有效成分分析

关键词：

有效成分分析（精选十篇）

有效成分分析 篇1

随着人民生活水平的不断提高,对食用油的质量有了很高的要求,栀子不仅是一种药材和色素原料,也是一种含油丰富的新油源,含油量与大豆接近,栀子油脂肪酸主要组分是亚油酸、油酸、棕榈酸,具有调节血压、降低血清胆固醇、调节脂肪代谢等作用,受到广大消费者喜欢。目前栀子油渣大多作为废弃物处理,仅少量添加到饲料中得以利用,经济效益低。本文对栀子油渣的主要有效成分京尼平苷酸、山栀子苷B、绿原酸、栀子苷、西红花苷I、西红花苷Ⅱ和西红花酸7种物质进行分析,为进一步综合利用栀子的研究提供理论依据。

材料与仪器

实验材料

栀子果和栀子油渣,由浙江星光农业开发有限公司提供。

乙腈(MERCK,色谱纯)、甲醇(MERCK,色谱纯)、乙醇(分析纯)、二次蒸馏水(自制),绿原酸(CSA号:327-97-9,纯度HPLC≥98%)、山栀子苷B(CSA号:24512-62-7,纯度HPLC≥98%)、栀子苷(CSA号:24512-63-8,纯度HPLC≥98%)、西红花酸(CSA号:27876-94-4,纯度HPLC≥98%,购于南京春秋生物工程有限公司)、京尼平苷酸(CSA号:27741-01-1,纯度HPLC≥98%)、西红花苷I(CSA号:94238-00-3,纯度HPLC≥98%)、西红花苷Ⅱ(CSA号:55750-84-0,纯度HPLC≥98%,购于上海金穂生物科技有限公司)。

仪器设备

Agilent1260型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)、电子天平、离心机、粉碎机。

方法与结果

供试样品溶液的制备

取试样约100 g,粉碎,过40目筛,精密称量1.00 g,用80 m L 50%乙醇洗入100 m L容量瓶中,常温下提取60 min,每隔5 min振荡一次,用50%乙醇定容。3000 r/min离心10 min,取上清液过0.45μm有机性滤膜针头滤器(弃去初滤液),滤液待测。

仪器条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250 mm,5μm)。流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)。梯度洗脱:0~18 min(8%~15%A),18~25min(15%~23%A),25~40 min(23%~35%A),40~50 min(35%~50%A),50~65 min(50%A)。检测波长:238、330、440nm。柱温:30℃。检测器采集范围:200~480 nm。流速:0.8 m L/min。进样量:10μL。

标准曲线与检出限

按上述条件预分析供试品,根据各物质相应比例制备对照品(色谱图见图1)。精密称量对照品制备混标溶液:京尼平苷酸(37.5μg/m L)、山栀子苷B(38.8μg/m L)、绿原酸(37.4μg/m L)、栀子苷(1 582μg/m L)、西红花苷I(184μg/m L)、西红花苷Ⅱ(40μg/m L)与西红花酸(18.2μg/m L)。将标准对照液逐级稀释后按2.2测定峰面积,以峰面积为Y坐标,对照品浓度(μg/m L)为X坐标,绘制标准曲线进行回归,以3倍信噪比计算检出限。结果表明7个化合物线性关系良好,检出限满足检测的要求(结果见表1)。7个化合物在不同波长下的HPLC色谱图如图1、图2、图3所示。

注:1-京尼平苷酸;2-山栀子苷B;4-栀子苷;I-对照品;Ⅱ-栀子油渣样品

注:3-绿原酸;I-对照品;Ⅱ-栀子油渣样品

注:5-西红花苷I;6-西红花苷Ⅱ;7-西红花酸;I-对照品;Ⅱ-栀子油渣样品

样品测定

准确称量栀子果和栀子油渣样品各1.00 g(一式3份),按上述条件进行分析,测定7种物质的含量;按《食品安全国家标准食品中水分的测定》(GB 5009.3-2010)测定其水分含量,栀子果和栀子油渣水分含量分别为13.50%、9.11%。水分带入计算,取三次结果取平均值(以干基计),结果见表2。

从表2中可以看出,西红花酸在栀子油渣中未检出,其他6种成分两个样品中均检出。

经压榨后,京尼平苷酸、山栀子苷B、栀子苷和绿原酸含量有所增加,增幅分别为11.4%、10.3%、10.7%和14.5%,说明这4种物质在榨油过程中比较稳定,由于除去油脂后,总的质量减少,含量增加。西红花苷I和西红花苷Ⅱ含量有所减少,减幅分别为33.7%、38.89%,推测西红花苷I和西红花苷Ⅱ热不稳定,在榨油过程中部分损失。

精密度和稳定性试验

取2.5中栀子油渣和栀子果供试溶液,各连续进样5次,以峰面积计算精密度(RSD),7种物质峰面积的RSD均小于3%,表明仪器和色谱条件良好。取栀子果试样溶液分别在0、4、12、24 h测试,7种物质的相对偏差均小于5%,表明2.5中制备试样液的方法稳定性良好。

回收率试验

以栀子油渣样品为空白,分别加入2.0 m L 2.3中的混合对照品溶液,按2.1和2.2方法分析,计算回收率,结果见表3。由表3可见,京尼平苷酸、山栀子苷B、绿原酸、栀子苷、西红花苷I和西红花苷Ⅱ6种物质回收率均在95%~110%之间,说明此方法适合这6种物质的含量分析;西红花酸回收率只有34.8%,明显低于其他6种物质,说明此方法不适合西红花酸的分析,需进一步开发适合西红花酸的前处理方法。

小结

目前对栀子有效成分的研究和提取加工主要是栀子苷和黄色素,杨奎、苏伟、方尚玲、孙旭群等人研究表明栀子苷具有抗炎症、抗氧化、保肝和利胆作用。栀子黄色素的主要成分是西红花苷I和西红花苷Ⅱ,广泛应用于面制品等食品着色,它不仅安全无毒还可补充人体维生素,是一种营养型着色剂。本文通过对栀子油渣的有效成分分析,结果表明栀子油渣中还含有较高的栀子苷、西红花苷I和西红花苷Ⅱ,可见栀子油渣可以做为提取加工栀子苷和黄色素的原料。另外,研究表明栀子油渣相对于栀子果实而言,京尼平苷酸、山栀子苷B、栀子苷和绿原酸4种物质的含量随着比重的增加而增加,西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量随着比重的增加而减少。然而对于栀子黄色素的要求则是京尼平苷酸、山栀子苷B、栀子苷和绿原酸的含量越低越好,因此对栀子黄色素提取、分离的工艺要求更高。

有效成分分析 篇2

[摘要]中药及其制剂是几千年来与疾病作斗争的有力武器，服用中药及其制剂后在体内的变化规律，其药物浓度和药理作用的相互关系如何，其疗效与剂量、疗效与毒副反应的关系又如何，有待进一步深入研究，本文对近年来中药有效成分体内分析方法的研究进展做一综述。

[关键词]中药有效成分；体内分析方法；评价体系

随着药学学科的发展，药物研究从过去以化学物质研究为中心，逐渐转移到化学物质与生命科学相结合的研究。中医药要走向世界，就要求中药及其制剂必须用科学的手段来阐明。中药及其制剂不仅需要定性、定量、杂质检查等质量要求，也逐渐需要了解其在体内的信息。但其有效成分进入生物体内经代谢后其浓度均较低，因此首先遇到的和必须解决的问题是如何测定体内这些微量成分。

在生物样品内建立、完善和提高中药及其制剂内化学成分的分析方法学是解决上述问题的实验手段和技术基础。根据血药浓度设计给药方案，以便更好地解决药物使用过程的个体差异，使临床用药趋向于更加安全、合理和有效。因此，建立科学、合理、有效的中药有效成分体内分析方法对阐明中药及其制剂的药理药效具有十分重要的意义。本文将对中药有效成分体内分析方法的研究进展做一综述。

1主要体内分析方法

1.1紫外一可见分光光度法：紫外一可见分光光度法操作简便、快速、准确度较高，同时由于仪器价格相对较低，因此在体内药物分析中应用广泛。但由于该方法不具备分离能力，使得其专属性在体内药物的测定中收到一些影响。

1.2荧光分光光度法：药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。利用这个特性，可以定性鉴别药物。同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长的光，则可发射出相同波长的荧光。

1.3气相色谱法：气相色谱法具有分离和分析两种功能的测定技术，同时具有选择性好、灵敏度高、用样量少、分析速度快和应用范围广等特点，特别适合组分比较复杂的生物样品中微量有机药物及其代谢物的分离测定。

1.4高效液相色谱法：高效液相色谱法以经典液相色谱为基础，采用了高压送液泵、微型填料和各种高灵敏检测器，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等特点。

1.5高效毛细管电泳法：高效毛细管电泳法是经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。该方法灵敏度高，高效，分离速度快，进样量只需纳升级，只需少量流动相和价格低廉的毛细管。特别适合生命科学领域中对多肽、蛋白质等的分离分析要求，因此，在体内药物分析中有着重要的应用与发展前景。

1.6色谱一质谱联用技术：色谱一质谱联用技术可以进行这样的分析工作。色谱一质谱联用仪主要由色谱仪、接口、质谱仪、电子系统、记录系统和计算机系统六大部分组成。

气相色谱一质谱联用(GC－MS)分析的灵敏度高，适合于低分子化合物(分子量＜1000)分析，尤其适合于挥发性成分的分析。

液相色谱－质谱联用(LC－MS)不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化工作，而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量的药物代谢物，可以迅速、方便地应用于研究。

1.7超高效液相色谱：超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)是指一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105kPa)的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。

2体内药物分析方法的评价体系

对体内药物分析方法的可行性和可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。在实际工作中评价一个体内药物分析方法的优劣，一般常用精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性以及可测浓度范围等指标进行考察。

2.1准确度：准确度是考察和评价分析方法的最基本要点之一，表示测定结果与真值的符合程度。由于不可能绝对地确知样品的“真值”，因而常用回收率数值反映测定的准确程度。

2.2精密度：精密度是指同一均质样品的测定结果与平均值的偏离程度，或者说多次测定结果彼此符合的程度，它表示分析方法的可重复性。

2.3灵敏度：灵敏度是指一种分析方法可检出有关化合物的最小量，常用检测限和定量限来表示。

检测限是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度。通常以被测信号和背景噪音比为3时的被测物的绝对量来表示。

定量限是指保证具有一定可靠性前提下，分析方法能定量测定出样品中药物的最低量。在体内药物分析中，通常以标准曲线的最低浓度点作为定量限。

2.4专属性：分析方法的专属性又称选择性，通常是指样品中含有其他共存物质时，分析方法能够准确、专一地测定出药物的能力。即测得的响应值应该是属于被测物所特有的，否则就易受干扰。

2.5线性范围：线性范围是指一种分析方法的精密度、准确度都符合要求的试验结果成线性时供试物浓度的变化范围。标准曲线的线性程度目前仍广泛采用相关系数(r)表示。标准曲线应该覆盖样品可能的浓度范围。

