率降低,而随着作用时间的增长脂质分解速率开始增强[16]。

综上所述,AMPK是调节机体能量代谢的重要因子,被激活后引起一系列与能量代谢有关的因子的表达或磷酸化。AMPK信号通路在脂质代谢中具有非常重要的作用,它一方面减少脂肪酸和三酰甘油的合成,另一方面促进脂肪酸的氧化和三酰甘油的分解,维持机体脂代谢稳定。AMPK通路对脂肪代谢的调节作用见图3。

3.2 AMPK对糖代谢的调节作用

葡萄糖是糖在血液中的运输形式,在机体糖代谢中占有重要的地位。肝脏、骨骼肌和脂肪组织是胰岛素作用的主要靶器官,是机体摄取葡萄糖的主要场所,也是糖酵解、糖异生及糖原合成等糖代谢过程发生的重要场所。研究表明,葡萄糖稳态是肝脏葡萄糖产生和周围组织葡萄糖摄取保持平衡的结果。

注:→表示促进;———l表示抑制。

骨骼肌是胰岛素刺激葡萄糖摄取的主要位点。研究发现,肌肉收缩及AICAR均能增加大鼠肌肉中葡萄糖的摄取,其机制可能是通过促进GLUT4向细胞膜转移来实现的。目前,关于AMPK对脂肪细胞摄取葡萄糖的研究并不多。研究发现,在3T3-L1细胞中,当AMPK被AICAR激活后,细胞对葡萄糖的摄取能力增强,但胰岛素通路无变化[17]。在原代培养的大鼠脂肪细胞中,脂联素通过激活AMPK增加葡萄糖的摄取,且该作用能被AMPK的抑制剂阻断。然而,AMPK的抑制剂并不能影响胰岛素刺激的葡萄糖摄取[18]。因此,AMPK通过胰岛素非依赖机制促进葡萄糖摄取,其作用机制可能包括以下两种方式:1)诱导GLUT4向膜转移;2)通过磷酸化转录因子,促进GLUT4基因的表达[10]。

糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应,是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解途径[19]。磷酸果糖-2-激酶(PFK)是糖酵解的限速酶,催化6-磷酸果糖第一位C上的磷酸化生成1,6-二磷酸果糖。灌注心肌试验结果表明,缺血或其他代谢解耦联剂激活AMPK时,PFK2的活性及2,6-二磷酸的含量也随之增加[20]。另外,体外纯化的AMPK可提高PFK2的磷酸化,进一步证明AMPK可以直接参与糖酵解过程[21]。

糖原是葡萄糖在动物体内的储存形式,也是肌肉运动的重要能源物质。糖原合成酶(GS)是糖原合成的限速酶。研究表明,在肌肉组织中,AMPK能够在Ser7和Ser10位点磷酸化GS使其活性降低[22]。研究发现,AICAR能够刺激GS Ser7位点的磷酸化,降低其活性;而用AICAR处理敲除了AMPKα2亚基的小鼠骨骼肌时,GS Ser7位点磷酸化未增强。因此,在骨骼肌中AMPK可能通过降低GS活性抑制糖原的合成。

糖异生是指非碳水化合物(乳酸、丙酮酸、甘油等)转变为葡萄糖或糖原的过程。肝脏的糖异生是由多种酶调节的,包括磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PRPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase),而AMPK的活化可以抑制这两种酶的表达。肝脏AMPKα2敲除的小鼠出现葡萄糖耐受现象,并且在禁食时仍处于高血糖状态,推测是由于与糖异生有关的酶活性升高导致的[23]。

综上所述,AMPK可以通过促进葡萄糖摄取和糖酵解过程抑制糖异生和糖原合成过程,从而降低血糖水平,维持机体葡萄糖稳态。

4 结语

AMPK 篇2

动物机体宰后肌肉能量状态的改变可能会激活AMPK。试验通过测定宰后羊肉0～24 h过程中AMPK活性及糖酵解各指标的变化情况, 研究AMPK活性与糖酵解的关系, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试剂

选用18月龄左右的蒙古杂交羊3只 (购自呼和浩特市某屠宰场) , 屠宰、放血后迅速取后腿股二头肌, 切成小块后投入液氮中冷冻, 然后放入-80 ℃冰箱保存, 待用。

