第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

关键词：

第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲（通用5篇）

篇1：第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

细胞骨架

胶原细胞外基质非胶原糖蛋白氨基聚糖和蛋白聚糖弹性蛋白广义细胞骨架细胞膜骨架细胞质骨架微丝微管中间纤维细胞核骨架核基质核纤层染色体骨架微管

微管的一般特征

 微管的形状：为中空的管状结构。

 微管的组成：由微管蛋白和微管结合蛋白组成。 微管的基本结构：微管蛋白α、β异二聚体  微管的特性：极性。（头尾相接，以---方式排列，因而原纤维具有极性。增长速度快的为正端，另一端为负端。） 基本功能：细胞器的定位和物质运输。

 微管组成的细胞器：纤毛、鞭毛、基体、中心体、纺缍体等。 三种存在形式：单管、二联管、三联管 微管的装配与动力学

（一）体外装配：

成核期（延迟期）、聚合期（延长期）、稳定期（平衡期）

（二）体外装配动力学

1、动态不稳定性

主要因素：GTP是调节微管组装的动力学不稳定性行为的主要因素。微管蛋白浓度、pH值、温度 微管的组装过程：

① GTP-微管蛋白对微管末端的亲和性大，易在其末端结合。GDP-微管蛋白对微管末端的亲和力小，易从微管末端解聚。

② GTP-微管蛋白的聚合与其浓度有关，当GTP-微管蛋白的浓度高时，其在末端聚合的速度快，使微管延长。③ 当GTP-微管蛋白在末端聚合后，GTP水解为GDP，GTP-微管蛋白的聚合速度大于GTP的水解速度时，在微管末端形成一GTP帽，使微管能稳定的延长。