2.6稳定性：稳定性是指药物的稳定性，是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数。药物在生物样品中的稳定性包括：在室温条件下的稳定性要超过在冷冻条件下的稳定性；反复冷冻一解冻条件下的稳定性的考察。

2.7方法的相关性：对同一种样品，用已证明有相当专属性的分析方法与新建立的分析方法同时进行测定，然后比较两种分析方法测得结果的相关程度。

对体内药物分析方法的考察还应从分析方法的可重复性、耐用性、操作的难易、每个样品测定耗费时间、仪器设备要求及成本费用多少等方面进行综合评价。

3结语

中药有效成分体内分析方法及其评价体系的建立，为阐明中药有效成分体内代谢过程和中药发挥药效的物质基础提供了有力的工具。通过对中药有效成分的体内分析，确立中药及其复方制剂的科学，使中药及其制剂从总体水平上向科学化和规模化前进。

参考文献

[1]魏璐雪，杜树山，中药及其制剂体内分析研究必要性的思考，北京中医药大学学报，1999，22(3)：52

[2]张君仁，臧恒昌，主编，体内药物分析，北京，化学工业出版社，2002

[3]吕春艳，张兰桐，液－质联用技术在中药与天然产物代谢研究中的应用，中国药学杂志，2006，41(4)：241－244

川渝两地吴茱萸的有效成分测定分析 篇3

吴茱萸主要分布在贵州、四川、云南、湖北、湖南、浙江、福建、广东、广西、江西等地区, 商品名有常吴萸、川吴萸、吴萸或吴茱萸, 别名种类众多。其种类有8种, 分属于芸香科吴茱萸属及花椒属, 药材外形较相似[3], 但化学成分为吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素含量各有不同, 功效也有一定的差异。药典2010版采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂, 以乙腈—水—四氢呋喃—冰醋酸 (41∶59∶1∶0.2) 为流动相, 检测波长225nm为条件, 测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的含量。由于检测波长的原因, 该法噪声大, 易拖尾, 我们改用腈—四氢呋喃-0.02%磷酸水溶液 (22∶13∶65) 、1.0mL/min的效果更好。

1 仪器和材料

实验材料:吴茱萸药材分别采自四川、重庆、贵州、湖南、广西和江西, 所用实验材料均经过四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定。

分析仪器:118摇摆式400g装高速中药粉碎机 (浙江瑞安市环球药械厂) 、FA1004型药物分析天平 (上海明桥精密科学仪器有限公司) 、超声震荡提取仪 (JBT/C-YCL400T/3PCD) 、超声波清洗仪 (AP-01) 、高效液相色谱仪 (Agilent 1200) 。

试剂:乙醇、甲醇、磷酸为国产分析纯, 乙腈、四氢呋喃为进口分析纯 (美国TEDIA公司) , 水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

Zorbax Eclipse C18色谱柱 (4.6×150mm, 5μm) , 流动相为乙腈—四氢呋喃—0.02%磷酸水溶液 (22∶13∶65) , 流速为1.0mL/min, 检测波长为220nm, 进样量为5μL, 理论板数按吴茱萸碱峰计算不低于3000。色谱图见图1和图2。

注:1为柠檬苦素;2为吴茱萸碱;3为吴茱萸次碱。

注:图中分别为柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱。

2.2 对照品的制备

精密称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素适量, 置25mL容量瓶中, 用乙醇醇溶解并稀释至刻度, 摇匀制成0.02592mg/mL的吴茱萸碱、0.04268mg/mL的柠檬苦素、0.01062mg/mL的吴茱萸次碱储备液, 置于4℃冰箱备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取供试品粉末 (过50目筛) 约0.2g, 置50mL量瓶中, 加入80%乙醇45mL, 浸泡1h, 超声处理40min (功率250W, 频率33kHz) , 冷却至室温, 加80%乙醇至刻度, 摇匀, 过0.45μm微孔滤膜取得续滤液, 置于4℃冰箱备用。

2.4 线性关系

分别精密吸取混合对照品溶液2μL、4μL、8μL、16μL、20μL注入液相色谱仪, 记录峰面积, 进样量为横坐标进行线性回归, 得到吴茱萸回归方程:Y=10770X-39.804, R=0.9997, 线性范围0.051—0.518μg;吴茱萸次碱回归方程为:Y=5541.3X+4.8767, R=0.9995, 线性范围0.021—0.212μg;柠檬苦素回归方程:Y=417.53X-3.34, R=0.9998, 线性范围0.085—0.427μg, 结果证明线性关系良好。

2.5 标准曲线绘制

分别吸取浓度为5μg/mL的吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素标准品溶液2μL、4μL、8μL、16μL、20μL进行高效液相色谱仪分析以对照品进样量为横坐标以峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液, 进样5μL, 重复进样5次, 记录峰面积, 结果吴茱萸碱RSD值为0.9%, 吴茱萸次碱RSD值为1.5%, 柠檬苦素RSD值为1.1%。

2.7 重复性试验

取同批样品5份, 按照2.3供试品溶液制备方法经行处理后, 在2.1项条件下测定, 结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的RSD分别为0.5%、0.9%和0.7%。

2.8 稳定性试验

取同一批样品制备后在0、1h、2h、4h、12h、24h进样, 结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素在24h内稳定性良好, RSD分别为1.3%、1.1%和0.9%。

2.9 回收率试验

取已知含量的样品5份, 精密称取100mg, 分别精密加入吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素对照品适量, 按照2.3制备样品样品溶液, 在2.1的条件下测定其含量, 结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的回收率分别为96.98%、99.57%和100.50%, RSD为1.2%、1.9%和2.1%。

2.1 0 样品含量的测定

样品含量测定见表1。

3 结果分析与讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验采用反相高效液相色谱法和药典方法的仪器噪声较大, 基线不易跑平, 故将流动相改为乙腈—四氢呋喃-0.02%磷酸水溶液 (22∶13∶65) , 流速1.0mL/min, 检测波长220nm, 柱温35℃, 可较好地分离吴茱萸的3种有效成分, 基线易跑平。

3.2 含量测定结果分析

重庆吴茱萸的总碱含量平均为0.9829%, 柠檬苦素含量平均为0.4989%;川产吴茱萸的总碱含量平均为1.340%, 柠檬苦素含量平均为0.2946%;总体平均总碱含量为1.1615%;平均柠檬苦素含量为0.4138%。石虎和疏毛吴茱萸的果柄均含有吴茱萸碱、次碱和柠檬苦素, 其总碱含量和柠檬苦素含量分别为0.233%、1.029%和0.144%、1.249%。

结果表明, 符合药典规定标准总碱含量大于0.15%、柠檬苦素含量大于1%的吴茱萸样品无, 只有重庆黔江濯水乡的样品 (总碱含量0.344%、柠檬苦素含量0.947%) 基本达到药典标准。

3.3 对同产地不同采收时间的含量对比

通过对重庆黔江濯水乡月和月吴茱萸总碱和柠檬苦素含量的对比, 以及南川黄草坪9月和10月吴茱萸总碱和柠檬苦素含量的对比可见, 吴茱萸的较佳采收时间为9月, 吴茱萸总碱和柠檬苦素的含量相对最高, 与历代文献“九月九日采, 阴干。久陈者良。”相符。

3.4 不同产地同—采收时间的含量对比

通过对四川 (7个产地) 和重庆市产 (14个产地) 吴茱萸有效成分含量对比分析, 其总碱平均含量四川省产 (1.340%) 含量高于重庆市产 (0.9829%) , 柠檬苦素平均含量重庆市产 (0.4989%) 高于四川省产吴茱萸 (0.2946%) , 表明地理环境、海拔、温度和湿度对吴茱萸有效成分含量的影响, 也证明了吴茱萸的总碱含量均与柠檬苦素含量呈负相关, 与文献报道一致[4]。

3.5 果实与果柄有效成分的含量对比

通过对石虎和疏毛吴茱萸果柄含量的测定, 发现其有效成分的含量基本达到药典规定的要求, 其药用价值有待开发利用。

3.6 3个品种的有效成分含量对比

通过对石虎和疏毛吴茱萸果实有效成分含量的测定发现, 江西九江的石虎达到药典要求, 贵州铜仁石虎近达到要求, 其他品种和川渝产的吴茱萸有效成分含量接近, 表明3个品种的吴茱萸均有药用价值, 证实了药典收载3个品种吴茱萸的合理性, 也说明小花吴茱萸 (石虎和疏毛吴茱萸) 的品质优于大花吴茱萸 (吴茱萸) , “一种粒大, 一种粒小, 小者入药为胜”与文献报道一致[5]。

摘要：建立同时测定吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素含量的高效液相色谱的新方法, 以测定川渝两地吴茱萸有效成分的含量。采用色谱柱Zorbax Eclipse C18 (4.6mm×250mm, 5μm) , 流动相为乙腈-四氢呋喃-0.02%磷酸水溶液 (22∶13∶65) 1.0mL/min, 检测波长220nm, 柱温35℃进行测定。结果表明, 吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素分别在0.051—0.518μg (r=0.9997) 、0.021—0.212μg (r=0.9995) 、0.085—0.427μg (r=0.9998) 范围内呈良好的线形关系, 川渝两地吴茱萸总碱的平均值为1.340%, 柠檬苦素含量的平均值为0.4138%, 吴茱萸、柠檬苦素含量不能达到药典要求。

关键词：吴茱萸,吴茱萸碱,吴茱萸次碱,柠檬苦素,高效液相

参考文献

[1]中国药典2010年版一部[S].2010∶160.

[2]龚慕辛, 王智民, 张启伟, 等.吴茱萸有效成分的药理研究进展[J].中药新药与临床药理, 2009, 20 (2) ∶183-186.

[3]陈代贤, 等.商品吴茱萸及类似品、伪品的比较检定研究[J].China A-cademic Journal, 2009∶183-188.

[4]张丽丽, 张丽艳, 等.不同产地吴茱萸中吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量对比分析[J].贵州医药, 2004, 8 (28) ∶755-757.