绵羊AMPK酶联免疫吸附试剂盒, 购于武汉中美科技有限公司;肌/肝糖原测定试剂盒、乳酸测定试剂盒、己糖激酶 (HK) 测定试剂盒、丙酮酸激酶 (PK) 测定试剂盒和乳酸脱氢酶测定试剂盒, 购于南京建成科技公司。

D-甘露醇、Tris-base、乙二醇四乙酸酯 (EGTA) , 购于Amresco公司;二硫苏糖醇 (DTT) , 购于Merck公司;其他试剂均为优级纯或分析纯。

1.2 样品的制备及测定项目

从-80 ℃冰箱中取出股二头肌, 放置在4 ℃冰箱内保存, 然后分别在0, 4, 8, 12, 24小时时测定各项理化指标, 每项指标做3个重复。

1.2.1 AMPK活性

AMPK的提取参照K.R.Underwood 等[3]的方法, 活性测定的试验操作和结果计算参照试剂盒说明书进行。

1.2.2 糖酵解理化指标

乳酸的测定中肉样的前处理参照Q.W.Shen等[4]的方法。肌糖原和乳酸含量测定的试验操作和结果计算参照试剂盒说明书进行。pH值的测定采用常规方法。葡萄糖-6-磷酸测定参照周岩伟 [5]的方法, 糖酵解潜力 (Glycolytic potential, GP) 的计算公式为GP=2× (肌糖原+葡萄糖+葡萄糖-6-磷酸) +乳酸[6]。

1.2.3 糖酵解酶活性

己糖激酶 (HK) 、丙酮酸激酶 (PK) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 和匀浆蛋白质含量测定的试验操作和结果计算参照试剂盒说明书进行。

1.3 数据统计分析

试验数据采用SAS软件进行方差分析, 邓肯氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 宰后羊肉的AMPK活性变化

屠宰后动物机体供氧中断, 肌肉的糖代谢由有氧氧化转变为无氧酵解, 生成的ATP大量减少, 这种能量状态的改变会激活AMPK。宰后羊肉的AMPK活性变化呈先升高后下降的趋势, 见图1。宰后1小时时的AMPK活性最高, 之后逐渐下降。Q.W.Shen等[7]报道, 宰后猪肉的AMPK活性在0.5～1.0 h时达到最高, 之后开始下降。

2.2 宰后羊肉的糖酵解

动物屠宰后的糖酵解将糖原分解为乳酸以维持ATP水平, 导致pH值下降。因此, 宰后羊肉的肌糖原含量和pH值一直都是下降的, 而乳酸含量是不断升高的。具体见表1。

注:同列数据肩标字母相间表示差异极显著 (P<0.01) , 相邻表示差异显著 (P<0.05) , 含有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

2.3 宰后羊肉糖酵解中酶活性的变化 (见图2～4)

注:活性为每克肌肉匀浆蛋白质中含有的酶单位。

HK和PK是糖酵解过程中的限速酶, LDH是催化糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸的重要酶。糖酵解过程中的3种酶宰后都呈现先升高后降低的变化规律, 并且3种酶的活性都是在宰后1小时时达到最高, 之后逐渐下降。

注:活性为每克肌肉匀浆蛋白质中含有的酶单位。

注:活性为每克肌肉匀浆蛋白质中含有的酶单位。

3 结论

虽然在设定的时间段中未发现AMPK活性的大幅度提高, 但绵羊宰后体内的AMPK被迅速激活, 活化的AMPK促进了宰后羊肉糖酵解的进行, 提高了糖酵解过程中关键酶的活性, 促进了糖酵解底物的分解和产物的生成。

摘要：为了研究宰后羊肉一磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMPK) 活性与糖酵解指标的相关性, 以探讨肌肉宰后生理机理, 试验选择18月龄左右的蒙古杂交羊, 屠宰后取后腿股二头肌, 分别于0, 1, 4, 8, 12, 24小时时测定其AMPK活性和糖酵解各理化指标。结果表明:宰后能量状态的改变激活了AMPK, 活化的AMPK促进了宰后羊肉糖酵解, 提高了糖酵解过程中关键酶的活性, 促进了糖酵解底物的分解和产物的生成。

关键词：一磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMPK) ,糖酵解,宰后生理

参考文献

[1]FRYER L G, CARLING D.AMP-activated protein kinase and themetabolic syndrome[J].Biochem Soc Trans, 2005, 33 (2) :362-366.

[2]CARLING D.AMPK[J].Cur Biology, 2004, 14 (6) :220.