④ 随着GTP-微管蛋白的浓度的下降，微管末端聚合速度下降，GTP-微管蛋

鬼笔环肽

与微丝有强亲合作用, 稳定微丝, 抑制解聚 微丝的功能

1)构成细胞的支架，维持细胞的形态。2)作为肌纤维的组成成分，参与肌肉收缩 3)参与细胞分裂 4)参与细胞运动

5)参与细胞内的物质运输 6)参与细胞内的信号转导

中间纤维（非极性、组织特异性）

中间纤维的一般特征:  中间纤维的直径约为10nm，介于肌肉粗丝和肌肉细丝之间，因而得名； 其单体为杆状蛋白；  不存在可溶性蛋白库；

 其结构及组装均不表现极性、无踏车行为；  具有组织细胞特异性；  多分布于核的外侧；

 功能：赋予细胞强大的机械强度。中间纤维的组装

１、IF单体蛋白以平行,且相互对齐的方式形成双股超螺旋二聚体.2.二聚体以反相平行的四聚体

3.每个四聚体又进一步,组装成原丝

4.两根原丝相互缠绕,以半分子长度交错的原则形成原纤维,即八聚体 5.四根原纤维互相缠绕最终成为中间纤维

中间纤维的功能

1)中间纤维在细胞内形成一个完整的网状骨架系统。2)中间纤维提供细胞的机械强度作用 3)中间纤维参与细胞连接

4)中间纤维参与细胞内信息传递及物质运输 5)中间纤维维持细胞核膜稳定 6)中间纤维参与细胞分化。

篇2：第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

1、细胞骨架

2、应力纤维

3、微管

4、微丝

5、中间纤维

6、踏车现象

7、微管组织中心（MTOC）

8、胞质分裂环

二、填空题

1、_____是一种复杂的蛋白质纤维网络状结构，能使真核细胞适应多种形状和协调的运动。

2、肌动蛋白丝具有两个结构上明显不同的末端，即_____极和_____极。

3、在动物细胞分裂过程中，两个子细胞的最终分离依赖于质膜下带状肌动纤维束和肌球蛋白分子的活动，这种特殊的结构是_____。

4、小肠上皮细胞表面的指状突起是_____，其中含有_____细胞质骨架成分。

5、肌动蛋白单体连续地从细纤维一端转移到另一端的过程称为_____。

6、微管由_____分子组成的，微管的单体形式是_____和_____组成的异二聚体。

7、外侧的微管蛋白双联体相对于另一双联体滑动而引起纤毛摆动，在此过程中起重要作用的蛋白质复合物是_____。

8、基体类似于_____，是由9个三联微管组成的小型圆柱形细胞器。

9、_____位于细胞中心，在间期组织细胞质中微管的组装和排列。

10、_____药物与微管蛋白紧密结合能抑制其聚合组装。

11、_____具有稳定微管，防止解聚，协调微管与其他细胞成分的相互关系的作用。

12、驱动囊泡沿着轴突微管从细胞体向轴突末端单向移动的蛋白质复合物是_____。

13、在细胞内永久性微丝有，临时性微丝有 ；永久性微管有，临时性微管有。

14、细胞骨架普遍存在于 细胞中，是细胞的 结构，由细胞内的 成分组成。包括、和 三种结构。

15、中心体由 个相互 排列的圆筒状结构组成。结构式为。主要功能是与细胞的 和 有关。

16、鞭毛和纤毛基部的结构式为，杆状部的结构式为，尖端部的结构式为

三、选择题

1、细胞骨架是由哪几种物质构成的（）。A、糖类 B、脂类 C、核酸 D、蛋白质 E.以上物质都包括 2.下列哪种结构不是由细胞中的微管组成（）。A、鞭毛 B、纤毛 C、中心粒 D、内质网 E、以上都不是 3.关于微管的组装，哪种说法是错误的（）。A、微管可随细胞的生命活动不断的组装与去组装 B、微管的组装分步进行 C.微管的极性对微管的增长有重要意义 D、微管蛋白的聚合和解聚是可逆的自体组装过程 E、微管两端的组装速度是相同的 4.在电镜下可见中心粒的每个短筒状小体（）。A、由9组二联微管环状斜向排列 B、由9组单管微管环状斜向排列 C、由9组三

联微管环状斜向排列 D、由9组外围微管和一个中央微管排列 E、由9组外围微管和二个中央微管排列

5、组成微丝最主要的化学成分是（）。A、球状肌动蛋

白 B、纤维状肌动蛋白 C、原肌球蛋白 D、肌钙蛋白 E、锚定蛋白

6、能够专一抑制微丝组装的物质是（）。A、秋水仙素 B、细胞松弛素B C、长春花碱 D、鬼笔环肽 E、Mg+ 7.在非肌细胞中，微丝与哪种运动无关（）。A、支持作用 B、吞噬作用 C、主动运输 D、变形运动 E、变皱膜运动 8.对中间纤维结构叙述错误的是（）。A、直径介于微管和微丝之间 B、为实心的纤维状结构 C、为中空的纤维状结构 D、两端是由氨基酸组成的化学性质不同的头部和尾部 E、杆状区为一个由310个氨基酸组成的保守区

9、在微丝的组成成分中，起调节作用的是（）。A、原肌球蛋白 B、肌球蛋白 C、肌动蛋白 D、丝状蛋白 E、组带蛋白

10、下列哪种纤维不属于中间纤维（）。A、角蛋白纤维 B、结蛋白纤维 C、波形蛋白纤维 D、神经丝蛋白纤维 E、肌原纤维

四、判断题

1、细胞松弛素B是真菌的一种代谢产物，可阻止肌动蛋白的聚合，结合到微丝的正极，阻止新的单体聚合，致使微丝解聚。（）

2、永久性结构的微管有鞭毛、纤毛等，临时性结构为纺锤体等。（）

3、纺锤体微管可分为动粒微管和非极性微管。（）

4、核骨架不象胞质骨架那样由非常专一的蛋白成分组成，核骨架的成分比较复杂，主要成分是核骨架蛋白及核骨架结合蛋白，并含有少量RNA。（）

五、简答题

1、微丝的化学组成及在细胞中的功能。

2、什么是微管组织中心，它与微管有何关系。

3、简述中间纤维的结构及功能。

4、比较微管、微丝和中间纤维的异同。

5、试述微管的化学组成、类型和功能。参考答案

一、名词解释

1、细胞骨架：细胞骨架(Cytoskeleton是指存在于真核细胞质内的中的蛋白纤维网架体系。包括狭义和广义的细胞骨架两种概念。广义的细胞骨架包括：细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。