蛋白质粉究竟有多少有效成分 篇4

参加本次专家论坛的学者有：

上海营养学会名誉理事长、第二军医大学教授赵法伋

军事医学科学院卫生学环境医学研究所副研究员蒋与刚

天津营养学会理事长顾景范

上海华东医院营养科教授 孙建琴

复旦大学附属儿科医院教授徐秀

湖北营养学会理事长、华中科技大学同济医学院教授周韫珍

解放军临床营养委员会副主任委员、教授薛长勇

解放军总医院营养科副主任医师张荣欣

中华医学会北京营养学会副主任委员、北京协和医院临床营养科教授 于康

上海市营养学会理事长、教授柳启沛

军事医学科学院卫生学环境医学研究所营养研究室主任、研究员郭长江

上海市疾病预防控制中心主任医师蒋家騉

蛋白质是一种由碳、氢、氧、氮等元素组成的复杂的有机化合物，是人体必需的营养素。蛋白质在体内有多种生理功能，最主要的是构成机体组织细胞的成分，是人体的“建筑材料”。它也是构成酶和激素的成分，形成抗体，调节渗透压，特别是核蛋白及其相关的核糖核酸（DNA、RNA）还是遗传的物质基础。所以，人体的生长发育、康复、免疫功能等都离不开蛋白质。可以说，蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。

“蛋白质粉”，顾名思义，就是用蛋白质制成的粉，或者说是一种粉状蛋白质。人体所需要的蛋白质主要来源于动、植物性食物。从理论上讲，任何一种食物通过加工，去除其他成分，都可以制成蛋白质粉。但人们在制备蛋白质粉时，通常选择蛋白质含量高及营养价值高的食物。目前，在市场上销售的蛋白质粉大体上可以分为两大类。一类是纯蛋白质粉，如乳清蛋白、酪蛋白、卵白蛋白、大豆蛋白质粉等。另一类是混合蛋白质粉，如将乳清蛋白、酪蛋白、卵白蛋白按一定比例混合，或将酪蛋白与大豆蛋白按一定比例混合制成的蛋白质粉等。另外，根据蛋白质粉的加工和纯度或含量的不同，还分为“分离型”和“浓缩型”蛋白质粉。前者，通常采用膜分离技术制备，蛋白质含量一般都在85%以上，如乳清分离蛋白、大豆分离蛋白等。后者通常采用浓缩技术制备，蛋白质含量一般在60%左右，如乳清浓缩蛋白、大豆浓缩蛋白等。

各种蛋白质粉因所用原料不同，其营养价值也不尽相同。如乳清蛋白质粉是从牛乳中分离提取的一种营养价值极高，具有多种功效成分的蛋白质。乳清蛋白是牛奶中的精华，其不仅氨基酸种类齐全，比例适当，吸收和利用率高，还含有免疫球蛋白、乳铁蛋白等功效成分。又如大豆分离蛋白，吸收率、利用率和营养价值也颇高。另外，用几种不同蛋白质来源制成的蛋白质粉，通过蛋白质的“互补作用”，还可进一步提高蛋白质粉的营养价值。

有效成分分析 篇5

1 仪器与试药

1.1 试剂

牛血清蛋白及考马斯亮蓝G-250 (超级纯, 广州微佳科技有限公司) , D-葡萄糖 (98.0%, Aladdin industrial Corporation) , 芦丁 (中国药品生物制品检定所, 批号10080-200707) , 标准单糖 (Sigma公司) , 三甲基氯硅烷, 六甲基二硅醚烷, 吡啶, 三氟乙酸, 硼氢化钠, 氢氧化钠, 95%乙醇 (工业) , 浓硫酸、苯酚、亚硝酸钠、硝酸铝等所用试剂均为分析纯。

1.2 材料

山竹于2010年9月购于武汉沙湖水果批发市场, 经中南民族大学药学院李竣副教授鉴定为Garcinia mangostana L.的果实, 提取物供试品由中南民族大学药学院制备。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计 (UV-1800UV美谱达) , 气相色谱仪 (6890N Network GC System, 美国Agilent) , 旋转蒸发器RE-52 (上海亚荣生化仪器) , 真空干燥箱 (XMTD-8222型, 上海精宏实验设备) , 恒温干燥箱 (上海索谱仪器) , 超低温冷冻储存箱 (中科美菱) , 低速离心机 (TD25型, 长沙平凡仪器仪表) , 冷冻干燥机 (FD-1B-50型, 北京博医康实验仪器) , 旋转蒸发仪R-1001M型 (郑州长城) , 循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ (郑州长城) , 恒温水浴锅 (郑州长城) , 超声波清洗器KQ-500E (昆山市超声仪器) , 硅胶板试剂 (青岛海洋化工厂) , 电子天平AB265-S型, 电子天平AR2140型 (上海奥豪斯仪器) 。

2 方法与结果

2.1 提取工艺流程

取新鲜山竹果皮干燥粉碎后的6.4 kg, 用95%乙醇各回流提取3次, 每次2 h, 合并提取液减压浓缩得到山竹果皮提取物。取新鲜的山竹果肉854 g分别依次用95%乙醇提取1次, 蒸馏水回流提取3次, 每次2 h, 合并蒸馏水提取液, 减压浓缩得到山竹果肉提取物。

2.2 山竹果肉提取物多糖含量的测定[15]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的葡萄糖50 mg, 加蒸馏水溶解定容至0.1 mg/m L, 即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取干燥的山竹果肉提取物适量, 至100 m L容量瓶, 加蒸馏水至刻度, 摇匀即得供试品溶液。

2.2.3 苯酚溶液的制备

称取苯酚6 g至100 m L容量瓶, 加蒸馏水至刻度, 摇匀即得苯酚试剂。

2.2.4 最大检测波长的选择

分别取对照品溶液和供试品溶液1 m L至10 m L具塞玻璃试管中, 加苯酚溶液0.5 m L, 振摇, 迅速加入浓硫酸5 m L, 振摇后放置15 min。待冷却后, 紫外分光光度计上做全波长扫描, 得到最大吸收波长λmax为480 nm, 确定480 nm为检测波长。

2.2.5 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液1、2、3、4、5 m L, 分别加蒸馏水定容至10 m L容量瓶中。摇匀各取1 m L, 以下操作按“2.2.4”项下方法显色。在480 nm波长下测定吸光度, 求得标准曲线性方程为y=17.0888x+0.0108, r=0.9980, 提示该溶液在0.01~0.05 mg/m L范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验

取0.05 mg/m L的对照品溶液按“2.2.4”项下方法显色, 结果显示RSD为0.226% (n=6) 。

2.2.7重复性试验

取同一批次供试品溶液, 按“2.2.4”项下方法显色, 结果显示RSD为2.85% (n=6) 。

2.2.8 稳定性试验

取同一批次供试品溶液, 按“2.2.4”项下方法显色, 分别在显色0、5、10、20、30、40 min后测定吸光度值, RSD为2.87%, 结果表明显色后40 min内测定测定无显著性差异, 为保证准确性测定的时间选择在30 min内完成。

2.2.9 回收率试验

精密吸取葡萄糖对照品溶液6份, 分别加入不同量的已知多糖含量的供试品液, 以下操作按“2.2.4”项下方法进行。结果见表1。

2.2.1 0 供试品含量测定

取果肉提取物供试品溶液, 按“2.2.4”项下方法进行, 山竹果肉提取物中多糖含量, 结果见表2。

2.3 山竹果肉提取物蛋白质含量的测定[16]

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称取250 mg牛血清蛋白 (BSA) , 加生理盐水制成浓度为0.1 mg/m L的溶液, 即得对照品溶液;精密称取50 mg考马斯亮蓝G-250至500 m L容量瓶中, 加入25 m L 95%乙醇﹑50 m L 85%磷酸, 振摇溶解, 生理盐水定容得考马斯亮蓝溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

精密称取干燥的山竹果肉提取物适量, 至250 m L容量瓶, 加蒸馏水至刻度, 摇匀即得供试品溶液。

2.3.3 最大检测波长的选择

分别取对照品溶液和供试品溶液1 m L, 加考马斯亮蓝溶液5 m L, 摇匀, 静置2 min。紫外分光光度计上做全波长扫描, 得到最大吸收波长λmax为590 nm, 确定590 nm为检测波长。

2.3.4 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 m L, 分别加蒸馏水定容至10 m L容量瓶中。摇匀各取1 m L, 以下操作按“2.3.3”项下方法显色。在590 nm波长下测定吸光度, 求得标准曲线性方程为y=25.0039x+0.0496, r=0.9997, 提示该溶液在0.008~0.032 mg/m L范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

取0.01 mg/m L的对照品溶液按“2.3.3”项下方法显色, 结果显示RSD为0.29% (n=6) 。

2.3.6重复性试验

取同一批次供试品溶液, 按“2.3.3”项下方法显色, 结果显示RSD为2.79% (n=6) 。

2.3.7 稳定性试验

取同一批次供试品溶液, 按“2.3.3”项下方法显色, 分别在显色0﹑5﹑10﹑15﹑20﹑25﹑30 min后测定吸光度值, RSD为3.21%, 结果表明显色后30 min内测定测定无显著性差异, 为保证准确性测定的时间选择在20 min内完成。

2.3.8 回收率试验

精密吸取BSA对照品6份, 分别加入不同量的已知含量的供试品液, 以下操作按“2.3.3”项下方法进行, 结果见表3。

2.3.9 供试品含量测定

取山竹果肉提取物供试品溶液, 按“2.2.4”项下方法进行, 山竹果肉提取物中蛋白质含量, 结果见表4。

2.4 山竹果皮提取物总黄酮含量的测定[17]

2.4.1 对照品、供试品溶液的制备

取芦丁对照品10 mg, 用95%乙醇溶解, 并定容至100 m L, 即得0.1 mg/m L对照品溶液, 精密称取山竹果皮提取物于100 m L容量瓶中加95%乙醇溶解定容即得供试品溶液。配制5%Na NO3溶液, 10%Al (NO3) 3溶液, 20%Na OH溶液。

2.4.2最大检测波长的测定

分别取对照品溶液和供试品溶液4 m L, 置于25 m L容量瓶中, 加5%Na NO3溶液1 m L, 摇匀放置6 min, 加10%Al (NO3) 3溶液1 m L, 摇匀放置6 min, 加20%Na OH试液10 m L, 再加蒸馏水定容, 摇匀放置15 min, 以95%乙醇为空白参比。紫外分光光度计上做全波长扫描, 得到最大吸收波长λmax为500 nm, 确定500 nm为检测波长。

2.4.3 校准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 m L, 分别加蒸馏水定容至10 m L容量瓶中。摇匀各取1 m L, 以下操作按“2.4.2”项下方法显色。在500 nm波长下测定吸光度, 求得标准曲线性方程为y=9.3890x+0.0307, r=0.9971, 提示该溶液在0.02~0.06 mg/m L范围内线性关系良好。

2.4.4 精密度试验

取对照品溶液按“2.4.2”项下方法显色, 测定吸收度值连续测定6次, RSD=0.328% (n=6) 。

2.4.5重复性试验

取同一批号的供试品 (批号100105) 制备6份供试品溶液, 按“2.4.2”项下方法操作显色, 测定吸收度值RSD=3.14% (n=6) 。

2.4.6 稳定性试验

取对照品试液按“2.4.2”项下方法操作显色, 在显色10、20、30 min后测定吸收度值, 结果表明显色后30 min内测定测定无显著性差异, 为保证准确性测定的时间选择在20 min内完成。

2.4.7 回收率试验

精密吸取芦丁对照品6份, 分别加入不同量的已知含量的供试品液, 以下操作按“2.4.2”项下方法进行, 结果见表5。

2.4.8 供试品含量的测定

取山竹果皮提取物供试品溶液, 按“2.4.2”项下方法进行, 山竹果皮提取物中总黄酮含量, 结果见表6。

2.5 山竹果肉提取物多糖成分分析

2.5.1 多糖提取

称取15 g山竹果肉提取物, 加蒸馏水150 m L, 于90℃水浴加热2.5 h, 离心过滤。滤液用Sevage试液 (氯仿∶正丁醇=4∶1, 体积比) 按1∶5充分混匀, 振荡25 min, 4000 r/min离心15 min, 收集上清液, 重复处理至氯仿与水层间无胶状物产生。加入无水乙醇至醇浓度为70%, 4℃静置12 h, 过滤, 冷冻干燥得较纯多糖[18,19]。