[3]UNDERWOOD K R, MEANS W J, ZHU M J.AMP-activatedprotein kinase is negatively associated with intramuscular fat contentin longissimus dorsi muscle of beef cattle[J].Meat Sci, 2008, 79:394-402.

[4]SHEN Q W, GERRARD D E, D M.Compound C, an inhibitor ofAMP-activated protein kinase, inhibits glycolysis in mouse longis-simus dorsi postmortem[J].Meat Sci, 2008, 78:323-330.

[5]周岩伟.促脂肪沉积剂对育肥牛的生产性能和肉品质影响的研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学, 2006.

[6]MONIN G, SELLIER P.Pork of low technological quality with anormal rate of muscle pH fall in the immediate postmortem period:the case of the Hampshire breed[J].Meat Sci, 1985, 13:49-63.

AMPK 篇3

腺苷酸活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinases, AMPK) 是细胞内控制能量平衡的感受器[5], 具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、抗增殖等多种生物学作用[6,7]。在香烟烟雾提取物 (cigarette smoking extract, CSE) 诱导正常人支气管上皮细胞 (normal human bronchial epithelial cells, NHBE) 发生内质网应激, 并导致细胞凋亡的过程中, AMPK的表达是否具有抗凋亡作用, 这种抗凋亡作用是否通过减弱内质网应激而实现均尚不明确。本研究旨在探讨AMPK在CSE诱导的支气管上皮细胞发生内质网应激导致凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

NHBE细胞株购于中南大学湘雅医院细胞中心。

1.1.2 主要试剂

市售芙蓉牌香烟, 每支焦油含量为11 mg, 烟气烟碱含量为0.9 mg。Compound C购自美国Sigma公司。鼠单克隆CHOP抗体、兔p-AMPK抗体、AMPK抗体购自美国CST公司。兔多克隆Caspase 4抗体购自美国Proteintech公司。Western blot试剂盒购自碧云天生物技术研究所。蛋白电泳分析系统为美围Bio-Rad公司产品。流式细胞学检测采用BD公司canto 2流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理

NHBE细胞株解冻复苏后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液, 吹散制成细胞悬液后, 分种于培养皿中, 置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度环境的培养箱中贴壁培养, 每隔2~3 d换培养液1次, 待细胞生长达到80%~90%融合时, 进行实验干预。

1.2.2 参考课题组前期实验及相关文献的方法

将3支芙蓉牌卷烟依次点燃, 通过自制的负压装置将烟雾溶于3 m L的PBS中, 以0.22μm混合纤维素微孔滤膜正压过滤除菌。用波长为450 nm的紫外分光光度计测定其吸光度值, 保持每次CSE吸光度值 (OD) 固定, 干预前30 min制备CSE, 浓度设定为100%, 现制现用[8,9]。

1.2.3 CCK8法检测CSE细胞毒力

制备NHBE单细胞悬液, 接种于96孔板中, 每孔100μL约5 000个细胞, 接种12 h后每孔加入100μL含不同CSE浓度的培养液或相应对照液, 分设试剂对照组、NHBE细胞对照组及7个实验组, 实验组CSE终浓度分别为1%、2%、5%和10%, 分设6、12、18及24 h作用时间组。按常规加CCK-8溶液处理, 酶标仪检测450 nm波长的吸光度 (A450) , 按下列公式计算抑制率:细胞存活率/%=[ (试验孔-空白孔) / (对照孔-空白孔) ]×100%。

1.2.4 流式细胞凋亡率检测

收集对照组及干预后的NHBE细胞, 用冰PBS洗涤细胞2次, 并用1×结合缓冲液悬浮细胞浓度至1×106细胞/m L。严格按照BD annexin V-FITC Kit说明书操作, 具体步骤为:取100μL上述细胞至5 m L试管中, 加5μL annexin V-FITC和5μL碘化丙啶 (propidiumiodide, PI) , 置室温闭光孵育15 min后, 每管加入400μL1×结合缓冲液, 于1 h内上流式细胞仪检测。

1.2.5 Hoechst 33342双染法检测细胞凋亡

用冰PBS洗涤各干预组细胞2次, 取1 m L细胞染色缓冲液、5μL Hoechst染色液和5μL PI置于离心管摇匀, 加入上述处理好的NHBE细胞中混匀, 避光冰浴30 min后荧光显微镜下观察。