2.5.2 多糖水解, 单糖还原

取0.5~1.0 mg多糖溶解在1 m L 4 mol/L的三氟乙酸 (TFA) 中, 充氮气加盖密封, 100℃水解4 h, 用氮气除水。水解糖样溶于0.5 m L0.05 mol/L氢氧化钠溶液, 加5~10 mg硼氢化钠, 在60℃还原1 h, 加乙酸至无气泡逸出。将产物冷冻干燥, 加1 m L甲醇并振荡溶解, 用氮气除甲醇, 反复5次除去硼酸根。产物在含有五氧化二磷的真空干燥箱中干燥5 h。

2.5.3 单糖甲基化, 气相色谱分析

干燥产物加1 m L4A分子筛干燥的吡啶, 振荡溶解, 再依次加入0.5 m L六甲基二硅醚烷, 0.2 m L三甲基氯硅烷, 振荡, 混合均匀, 置4℃冰箱反应12 h, 产物用离心机离心8 min (4000 r/min) , 取上清液进行气相分析。气相色谱条件为:HP-5石英毛细管色谱柱 (30 m×0.32 mm, 0.25μm) , 程序升温范围130~290℃, 每分钟升高10℃, 进样口温度295℃, 载气氮气流速1.0 m L/min, 分流比50∶1, 检测器温度300℃。在此方法下对各单糖 (图1) 和提取物多糖 (图2) 进行检测并得到相关气相色谱图。各单糖、提取物多糖气相色谱图分别见图1、2。

1:D-木糖 (t=8.489 min) ;2:D-阿拉伯糖 (t=8.610 min) ;3:D-鼠李糖 (t=9.098 min) ;4:D-半乳糖 (t=10.562 min) ;5、6:D-果糖 (t=10.703、10.820 min) ;7:D-葡萄糖 (t=10.778 min) ;8:D-葡萄糖醛酸 (t=11.088 min)

1′:D-木糖 (t=8.490 min) ;2′:D-阿拉伯糖 (t=8.612 min) ;3′:D-果糖 (t=10.700 min) ;4′:D-葡萄糖 (t=10.776 min)

2.5.4 标准单糖和提取物多糖气相色谱

将标准单糖和多糖分别进样进行气相分析, 结果见表7、8。其中气相色谱的保留时间可以确定单糖种类, 色谱峰面积可以估算单糖含量。从表7显示的结果说明, 7种单糖保留时间主要集中在8~11 min, 部分色谱峰还未达到基线的分离, 果糖因其结构的变化产生两个信号, 其他单糖均为一个信号。

从图1、2可明确看出山竹果肉提取物多糖结果中的D-木糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖与各单糖相对应, 结合表7和表8保留时间表明山竹果肉提取物多糖由D-木糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖组分, 摩尔比为1.34∶1.66∶1.00∶40.06。

3 讨论

通过文献的调研发现, 对山竹提取物质量的研究, 总黄酮含量的测定主要集中在果皮, 多糖和蛋白质等的含量测定集中在果肉, 笔者前期分别对山竹果皮提取物中多糖和蛋白质含量以及果肉中总黄酮含量进行测定, 测定结果表明山竹果皮提取物中多糖含量为27.12%, 蛋白质含量为4.84%, 山竹果肉提取物中总黄酮含量为0.39%。与本研究中含量测定结果相比较, 果肉提取物中多糖含量远大于果皮提取物, 而果皮中富含有黄酮类成分。

本实验用苯酚-硫酸法测定山竹果肉提取物的含糖量, 该法反应迅速完全, 产生的有色物质稳定准确率较高, 并且显色反应与多糖浓度存在定量关系, 简便快速, 灵敏易行, 可以用于多糖的含量测定。实验过程中, 854 g新鲜的山竹果肉可以得到多糖提取物131 g, 测定多糖含量为84.99%, 换算新鲜山竹果肉中含糖量为13%。用Na NO3-Al (NO3) 3的方法测定总黄酮的含量, 并且精密度良好在30 min内稳定, 在20 min内完成测定, 此法方便可行可以用于山竹总黄酮含量的测定。

实验采用气相色谱法将山竹果肉提取物多糖进行了分析, 山竹果肉提取物多糖由D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-果糖组组成, 摩尔比为1.34∶1.66∶1.00∶40.06。有一种单糖因单糖对照品有限未有确定, 从各种单糖摩尔比例可以看出山竹果肉提取物多糖是由葡萄糖为主的葡聚糖组成的杂多糖, 具体的链接方式还需要更多的实验数据予以证实。

摘要：目的 研究山竹果肉提取物中多糖、蛋白质含量及多糖中单糖组成和山竹果皮提取物中总黄酮的含量。方法 取山竹果皮用95%乙醇回流提取, 减压浓缩得到山竹果皮提取物;山竹果肉分别用95%乙醇, 蒸馏水回流提取, 合并蒸馏水提取液减压浓缩得到山竹果肉提取物。采用可见-紫外分光光度法以苯酚-硫酸、考马斯亮蓝显色分别测定山竹果肉提取物多糖和蛋白质的含量;亚硝酸钠-硝酸铝显色测定山竹果皮提取物总黄酮的含量;果肉提取物多糖水解产物进行甲基化反应, 以气相色谱检测多糖水解产物。结果 分别采用上述方法能够分别准确测定出山竹果皮提取物中总黄酮含量为6.30%, 果肉提取物中多糖和蛋白质含量分别为84.99%和1.64%, 确定果肉提取物多糖水解产物中的4种单糖分别为:D-葡萄糖, D-果糖, D-阿拉伯糖, D-木糖, 其摩尔比为1.34∶1.66∶1.00∶40.06。结论 本研究建立的含量测定方法操作简单, 重复性好, 结果可靠, 可用于山竹提取物的质量控制。

有效成分分析 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

以序列号1~12分装射干不同有效成分, 本研究所用受试药物由我院研究所提供。借助于硅胶柱对射干进行分离, 用不同比例的氯仿-甲醛液经洗脱获得。受试药物中1~11号由野鸢尾苷元、鸢尾苷元及德鸢尾苷元与次野鸢尾苷元构成, 即异黄酮苷元混合物;12号则由德鸢尾苷、鸢尾苷与野鸢尾苷所构成, 即异黄酮苷混合物。在温度为120℃及0.1MPa高压条件下进行灭菌, 灭菌时间为20min, 分装储存于冰箱内备用, 装设容量为5mL, 冰箱温度为4℃。

所用病毒株有疱疹I、呼吸道合胞病毒、柯萨奇16、腺病毒3型、疱疹Ⅱ及腺病毒7型;细胞株包括非洲绿猴肾细胞、咽喉癌上皮细胞及宫颈癌细胞;试剂主要包含青链霉素母液、胎牛血清、TPCK胰酶、HEPES缓冲液、培养基及ED-TA胰酶等。仪器设备有全外排式生物安全柜、二氧化碳培养箱及倒置显微镜等。

1.2 方法

(1) 细胞株进行3~5天的复苏传代培养, 让其贴壁形成为单层, 在折光度和立体感均较强的条件下, 利用EDTA胰酶进行消化, 当贴壁细胞面有针尖样的小孔, 且松动处于流动态时吸尽消化液, 再添加相应细胞培养液, 使细胞得以吹散, 蓝染色计数。将细胞数调至大概3×104/mL, 接种96孔的细胞培养板中, 每孔为100μ/L, 18~24h后, 待细胞成片切融合度达80~90%单层再应用。

(2) 按比例借助细胞培养液对1~12号射干有效成分进行稀释。在96孔培养板中接种细胞悬液, 在二氧化碳含量5%、温度36.5℃的培养箱中培养, 时间一般为24h, 将原培养液倒掉, 借助于Hank’s液对细胞进行清洗。完成上述操作, 把已稀释的各有效成分滴加至所对应且已成为单层的各细胞株上, 放置在温度为36.5℃的二氧化碳培养箱中培养5~7天, 每日于倒置显微镜下观察细胞病变, 做好记录工作。

(3) 以10倍梯度降低的方式对所用病毒进行稀释, 浓度为3×104/mL, 采取染毒细胞病变法, 把非洲猴肾细胞、咽喉癌上皮细胞及宫颈癌细胞接种于96孔培养板, 并放于二氧化碳培养箱中培养, 箱内温度为36.5℃, 培养时间为24h, 倒掉培养液并利用Hank’s液对细胞进行清洗, 把所稀释的各病毒液接种于已成为单层的细胞板, 其中呼吸道合胞病毒与腺病毒3型、7型所接种的细胞为咽喉癌上皮细胞, 剩余病毒所接种的细胞为非洲绿猴肾细胞, 放置二氧化碳培养箱中培养大约5天, 培养温度为36.5℃, 每日于倒置显微镜下观察细胞病变。在射干各有效成分对抗病毒致细胞病变上, 进行细胞病变抑制实验。

2 结果

经测定, 除2号和6号外, 射干各有效成分均没有毒界线药液, 同时对各病毒致细胞病变均有抑制作用, 如腺病毒3型和7型、柯萨奇16、呼吸道合胞病毒及疱疹等。射干各有效成分不同细胞毒性测定结果见表1。各病毒测定不同细胞半数感染浓度情况见表2。射干各有效成分对抗病毒致细胞病变结果见表3。

3 讨论

射干为鸢尾科射干属植物, 其根茎为中药材射干主要来源, 具有较为长远的药用历史, 收载于《中国药典》, 具有散血消肿、清热解毒及利咽消痰等作用[3]。其抗病毒机理为扶正祛邪, 现代药理学研究表明, 中草药抗病毒作用主要经病毒繁殖期间吸附、成熟、穿入及肤质等环节被阻断而使病毒得到抑制, 或经机体免疫能力增强及机体非特异性、特异性免疫能力的加强抑制病毒。

本研究采用病毒先吸附而后加药的方式, 观察分析射干不同有效成分的抗病毒作用。研究结果显示, 由野鸢尾苷、鸢尾苷及德鸢尾苷所构成的异黄酮苷混合物与由野鸢尾苷元、鸢尾苷元、次野鸢尾苷元及德鸢尾苷元所构成的异黄酮苷元混合物大部分成分均具备显著的体外抗病毒作用, 究其原因可能是射干各有效成分经病毒成熟、穿入及复制等环节被阻断, 从而发挥抗病毒的功效。

摘要：目的:观察分析射干各有效成分的体外抗病毒药学作用。方法:采用组织细胞培养方法, 观察分析射干有效成分对疱疹I、呼吸道合胞病毒、柯萨奇16、腺病毒3型、疱疹Ⅱ及腺病毒7型等病毒的对抗作用。结果:经分析发现, 除2号和6号外, 射干各有效成分均没有毒界线药液, 同时对各病毒致细胞病变均有抑制作用, 如腺病毒3型和7型、柯萨奇16、呼吸道合胞病毒及疱疹等。结论:除2号和6号以外, 射干不同有效成分对各种病毒均具有不同程度的对抗作用。

关键词：抗病毒,射干,有效成分,药效学

参考文献

[1]孙国祥, 宋杨, 张静娴, 等.指纹定量法评估射干抗病毒注射液指纹归属度和药效物质工艺收率[J].中南药学, 2009, 7 (6) :446-451.