1.2.6 Western blot方法检测各组NHBE细胞AMPK、p-AMPK、CHOP、Caspase4的表达

严格按照Western blot操作方法进行蛋白SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭及一抗 (p-AMPK 1∶500, GAPDH1∶1 000, CHOP 1∶500, Caspase4 1∶500) 、二抗孵育, 滴加ECL发光液后在荧光成像仪下发光成像拍照, Image J图像分析软件进行蛋白条带吸光度分析, 将指标CHOP、Caspase4的吸光度值与GAPDH条带吸光度值 (IOD) 的比值, p-AMPK的吸光度值与AMPK条带吸光度值的比值作为其蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

全部数据处理分析经SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料数据均采用均数±标准差 (±s) 表示, 用采用单因素方差分析, 组间两两比较用LSD-t检验;以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 不同CSE时间、浓度梯度对NHBE细胞存活率的影响

采用CCK-8法检测细胞的CSE细胞毒性, 预设不同CSE浓度 (0%、1%、2%、5%及10%) 和不同的干预时间点 (6、12、18及24 h) , 结果显示随着干预浓度增高, 存活率越低, 且随着干预时间延长而降低。浓度为1%的CSE干预后细胞存活率下降不明显;浓度为5%和10%的CSE在24 h细胞存活率分别只有41.9%、14.7%, 细胞存活率过低, 不能进行后续的干预实验。2%的CSE干预24 h, 无明显细胞毒性作用且不同的时间区间细胞存活率有下降趋势, 可以用于后续的实验。因此, 确定HBE细胞最佳干预浓度为2%, 最佳干预时间为24 h, 具体见图1。

2.2 AMPK特异性抑制剂Compound C干预浓度选择

参考相关研究文献选定的Compound C浓度, 预设0、5、10、15及20μM共5个浓度梯度, Westernblot方法检测AMPK表达的抑制率。结果显示:随着Compound C浓度增加, 磷酸化蛋白p-AMPK表达逐渐降低, 当抑制剂浓度达到10μM时, p-AMPK蛋白表达趋于稳定, 此时, p-AMPK抑制率达基本达到最低, 且对细胞无明显毒副作用, 可用于后续实验的进行, 故选择10μM作为Compound C的干预浓度, 具体见图2。

2.3 Western blot检测NHBE细胞p-AMPK、AMPK、CHOP、Caspase4表达情况

p-AMPK在Control、Compound C、CSE、Com-pound C+CSE组中表达逐渐下降, 两两比较差异有显著性 (P<0.05) 。CSE组Caspase4、CHOP蛋白表达对比正常对照组显著增加, 差异有显著性 (P<0.05) ;同样的差异也在Compound C+CSE与CSE组发现, 差异有显著性 (P<0.05) 。而Compound C组与正常对照组之间CHOP、Caspase4蛋白表达差异无显著性 (P>0.05) , 具体详见图3。

2.4 细胞形态观察结果

荧光显微镜下对照组及Compound C组NHBE细胞的Hoechst染色匀淡而均匀, 而经CSE处理的细胞, 细胞核因染色质固缩从而结合Hoechst的能力增强, 荧光显微镜下经紫外光的激发可看到细胞核呈浓染蓝光, 表现为染色质固缩特征的凋亡细胞, Compound C+CSE细胞凋亡特征明显, 比例明显增高, 可见散在的坏死细胞, 具体见图4。

2.5 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果

干预24 h后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率, 流式检测结果显示:CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡以早期凋亡为主, 正常对照组早期凋亡率为 (1.480±0.217) ;CSE组和Compound C+CSE组细胞早期凋亡率分别为 (26.860±2.946) 和 (43.620±2.536) ;CSE组对比正常对照组, Compound C+CSE组对比CSE组, 差异均有显著性 (P<0.05) ;以上三组总凋亡率分别为 (3.020±0.370) 、 (29.760±0.764) 和 (45.320±2.259) , 两两比较差异均有显著性 (P<0.05) ;Compound C组无论早期凋亡率和总凋亡率与正常对照组之间差异均无显著性差异 (P>0.05) , 具体见图5。