有效成分分析 篇7

防锈颜料按照其保护机理可分为物理性防锈颜料和化学性防锈颜料。物理性防锈颜料其本身一般不具备防锈功能,但其可与成膜物质适当配合从而防止水分、氧气、二氧化碳等腐蚀介质的侵入,对涂膜的防腐蚀功能起到增效作用。

化学性防锈颜料主要是通过化学反应而产生抑锈效果,常用的有红丹、锌铬黄等。这种铅、铬系防锈颜料虽然具有较好的防腐蚀性能,但是因为铅、铬都是毒性金属,使铅、铬系防腐蚀涂料在使用后造成严重的环境污染,对人类生存、生活带来不利影响。随着科技进步,工业发展,防腐蚀涂料的应用日益广泛,人类致力于寻找更健康的环境友好型绿色颜料。20世纪70年代,一种新型的以三聚磷酸铝为基础的无毒防腐颜料的产生,开创了绿色安全涂料的新领域[1,2,3,4,5]。

三聚磷酸铝颜料的适量加入可以明显改善涂料保护金属的性能,使涂膜更加紧密完整。目前,对三聚磷酸铝的研究主要涉及合成、性能、抗腐蚀机理及应用方面。石晓波[6]等对三聚磷酸铝的组成、结构、热变化、密度、比表面及溶解性等物理化学性质进行了系统测定,弄清了其晶形和结构。刘有法[7]等论述了三聚磷酸铝的性质、应用,介绍了由湿法磷酸合成三聚磷酸铝的制备路线。陈刚等[8]阐述了三聚磷酸铝颜料的性质,制备此防锈漆的生产过程以及产品的应用。汪明礼[9]探索了制备三聚磷酸铝的最佳工艺条件,提出了一个较为合理的生产流程。袁爱群[10]合成了三聚磷酸二氢铝,考察了合成的影响因素。张丽等[11]通过采用通电实验、动态恒电位极化曲线和腐蚀电位测量等电化学技术,研究了三聚磷酸铝在水性乳胶涂层中的防锈机理。吴展阳[12]研究了三聚磷酸铝无毒白色防锈颜料的制备,颜料的组成、物理性质及应用。袁爱群等[13]研究了三聚磷酸二氢铝Ⅰ型二水物的微波合成工艺及热分解动力学。

三聚磷酸铝本身具有很强的防锈能力,但由于酸性、水溶解度等原因,单独用作颜料时会破坏涂料基料的稳定性,故其并不适合直接作为防锈颜料使用,必须加以改性。通过改性物与三聚磷酸铝之间的化学反应改变三聚磷酸铝的某些物理化学性质,如获得适宜的pH值、溶解性、分散性等等,使其能成为一种实际可用的活性防锈颜料。骆明等[14]对三聚磷酸铝的基本物理化学性质作了介绍,探索了其改性方法以及改性物的选择。宁红等[15]研究了用含钼化合物对三聚磷酸铝进行改性的方法。蔡冬梅等[16]论述了改性三聚磷酸铝的研制和应用。

2 三聚磷酸铝的物理性质及防腐蚀机理

三聚磷酸铝的通式为AlH2P3O10·2H2O,是白色或灰白色微晶粉末,微溶于水,粒子尺寸在几个微米,呈片状结构。因其无毒,且为白色固体,能用于制造出高纯度的白色涂料,故受到涂料生产者的亲睐。

金属表面不可能是理想表面,会存在着微小的物理性质和化学性质差异,如夹杂二相粒子、晶界被溶质隔离、裂纹、机械损伤或异位等[17],这就形成了腐蚀的活性点,腐蚀往往首先从这些微点发生。

三聚磷酸铝溶解在水中,离解出三聚磷酸根离子[反应式(1)],其具有很强的络合能力,随着腐蚀介质的渗透传输到基底钢铁表面,与腐蚀产物二价和三价铁离子络合形成铁络合离子,覆盖了腐蚀活性点,使得基底钢铁的腐蚀减缓。同时生成的铁络合离子能较强地吸附在基底钢铁上,与钢铁基底发生化学反应,在钢铁表面逐渐形成一层完整、致密的保护膜,从而阻止腐蚀介质的进一步侵蚀,有效保护了基底钢铁。

AlH2P3O10→Al3++2H++P3O105- (1)

三聚磷酸铝骄人的防锈功能在于其结构基团的特殊性,可以对钢铁表面提供“双重防锈”:三聚磷酸根离子可解聚形成焦磷酸根离子、正磷酸根离子[反应式(2)],这些活性基团与基材表面再次反应,形成了一层有效的钝态保护膜,与铁锈转化磷化膜融为一体,从而使原先较为疏松的铁锈层变成致密的磷化膜而牢牢地渗附于钢铁表面,进一步抑制了腐蚀的进展。同时,颜料反应后形成的复合产物体积较原颜料体积大,堵塞了涂膜缝隙,对涂膜缺陷具有修补作用,增强了涂膜对腐蚀介质的传输阻力,减缓了腐蚀介质的进一步浸透。

P3O105- +2H2O→3PO43-+4H+ (2)

刘宏伟[18]等人将三聚磷酸铝的防锈作用归纳为以下三个方面:(1) 作为某种“媒介”,起着桥梁作用,增强了高分子化合物之间及与金属的结合力,提高了涂膜的完整性。(2)起着体质填料的作用,改善涂膜的机械性能,提高涂膜的抗失效能力。(3)三聚磷酸铝释放出络合能力很强的三聚磷酸根离子,在铁基表面形成铁络合离子,覆盖了腐蚀活性点,使金属的腐蚀减缓。

3 三聚磷酸铝的含量测定

对于三聚磷酸铝含量的测定还未见报道,这可能主要是由于三聚磷酸铝难溶性等诸多特殊性质。进行含量测定时,可将样品溶解,测定其中三聚磷酸根的含量,从而求得三聚磷酸铝的含量。据文献查阅,目前已涉及了对水溶性多聚磷酸盐中不同形式的磷酸盐的含量测定的研究。

3.1 离子交换色谱法

国标法[19]分离测定工业三聚磷酸钠中不同形式的磷酸盐,即采用离子交换柱色谱法:以标准五氧化二磷溶液制作标准曲线。通过离子交换色谱法将三聚磷酸钠中不同形式的磷酸盐分离收集后,调节合适的酸度,加热水解足够长的时间,保证水解完全,然后用分光光度法分别测定吸光度,得到相应的五氧化二磷的质量,从而可根据换算系数求出三聚磷酸钠中各种形式磷酸钠的含量。

此方法旨在分离不同形式磷酸盐,收集到的组分含量测定可采用多样不同的检测方法,如钼锑抗分光光度法测定总磷,ICP法测定磷元素等。

3.2 离子色谱法

对水溶性焦磷酸盐、三聚磷酸盐的分析,一般将其转化为正磷酸盐,用光度法测定总磷[20]。此方法不仅要做样品前处理,而且不能满足生产质控中欲测不同形态和连续测定的要求。而离子色谱法弥补了这一缺陷,逐渐受到人们的亲睐而被用于分离测定不同形态的磷酸盐。

离子色谱法是20世纪70年代发展起来的一种新的分析技术,已广泛用于环保[21]、食品[22]、饮料[23,24]、医药[25]等多种行业。宋秀贤等[26]建立了同时测定ppb级(μg·L-1)多聚磷酸盐(正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐)的离子色谱方法,研究了分离机理,流动相的选择,色谱条件的最佳化,降低基线噪音的方法和多聚磷酸盐的稳定性。王野秋等[27]探讨了用离子色谱电导检测法直接分离测定正、焦、三聚、六偏磷酸盐混合物,确定了最佳淋洗条件,并测定了浇铸料添加剂中多聚磷酸盐的含量。王大凯等[28]采用含钙和镁离子的溶液作为离子色谱的淋洗液,对几种工业三聚磷酸钠样品进行了测定。吴玉萍等[29]研究了离子色谱法检测食品添加剂三聚磷酸盐中杂质含量的分析方法,成功同时测定了三聚磷酸盐中Cl-、NO-3、SO42-、磷酸盐、焦磷酸钠、三偏磷酸钠等杂质含量。

3.3 重量法

印度孟加拉科学研究所无机物理化学部Kamat等[30]提出,利用McCune等[31]发现的反应:[Co(en)2]3++H2P3O103-→[Co(en)2H2P3O10]↓,沉淀三聚磷酸根离子,过滤后测定沉淀的质量,从而可折算出样品的含量。此方法中按Wold等[32]的方法先合成[Co(en)2 CO3]Cl,重结晶,风干,然后加盐酸酸化得到沉淀剂[Co(en)2 Cl2]Cl。

此方法关键是三聚磷酸根离子的沉淀条件:(1)只有带3个负电荷的三聚磷酸根离子的形态才能反应。因此,要将试液的pH值调至2.0～2.1。(2)试液须加入正丙醇,以降低沉淀的溶解度,才能获得定量回收。

而沉淀剂的用量也会影响最后含量的测定。沉淀剂加入量过多,将有部分随沉淀物一起析出,导致分析结果偏高。可通过测定滤去沉淀后的滤液中沉淀剂的残余量确定沉淀剂的用量,滤液中多余的沉淀剂宜在10 mg左右。过多,则分析结果偏高,应适当增加试样量再分析。反之,如沉淀剂残余量过少,则可能沉淀不完全,应适当减少试样量重新分析。此方法的相对标准偏差≤0.48%[33]。

3.4 样品溶解

测定可溶于水的三聚磷酸盐,样品的前处理过程比较简单。但是,测定三聚磷酸铝,因其难溶于酸,微溶于水,可溶于碱,但在碱性溶液中三聚磷酸根离子可能发生降解,生成相应的焦磷酸根、正磷酸根离子,所以要保证溶解三聚磷酸铝过程中三聚磷酸根离子的结构不发生变化,即磷的形态不变,则成为三聚磷酸铝样品前处理的难点,寻找适宜的溶剂是首要的关键步骤。

石晓波等对三聚磷酸二氢铝的溶解性进行了测定,指出在恒温25 ℃的条件下,三聚磷酸二氢铝在100 g蒸馏水,0.1 mol·L-1的HCl,0.1 mol·L-1的NaOH,0.1 mol·L-1的氨水中分别能溶解0.012 g、0.021 g、0.03 g、0.041 g。且根据纸上色层分析,三聚磷酸二氢铝溶解后仍以三聚磷酸根形式存在。

可考虑通过加入络合剂,使其与Al+发生配位作用,从而达到溶解样品的目的。刘敏等[34]对长江口滨岸潮滩表层及孔样沉积物中的磷进行形态分析时,李兆罡等[35]用7步连续浸提法对库布齐沙漠响沙湾沙粒中磷的各种存在形式进行分析测定时,刘浏等[36]采用连续提取化学分析技术,对密云水库的柱状沉积物和表层沉积物样品进行磷形态的提取分析时,朱广伟等[37]对太湖不同污染状况和生态系统状况的湖区沉积物中磷的地球化学形态及其分布进行研究时,丰茂武等[38]利用分级提取法分析玄武湖的沉积磷形态时,均采用了将样品溶于NH4F溶液中振荡,使F-与其配位,达到溶液样品测定铝结合态磷含量的目的。

3.5 降解分析

多聚磷酸盐的稳定性受很多因素的影响,如温度、pH值、时间和微生物等均会影响其降解程度,降解的最终产物是PO43-。宋秀贤等研究了在冷藏状态下P3O105-基本是稳定的,不随时间的增加而降解。温度低于40 ℃时,P3O105-的降解受温度影响不明显,温度较高时发生明显降解。因此,溶解样品时尽量避免高温。

而对样品溶解后降解情况的分析有相关方法值得借鉴。用异丙醇∶水∶氨水∶三氯乙酸=70∶30∶0.4∶4(v/v)组成的溶液作展开剂,含0.2%(m/v)乙酸铀酰、0.1%(m/v)亚甲蓝的溶液作显色剂,进行纸层析分离定性。

考虑到三聚磷酸铝复杂的溶解性,可以进行非溶解的固体测样方法。石晓波等对三聚磷酸铝物化性质进行研究时,测定了IR光谱,得到特征吸收峰。宁红等采用X射线衍射分析检测含钼型三聚磷酸铝白色颜料的性能。广西大学物理系对三聚磷酸铝样品进行X线衍射结构测定,测得晶胞参数和单位晶胞体积,其结果与ASTM收集的AlH2P3O10·2H2O的数据完全相对应。廖永贵[39]在其硕士学位论文中记载,通过激光拉曼光谱很好地鉴别出钢材腐蚀产物,从而推测出三聚磷酸铝颜料在环氧涂层中对A3钢的保护作用机理。辜志俊等[40]对防锈颜料三聚磷酸铝进行了拉曼光谱研究。

有效成分分析 篇8

随着分析科学的不断发展，液质联用技术已广泛用于中药及生物样品的分离分析。串联质谱具有分析速度快、灵敏度高、能给出分子结构信息等优点，采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS），可以获取各化合物的一级和二级质谱信息，从而迅速对中药化学成分进行快速分析鉴别。另外，由于中药饮片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化学成分具有重要的意义。本文采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）分析黄芩水煎液中的有效成分，为黄芩的物质基础和作用机理研究奠定了基础。

1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪（配有DAD检测器、自动进样器、四元泵），6410B QqQ-MS电喷雾串联质谱仪（美国Agilent公司)，配有Mass Hunter数据处理系统；色谱柱：ZORBAX SB-C18高效液相色谱柱（100mm×2.1mm,3.5μm，美国Agilent公司）。色谱流动相甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），甲酸为分析纯（广州化学试剂厂），实验用水为Milli-Q超纯水。黄芩药材购自广州采芝林药店，经鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法与结果

2.1 样品提取

取黄芩药材适量粉碎，准确称取10g置圆底烧瓶中，加100mL水，回流提取2h，提取液冷却后转移至100mL的容量瓶中，定容后过0.45µm滤膜，作为供试品溶液。

2.2 色谱及质谱条件

色谱条件：ZORBAX SB-C18高效液相色谱柱（100mm×2.1mm、3.5μm）；流动相A为0.5%的甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～2min,0%B;2～5min,0%～12%B;5～25min,12%～30%B;25～35min,30%～60%B;35～45min,60%～95%B;45.1min,0%B保持10min。流速0.4mL/min；进样量：5.0μL，柱温：25℃。

质谱条件为电喷雾离子源，负离子扫描模式；喷雾气压力：40psi；干燥气（N2）流速：10.0L/min，干燥气温度：350℃；毛细管电压：4000V，碎裂电压：100V，锥孔电压：60V，碰撞能量0～20V，质量数扫描范围为50～1500m/z。

2.3 成分分析

图1为黄芩药材水提取液的HPLC-MS分析总离子流色谱图，色谱图上有30个明显的色谱峰，通过与相关文献[9,10]比较每个色谱峰一级质谱信息、二级质谱信息以及C18色谱柱的洗脱顺序，其中的21个化合物得到了推测鉴定，这些化合物的保留时间、一级质谱、多级质谱和分子式详细信息见表1，详细色谱图信息见图1。其中10、20、23、27号色谱峰分别是黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，这四个色谱峰通过与对照品对照比较保留时间、一级质谱和多级质谱信息得到了确证。黄芩主要含有黄酮类化合物，其中黄酮苷类包括碳苷（如白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷）和氧苷类化合物（如黄芩苷）。碳苷是一类特殊的化合物，其糖基以C-C键直接连在苷元的碳原子上。白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(2)为碳苷，在二级质谱中，能够观察到[M-H-60]-、[M-H-90]-和[M-H-120]-的信号，与黄酮碳苷质谱裂解的特征信号一致。黄芩苷(10)、汉黄芩苷(20)等氧苷在二级质谱中则明显失去一份子的葡萄糖醛酸，得到[M-H-176]-的信号。其它9个色谱峰由于缺乏相关的文献报道和对照品，结构有待进一步分析鉴定。

3 讨论

HPLC-MS/MS是分析黄芩有效成分的强有力工具，通过采用串联质谱分析化合物的一级和二级质谱信息，可以大致推测出化合物的结构和类型，从而在没有标准品的条件下，也能对黄芩中的有效成分进行定性。本实验通过对黄芩水煎液进行了HPLC-MS/MS分析，研究了其水溶性的化学成分，通过HPLC分离共得到了30个化合物，其中鉴定了21个化合物。黄芩主要含有黄酮类成分，本研究能快速的分析鉴定黄芩中的黄酮类成分，同时还能根据质谱的特征离子，鉴定黄芩中特殊的碳苷化合物。本方法具有快速、灵敏度高的特点，可以作为黄芩药材鉴定的有效方法。

摘要：目的 采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)联用技术,对黄芩水煎液中的有效成分进行初步分析。方法 采用AgilentZORBAXSB-C18色谱柱,以乙腈和水(含体积比0.5%甲酸)为流动相,采用梯度洗脱,流速为0.4mL/min,ESI-MS采用负离子模式。通过HPLC-MS/MS在线测定化合物的一级和二级质谱信息,结合文献报道,对黄芩水煎液的有效成分进行分析鉴别。结果 结合文献报道和质谱数据,21个成分通过串联质谱进行了结构鉴定,4个通过对照品得到了确证。结论 高效液相色谱串联质谱法是鉴定黄芩药材化学成分的有效方法。

关键词：黄芩,水煎液,化学成分,高液相色谱串联质谱

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:282-283.

[2]陈秀清,齐香君,何恩铭.中药黄芩研究新进展[J].食品与药品,2006,8(5):23-27.

[3]徐丹洋,陈佩东,张丽,等.黄芩的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(1):78-80.

[4]肖丽和,王红燕,宋少江,等.滇黄芩化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2003,20(3):181-183.

[5]周锡钦,梁鸿,路新华,等.中药黄芩主要黄酮类成分及其生物活性研究[J].北京大学学报·医学版,2009,41(5):578-584.

[6]向淼,徐细明,邓君健,等.黄芩素诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡作用的研究[J].现代肿瘤医学,2012,20(6):1098-1103.

[7]高卫,蒋秀芳,范春梅,等.中药黄芩抗缺氧作用研究[J].大连大学学报,2006,27(2):94-96.

[8]佟继铭,刘玉玲,符景春.黄芩茎叶总黄酮调血脂作用研究[J].中草药,2000,31(3):196-198.

[9]LeiZhang,RuowenZhang,Qing Li,et al.Development of the Fingerprintsfor the Quality Evaluation of Scutellariae Radix by HPLC-DAD and LC-MS-MS[J].Chromatographia,2007,66:13-20.

五味子主要有效成分的综合提取方法 篇9

关键词：五味子；挥发油；多糖；木脂素；超声波-微波法；综合提取

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0273-03

收稿日期：2013-10-08

作者简介：程振玉（1986—），男，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail：844503608@qq.com。

通信作者：杨英杰。E-mail：yanghjm@163.com。五味子是五味子科植物五味子（Schisandra chinensis Baill）的干燥成熟果实，主产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地[1]。五味子具有很高的药用价值，《中华人民共和国药典》（2010年版）中明确指出五味子具有收敛固涩、益气生精、补肾宁心之功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、盗汗、短气脉虚、心悸失眠等症[2-3]。五味子除药用外，还可以作为调味剂和食品添加剂用于炖鱼炖肉、熬汤、熬粥、泡茶、加工酸奶等果汁饮料[4-6]。现代药理研究表明，多糖、挥发油、木脂素[7-9]是五味子的主要活性成分。其中，木脂素尤其是联苯环辛烯类木脂素（其成分包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素）[10]，除了具有保肝降酶、止咳、抗炎消毒作用外，还具有抗氧化、抗衰老、抗癌症、消除疲劳、增强机体免疫力等活性[6，8]，已广泛用于临床治疗。多糖具有与之类似的活性，且对糖尿病有显著的治疗效果。挥发油具有良好的镇咳作用，其效力相当于75%的可待因[11]。五味子醇甲、五味子酯甲等木脂素类成分在传统提取方法中主要采用冷浸法、回流法和渗漉法等，这些方法提取时间长、活性成分提取率低；超声波-微波协同萃取新技术将超声波与微波2种作用相结合，充分利用超声波振动的空化作用和微波的高能作用，克服了常规超声波和微波萃取的不足之处，具有溶剂用量少、提取时间短、提取效率高、操作简单等优点；RP-HPLC分析方法准确、灵敏度高、重现性好。本研究对五味子木脂素的萃取方法进行了改良，建立了超声波-微波协同萃取-高效液相色谱同时检测5种木脂素的方法。关于五味子木脂素、挥发油、多糖提取方面的相关文献报道较多，但是对上述活性物质的提取都是分开进行的，某单一成分提取后的药渣往往被作为废弃物扔掉，严重浪费了五味子的药用资源，因此研究综合利用五味子的意义越来越重要，一种综合提取木脂素、挥发油、多糖的新方法亟需建立。本研究先采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，再将水提液与药渣分离，对水提液进行醇沉，对药渣采用超声波-微波法再次提取。通过将本提取方法与未提油而分别直接水提、醇提五味子的方法进行比较，探讨五味子挥发油、多糖与木脂素综合提取新方法的可行性。

1材料与方法

1.1仪器

P230依利特高效液相色谱仪，EC2000色谱工作站，配UV-230+紫外可见检测器，722型-可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），CW-2000A超声波-微波协同萃取/反应仪（中山大学-上海新拓分析仪器科技有限公司），RT-08多功能粉粹机（荣聪精密科技有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），Allegra 64R离心机（BACKMAN公司），SHZ-D循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂）。