3 讨论

据估计, 到2030年, 吸烟相关性死亡约占全球总死亡人数的30%[10], 作为慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 主要危险因素之一, 香烟烟雾成分复杂。除已知有60多种为致癌物外, 还有大量低致癌性化合物 (如乙醛、2, 3-丁二烯、金属砷等) , 它们在肺损伤中发挥整体效应。支气管上皮细胞是吸烟损伤的直接对象, 可导致气道慢性炎症, 诱导细胞凋亡等[11]。香烟烟雾诱导的肺结构细胞凋亡引起肺结构破坏是COPD发生的重要机制之一。回顾既往文献报道, CSE诱导的细胞凋亡涉及到的肺结构细胞有支气管上皮细胞、A549细胞、血管内皮细胞等[12,13,14]。本研究通过构建CSE诱导HNBE细胞凋亡模型, 模拟吸烟导致COPD发病过程, 探讨AMPK在CSE诱导的NHBE细胞凋亡中的调节作用。

ERS介导的细胞凋亡参与慢性阻塞性肺疾病患者肺组织破坏和气道重塑已经得到多项研究证实。本课题组前期在香烟烟雾诱导的COPD大鼠模型中发现, 肺组织ERS标志性伴侣分子GRP78以及CHOP、Casepase12显著表达, 以肺泡上皮细胞为代表的肺泡结构细胞凋亡增多明显[15]。

AMPK抑制内质网应激介导的细胞凋亡作用已经在多种组织细胞中得到证实, 涉及到的组织细胞有人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞和心肌细胞等[16,17,18]。该研究在体外培养NHBE细胞并给予CSE处理模拟COPD的发病过程, 结果发现NHBE细胞凋亡率与CSE干预时间和浓度呈正相关, 这可能直接决定了长期吸烟患者的肺气肿和COPD高发生率。长期的香烟暴露, 不仅引起气道高分泌还引起黏液黏稠, 增加气道细菌易感性, 共同加重COPD病程[19]。CSE干预后, CSE组ERS标志性蛋白CHOP和ERS特有的人类细胞凋亡蛋白酶Caspase4的表达较正常对照组显著增高, 提示CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡中确实存在ERS的发生, 外源性应激持续刺激导致生物体内内质网应激相关凋亡蛋白酶高表达和终止内质网应激发生的伴侣蛋白 (钙网调节蛋白、免疫球蛋白结合蛋白等) 相对低表达共同促进细胞凋亡的发生[20]。Compound C干预后, Compound C+CSE组较Compound C组CHOP及Caspase4显著增高。流式细胞学提示细胞凋亡以早期凋亡为主。此外, 无论早期凋亡还是总凋亡率空白对照组、CSE组、Compound C+CSE组流式细胞学检测的早期凋亡率依次增加, 差异有显著性 (P<0.05) ;Hoechst染色细胞形态学观察发现, 与对照组相比, CSE组、Compound C+CSE组细胞均出现典型的凋亡特征, 细胞核呈现浓染、颗粒块状荧光及明显的形态裂化;Compound C+CSE组与其他组相比, 以染色质固缩为特征的细胞凋亡更加明显并可见散在的坏死细胞, 而Compound C单纯干预组在细胞形态学、ERS标志蛋白表达、细胞凋亡率与正常对照组均无显著性差异 (P>0.05) 。抑制细胞AMPK表达后支气管上皮细胞对外源性刺激CSE的内质网应激发生强度明显增加及凋亡比率增加, 提示AMPK在香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞凋亡中可能发挥保护作用。AMPK抗细胞凋亡的机制较为复杂, 迄今尚未完全阐述, 可能的机制如下:AMPK的激活抑制FOXO1乙酰化, 上调ORP150表达;抑制CCAAT/增强子结合蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein, C/EBP) 的表达, 阻止C/EBP核转位;下调IκB激酶α/β活性抑制NF-κB的诱导激活;抑制ROS-HIF-VEGFA信号轴, 降低血管通透性, 减少炎性细胞和炎性介质的从血管内的渗出等[21,22,23]。

COPD的病情是一个以氧化应激、炎症反应为特点的疾病。氧化应激、炎症反应作为香烟烟雾所致的ERS凋亡事件的上游事件, 通过启动炎症及凋亡信号通路促进细胞凋亡。本实验通过细胞实验模拟COPD发病机制, 初步显示AMPK在香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞凋亡中具有保护性作用。促进AMPK高表达可能有助于缓解各种有害刺激所致的肺结构细胞凋亡的产生。细胞凋亡贯穿于COPD始终, 对ERS介导细胞凋亡相关通路进行调控可望改善COPD病程。作为初步探索, 本实验研究有许多有待完善的地方, COPD的发生是内因和外因诸多因素综合作用的结果, 该实验仅从细胞学角度阐述AMPK在COPD发生中的地位, 有待于动物研究进一步阐明。