1.2药品及试剂

五味子药材购买于吉林省通化市，产地为长白山地区，经吉林化工学院环境与生物工程学院隋新副教授鉴定为五味子的干燥果实。

对照品五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素来自中国药品生物制品检定所，五味子醇甲、五味子丙素来自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，试验用水为超纯水。

1.3测定项目与方法

1.3.1五味子木脂素含量的测定

1.3.1.1高效液相色谱条件Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。流动相为乙腈（A）和水（B）：0～10 min，40%～55%A；10～20 min，55%～68% A；20～25 min，68%～74% A；25～32 min，74%～75% A；32～37 min，75%～100% A；37～48 min，100%A；48～48.1 min，100%～40%A；48.1～65 min，40%A。檢测波长225 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.3.1.2木脂素标准曲线的建立取置于干燥器中48 h以上的各对照品，精确适量称取，分别加甲醇溶解并定容，得到1.023 mg/mL五味子醇甲、1.046 mg/mL五味子酯甲、1.261 mg/mL 五味子甲素、1.104 mg/mL五味子乙素、1.026 mg/mL 五味子丙素单对照品储备液。

分别精确量取各对照品储备液适量，依次配成质量浓度为204.6、209.2、252.2、220.8、205.2 μg/mL的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素混合对照品溶液。先用2倍稀释法连续稀释3次后，再采用5倍稀释法连续稀释2次，得到6个浓度的混合对照品溶液。按照“131”高效液相色谱条件进样，以各木脂素相应的峰面积y为纵坐标、质量浓度x（μg/mL ）为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。表15种木脂素的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和检出限

nlc202309012120

（μg/mL）五味子醇甲y=97.178x+317.020.999 21.0～204.60.041 50.123 6五味子酯甲y=97.787x+73.3830.999 91.0～209.20.047 60.141 5五味子甲素y=107.48x-427.320.999 91.3～252.20.031 80.098 3五味子乙素y=103.35x-102.400.999 81.1～220.80.029 20.087 9五味子丙素y=106.91x-60.7840.999 81.0～205.20.050 70.152 1

1.3.2五味子多糖含量的测定按照苯酚-硫酸法[12]，以葡萄糖为标准样，在最大吸收波长490 nm处测定吸光度。以吸光度D为纵坐标、葡萄糖浓度C（g/mL）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为D=0.009 9C-0.017 9，决定系数r2=0999 7。

多糖得率=多糖质量药材质量×100%

1.3.3挥发油、多糖与木脂素单一成分提取

1.3.3.1水蒸气蒸馏法提取挥发油五味子粉碎，过120目筛，于 60 ℃下烘干，精确称取一定的量，参照沈文等优化的方法[13]，按料液比1 g ∶5 mL加入蒸馏水，浸泡1 h，水蒸气蒸馏5 h，静置1 h，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水干燥，备用。

1.3.3.2回流法提取多糖五味子粉碎，过120目筛，于60 ℃下烘干，精确称取10.0 g，根据郭志欣等报道的五味子多糖的最佳提取工艺[14]，按照料液比1 g ∶30 mL加入蒸馏水，于100 ℃下回流提取4 h，提取液经离心后收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至1 g ∶2 mL（粉末质量 ∶浓缩液体积），加无水乙醇至体积分数为80%[15]，4 ℃下静置过夜，离心，沉淀用无水乙醇洗涤数次，真空干燥得粗多糖。取适量，用蒸馏水溶解，记为多糖提取液Ⅰ，含量测定结果见图1。

1.3.3.3超声波-微波协同法萃取木脂素五味子粉碎，过120目筛，60 ℃烘干后精确称取10.0 g，通过设计响应面试验对超声波-微波萃取木脂素工艺进行优化，确定按照料液比1 g ∶10 mL加入80%乙醇，在超声波频率、功率分别为40 kHz、50 W条件下，以150 W的微波功率萃取10 min，减压抽滤，烧瓶及药渣添加少量提取溶剂洗涤数次，继续抽滤，合并全部滤液；用旋转蒸发仪浓缩，干燥得木脂素浸膏；精确称取少量木脂素浸膏，用甲醇溶解，配成一定浓度，记为木脂素提取液Ⅰ，取少量过0.22 μm尼龙微孔滤膜，进样20 μL，高效液相色谱检测，木脂素色谱分离图和含量分别见图2-A和表2。

2揮发油与木脂素、多糖综合提取试验

提取挥发油的药渣，60 ℃恒温干燥24 h，重新粉碎直至完全过120目筛，一份加入300 mL蒸馏水，按照“1.3.3.2”节所述方法回流提取结束，加入乙醇沉淀过夜，沉淀用无水乙醇洗涤数次后，取适量配成一定浓度溶液，记为多糖提取液Ⅲ，含量测定结果见图1；另一份加入100 mL 80%乙醇溶液，按照“1.3.3.3”节所述，超声波-微波法协同萃取，干燥得木脂素浸膏，然后取适量用甲醇溶解，取少量过0.22 μm尼龙微孔滤膜，记为木脂素提取液Ⅲ，进样20 μL，高效液相色谱检测，木脂素色谱分离图和含量分别见图2-C和表2。

提油药渣（多糖提取液Ⅲ）中多糖含量仅为0.09%，而从提油药渣分离的水溶液中（多糖提取液Ⅱ）的多糖含量与直接从五味子提取的量（多糖提取液Ⅰ）没有差别，表明水蒸气蒸馏法提取五味子挥发油时，多糖也完全浸出，并且充分溶解到水中，提取油后的药渣几乎不含多糖。因此可以采用先水蒸气蒸馏提取挥发油，然后分离药渣，水提液加入乙醇沉淀，精制多糖。

图2 -D为五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的混合标准样色谱图。从图2 -A、2-B可以看出，直接醇提与提油后的药渣醇提这2种方法所得木脂素色谱分离图非常相近，没有任何峰的缺失，且相同的峰对

应的面积基本相等。从图2-C可以看出，木脂素提取液Ⅱ中只含有极少量的五味子醇甲，五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等其他木脂素类成分都不能检测到。

提油药渣中只有五味子醇甲含量略有降低，其他木脂素的含量都没有明显变化。与原药材的提取率相比，药渣中5种木脂素的含量已经超过95%，表明水蒸气蒸馏法提取挥发油不会造成木脂素类成分的损失，因此可以采取挥发油与木脂素相结合的方法提高五味子资源的利用率。

3结论与讨论

挥发油、多糖和木脂素是五味子的主要活性成分，本研究首次对五味子挥发油提取前后多糖与木脂素含量的变化进行了整体分析。结果显示，挥发油提取后，木脂素类化合物含量没有明显变化，多糖类物质的含量急剧降低。但是，经过对药渣中残留的水溶液进行检测后发现，其中所含的多糖类物质与五味子直接水提的含量没有差别，表明水蒸气蒸馏法提取挥发油时，多糖类物质已经被完全提取出来且转移到水中。由此可知，五味子可以通过水蒸气蒸馏法同时获得多糖和挥发油，剩余残渣作为原料继续提取木脂素，使有效成分得到综合利用。该方法节约了资源，降低了成本，提高了药材的利用率，为以后工业化五味子的综合利用提供了数据支撑。

试验发现，提油的五味子药渣醇提取液中，五味子甲素与五味子乙素之间出现了1个新峰，且面积比较大（相对含量比较高），但是其他木脂素类物质的峰数并没有减少，且面积也未发生显著差异，说明这种物质不是木脂素类成分间异构化造成的，可能是因为水蒸气蒸馏温度高，且时间长，导致热稳定性差的其他类物质结构发生转化而生成，该物质具体的结构和性质有待于后续分离单体，或通过液-质连用技术进一步研究。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草：第6卷[M]. 上海：上海科学技术出版社，1999：1558-1559.

nlc202309012120

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2009：61.

[3]郑虎占，董泽宏，佘靖. 中药现代研究与应用[M]. 北京：学苑出版社，1997：958.

[4]Yang F J，Ma C H，Yang L，et al. Enrichment and purification of deoxyschizandrin and γ-schizandrin from the extract of Schisandra chinensis fruit by macroporous resins[J]. Molecules，2012，17（3）：3510-3523.

[5]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Preparation of high purity biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra extract by ion exchange resin catalytic transformation combined with macroporous resin separation[J]. Journal of Chromatography B，2011，879（30）：3444-3451.

[6]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Study on ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of biphenyl cyclooctene lignans from the fruit of Schisandra chinensis Baill[J]. Analytica Chimica Acta，2011，689（1）：110-116.

[7]Young P J，Wook Y J，Whan C Y，et al. Antihypertensive effect of gomisin A from Schisandra chinensis on angiotensin Ⅱ-induced hypertension via preservation of nitric oxide bioavailability[J]. Hypertension Research，2012，35（9）：928-934.

[8]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of essential oil and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Baill fruits[J]. Journal of Chromatography a，2011，1218（48）：8573-8580.

[9]Zhao T，Mao G H，Zhang M，et al. Anti-diabetic effects of polysaccharides from ethanol-insoluble residue of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill on alloxan-induced diabetic mice[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2013，29（1）：99-102.

[10]劉淼，张朝晖，潘俊芳，等. 五味子多糖抗变态反应活性新发现[J]. 中成药，2012，34（4）：629-632.

[11]Li X N，Cui H，Song Y Q，et al. Analysis of volatile fractions of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. using GC-MS and chemometric resolution[J]. Phytochemical Analysis，2003，14（1）：23-33.

[12]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[13]沈文，叶正良，郭巧生. 东北不同产地五味子药材品质研究[J]. 中国中药杂志，2010，35（22）：3016-3020.

[14]郭志欣，顾地周，宋宇辉，等. 五味子药渣中多糖提取工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：254-255.

[15]范荣军，任涛，刘成柏，等. 五味子多糖提取工艺的比较研究[J]. 中成药，2008，30（6）：827-831.

有效成分分析 篇10

大蒜是百合科葱属植物的鳞茎。具有生理活性的主要成分是大蒜油。大蒜精油是一种多组分混合物,由大蒜素(二烯丙基硫代亚硫酸酯,C6H10OS2)、大蒜辣素(二烯丙基二硫醚,C6H10S2)、大蒜新素(二烯丙基三硫醚,C6H10S3)及多种含烯丙基和甲基的硫醚化合物组成,还含有柠檬醛、牛龙牛儿醇、芳樟、β-水芹烯等化合物[1],其中,大蒜辣素和大蒜新素为大蒜油的主要成分,两者在大蒜油中的含量为50%～90%。含硫有机化合物中硫的主要形式是烷(烯)基半胱氨酸亚砜和γ-谷氨酰缩二氨酸,二者占大蒜总硫化物的70%以上[2]。主要活性成分来源于S-烷(烯)基L-半胱氨酸亚砜。

早在《本草纲目》中就有记载:大蒜味辛、性温,有杀菌、解毒作用,内服治痢疾,外治疮痈肿痛等。现代科学研究还发现,大蒜精油含有新的氨基酸和多种抗癌物质。其医用价值不仅有抗癌防癌、活血、抗菌的功能,还有抗疲劳、降血脂血压、抗凝血、抗病毒、防重金属中毒、防止免疫功能缺乏等多种作用[3,4,5,6]。大蒜精油除了用于医药,还可作为食品和香料[7],并运用于农用、饲养等方面,用途广泛。因此,人们对大蒜精油的提取和成分分析做了大量的研究工作。

1 大蒜精油理化性质

大蒜油为呈浅黄色至棕红色液体,具有强烈的刺激性气味,可溶于大多数非挥发油,部分溶于乙醇,不溶于水、甘油和丙二醇等。

在25 ℃时,大蒜油密度为1.091～ 1.098 g/ml,折射率为1.574～1.582[6]。

2 常用提取方法的对比与分析

大蒜精油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法、超临界流体萃取法。

水蒸气蒸馏法是利用各组分挥发度的差异而实现分离;有机溶剂浸提法则是利用萃取剂与被萃取物分子之间的溶解度差异,使得萃取组分从混合物中分开。水蒸气蒸馏法和有机溶剂浸提法是较为传统的方法,提取出的大蒜精油,大都存在大蒜素含量低,产率低,色泽、风味差或溶剂残留等问题。而超临界流体萃取技术,以热力学相平衡为理论基础,利用组分的溶解度及挥发性差异而实现分离提纯,提高了出油率,优化了产品性质,甚至能做到无残留无污染,是一种新型绿色的分离技术,但是成本较高。

李辉等[8]采用水蒸气蒸馏法,物料比为1∶4,在60 ℃下发酵4h后,蒸馏2 h,精油提取率为0.298%。

梁永海等[9]采用溶剂浸提法与超临界CO2萃取法提取大蒜精油,萃取率为分别为0.280%和0.364%。

采用超临界CO2萃取大蒜精油,其提取率明显高于水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法。通过分析还表明,采用超临界CO2萃取得到的大蒜精油,其营养成分与风味、外观都优于水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法。

3 超临界萃取技术的基本原理及工艺特点

一种流体(气体或液体),当其温度和压力均超过其相应的临界点,则称该状态下的流体为超临界流体。图1为纯组分的温度-压力关系示意图,图中所示的阴影部分是超临界流体的范围。表1比较了超临界流体与气体、液体的一些物理性质。

注:表中超临界流体为CO2,32 ℃、13.78 MPa条件下。

由图1与表1可知,超临界流体具有以下特点。

(1)超临界流体的密度与液体接近,与液体溶剂萃取能力相当。

(2)超临界流体的扩散系数介于气态与液态之间,黏度更接近于气体。

(3)当流体状态接近临界区时,蒸发热会急剧下降,至临界点处气-液界面消失,蒸发焓为零,比热容也变为无限大。

(4)流体在其临界点附近的压力或温度的微小变化,都会导致流体密度发生相当大的变化,使溶质在流体中的溶解度也产生很大的变化。

超临界流体萃取技术,就是利用处于临界压力和临界温度上的流体具有的这些特异性能,使萃取过程中萃取物与溶剂得到有效地分离,更加有利于萃取的进行。超临界CO2萃取技术采用的萃取剂为CO2。

在实际生产过程中,由于超临界流体具有液体与气体的某些特点,因此其工艺在一定程度上被认为综合了精馏与液液萃取两个操作过程的优点,形成了一个独特的分离工艺。具有以下特点[11]。

具有精馏与液液萃取的特点。超临界技术中物质以它们的沸点高低为顺序先后被萃取。以超临界CO2为溶剂,对弱极性物质和非极性物质都有比较高的萃取能力。

操作参数容易控制。萃取剂的萃取能力取决于流体的密度,而流体的密度易通过调节温度与设定压力进行控制。

溶剂可以循环使用。在溶剂的分离与回收方面,超临界萃取优于一般的液液萃取和精馏过程,被认为是萃取速度快、效率高、能耗少的先进工艺。

特别适合于分离热敏性物质,且能实现无溶剂残留。目前最常用的萃取剂CO2的临界温度接近室温,能防止热敏性物质的降解,且无溶剂残留,非常适合于天然产物的提取。

4 超临界CO2萃取技术的应用现状及发展前景

超临界CO2萃取技术由于操作温度相对传统方法低,适用于对热不稳定、易氧化的物质的分离。与传统分离技术相比,具有提取率高、无污染、产率高、操作方便等优点。超临界CO2萃取技术是一种符合当今绿色理念的洁净、高效的提取技术。

超临界CO2萃取技术目前已在我国迅速发展,并已应用于农业资源、农业废弃物、农产品加工的副产品中有效成分的分离提取,其中一些已经实现了产业化。

由于CO2对有机物的溶解度普遍较低且临界压力相对较高,工业上的超临界CO2萃取装置采用的压力普遍在25 MPa左右,有的情况下压力会超过35 MPa,导致高压设备的投资金额增加。降低投资资金可以促进超临界流体技术的普及进程,因而需要降低压力。如何降低压力并提高萃取率,成为目前超临界CO2萃取技术研究的重点。

国际第三届超临界流体会议主席指出,丙烷是一种更为实用的工业化超临界溶剂。丙烷的临界参数为压力4.2 MPa、温度96.8 ℃。以丙烷作为超临界溶剂,实际应用的萃取压力一般在15 MPa以下,设备各部件的压力等级都能大幅度降低,从而可以减少投资,但是丙烷临界温度较高且易燃,所以其匹配的超临界流体萃取装置必需进行防爆处理[12]。

从目前的情况来看,尽管出现了丙烷等可以采用的萃取剂,但利用CO2的价格及安全优势,将新型超临界CO2萃取技术与传统的萃取技术以及自动化控制技术相结合,加强超临界CO2萃取技术在理论及管理等方面的研究,将具有很大的市场潜力。

5 大蒜精油的结构检测及成分分析

大蒜精油的结构检测,常用红外光谱法(IR)、薄层色谱法(TLC),成分分析常采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、气相色谱法(GC)及高效液相色谱法(HPLC)。

5.1 定性分析

5.1.1 红外光谱法

葛保胜等[13]对大蒜精油进行了红外光谱分析。《食品化学药典》[14]中所记载的标准大蒜油红外光谱图如图2所示,超临界萃取后乙醚精制所得大蒜精油红外光谱图如图3所示。对比可知,二者在相应出峰位置都出现了相同的吸收峰,说明其有效成分基本一致;但吸收值大小不同,各主要成分浓度有高有低。

5.1.2 薄层色谱法

李辉等[8]采用薄层色谱分析法,分别用环己烷、石油醚、正庚烷、乙酸乙酯、 丙酮和正丁醇作展开剂对提取的大蒜精油进行了薄层色谱分析。

薄层色谱法中,不同极性的溶剂体系分离与之对应极性的有效成分可生成斑点。用环己烷、石油醚和正庚烷作展开剂时,均未出现斑点,说明大蒜精油中含有的非极性组分较少(例如大蒜辣素);用乙酸乙酯和丙酮作展开剂时,均出现一个斑点,说明大蒜精油中至少含有一种中等极性的组分(例如大蒜新素);用正丁醇作展开剂时,出现了一个斑点,说明大蒜精油中至少含有一种极性较强的组分(例如大蒜素)。

5.2 定量分析

5.2.1 GC-MS法

由于大蒜精油中的大蒜素稳定性差,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对大蒜精油中的大蒜素等成分进行分析,可以得到准确的结果。

林淑芳等[15]采用此方法,分析比较了大蒜中的挥发油以及大蒜精油的化学成分。

大蒜精油是通过水蒸气蒸馏获得,而大蒜萃取液是由乙醚萃取获得的,两者所含化学成分有很大不同。后者比前者多了烯丙基硫醇、甲基异丙基硫醚等10种含硫化合物,而且所含相同化学成分的峰面积相对百分含量也有很大的不同。

大蒜萃取液和大蒜精油的总离子流色谱图如图4,其中一个色谱重叠峰及分析所得两物质的色谱图分别如图5、图6。通过非负矩阵因子分解(NMF)方法解析色谱重叠峰。

非负矩阵因子分解(Non-negative matrix factorization, NMF)是一种在非负限制约束条件下的矩阵分解方法[16],是一种适合数据降维的多元统计分析方法,它可以通过少数几个变量来表示原始数据V。它的基本思路是把非负矩阵V分解成两个非负因子矩阵W和H,其中,因子矩阵W的列数要远少于矩阵V的列数,矩阵H的行数要远少于矩阵V的行数。由于算法中不存在减法运算,原始数据可以看成为因子分解矩阵W 和H 的线性加合。NMF算法本身可保证分解结果W和H不会出现负值,其计算基于矩阵中的每个元素进行,所以结果更能代表数据的局部特征。

除了用NMF法解析色谱重叠峰,林淑芳等还用峰面积百分比法计算各化学成分的峰面积相对百分含量。最终确定了大蒜中37种化学成分,其中含硫化合物34种;以及大蒜精油中的32种化学成分,含硫化合物 28种。

金建忠[17]等也采用GC-MS技术进行化学成分研究,比较了用超临界CO2萃取技术提取的大蒜精油与用溶剂萃取法和水蒸气蒸馏法所提精油大蒜素含量的差别。三种方法所得大蒜精油的总离子图分别见图7、图8、图9。分析表明,超临界CO2萃取后分离得到了具有较高相对含量大蒜素的大蒜精油,明显高于溶剂萃取法和水蒸气蒸馏法。

用GC-MS法测定不稳定的大蒜素,简便快速,结果准确可靠,但仪器成本较高,且通常不易获得,所以不易普及。

5.2.2 GC法

周桦等[18]采用气相色谱法,应用气相色谱中常见的两种色谱固定液10%SE-30、2-硝基对苯二甲酸(FFAP)分别涂制的两根色谱柱,建立了两种简便、可靠、科学的大蒜素定量分析方法。对保健食品中的大蒜素含量,进行了测定。

气相色谱仪操作简单,造价不高,应用广泛,用来分析保健食品中大蒜素含量,既省时省力又经济。

5.2.3 HPLC法

宋光林等[19]采用高效液相色谱法,对贵州味美食品工业有限公司提供的大蒜精油中的大蒜素含量进行了测定。采用色谱柱ZORBAX-Eclipse XDB-C18,流动相甲醇-水-甲酸(75∶5∶0.1),流速1 ml/min,检测波长225.8 nm。采用高效液相色谱法检测大蒜素对照品与大蒜素样品的对比色谱图见图10。所得检测结果,平均回收率为99.72%,精密度测定结果RSD为0.27%。说明方法准确可靠,可用于对大蒜精油中大蒜素含量的测定。

6 结 语

(1)与传统天然产品的分离技术相比,采用超临界CO2萃取的大蒜精油,其提取率明显高于水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法。并具有无污染、产率高、操作方便等优点,符合当代绿色化学技术概念。

(2)超临界CO2萃取大蒜精油,实验操作温度低,适用于对热不稳定、易氧化的大蒜素的分离。现今国际上公认,低温超临界生物酶解萃取技术是最为先进成熟的大蒜精油制备技术。

(3)具有耗时少、效率高和对提取后物料破坏较小等优点,所以超临界CO2萃取适合于大蒜精油批量生产,便于制剂的后续提取工艺。