2、应力纤维：应力纤维是真核细胞中广泛存在的微丝束结构，由大量平行排列的微丝组成，与细胞间或细胞与基质表面的粘着有密切关系，可能在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。

3、微管：在真核细胞质中，由微管蛋白构成的，可形成纺锤体、中心体及细胞特化结构鞭毛和

纤毛的结构。

4、微丝：在真核细胞的细胞质中，由肌动蛋白和肌球蛋白构成的，可在细胞形态的支持及细胞肌性收缩和非肌性运动等方面起重要作用的结构。

5、中间纤维：存在于真核细胞质中的，由蛋白质构成的，其直径介于微管和微丝

之间，在支持细胞形态、参与物质运输等方面起重要作用的纤维状结构。

6、踏车现象：在一定条件下，细胞骨架在装配过程中，一端发生装配使微管或微丝延长，而另一端发生去装配而使微管或微丝缩短，实际上是正极的装配速度快于负极的装配速度，这种现象称为踏车现象。

7、微管组织中心（MTOC）：微管在生理状态及实验处理解聚后重新装配的发生处称为微管组织中心。动物细胞的MTOC为中心体。MTOC决定了细胞中微管的极性，微管的（-）极指向MTOC，（+）极背向MTOC。

8、胞质分裂环：在有丝分裂末期，两个即将分裂的子细胞之间产生一个收缩环。收缩环是由大量平行排列的微丝组成，由分裂末期胞质中的肌动蛋白装配而成，随着收缩环的收缩，两个子细胞被分开。胞质分裂后，收缩环即消失。

二、填空题

1、细胞质骨架；

2、正极、负极；

3、收缩环；

4、微绒毛、微丝；

5、踏车行为；

6、微管蛋白、α、β微管蛋白；

7、动力蛋白；

8、中心粒；

9、中心体；

10、细胞松弛素B；

11、微管结合蛋白；

12、驱动蛋白；

13、肌细胞中的细肌丝、小肠微绒毛中的轴心微丝，胞质分裂环；鞭毛、纤毛，纺锤体；

14、、真核，支撑，蛋白质，微管，微丝，中间纤维；

15、2，垂直蛋白，9×3+0，分裂，运动；

16、9×3+0，9×2+2，9×1+2；

三、选择题

1、D；

2、D；

3、E；

4、C；

5、A；

6、B；

7、C；

8、B；

9、A；

10、E。

四、判断题

1、√；

2、√；

3、×；

4、√。

五、简答题

1、微丝的化学组成及在细胞中的功能。答：微丝的化学组成：主要成分为肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白起控制微丝的形成、连接、盖帽、切断的作用，也可影响微丝的功能。其他成分为调节蛋白、连接蛋白、交联蛋白。微丝的功能：（1）与微管共同组成细胞的骨架，维持细胞的形状。（2）具有非肌性运动功能，与细胞质运动、细胞的变形运动、胞吐作用、细胞器与分子运动、细胞分裂时的膜缢缩有关。（3）具有肌性收缩作用（4）与其他细胞器相连，关系密切。（5）参与细胞内信号传递和物质运输。

2、什么是微管组织中心，它与微管有何关系。答：微管组织中心是指微管装配的发生处。它可以调节微管蛋白的聚合和解聚，使微管增长或缩短。而微管是由微管蛋白组成的一个结构。二者有很大的不同，但又有十分密切 的关系。微管组织中心可以指挥微管的组装与去组装，它可以根据细胞的生理需要，调节微管的活动。如在细胞有丝分裂前期，根据染色体平均分配的需要，从

微管组织中心：中心粒和染色体着丝粒处进行微管的装配形成纺锤体，到分裂末期，纺锤体解聚成微管蛋白。所以说，微管组织中心是微管活动的指挥

3、简述中间纤维的结构及功能。答：中间纤维的直径约7～12nm的中空管状结构，由4或8个亚丝组成。单独或成束存在于细胞中。中间纤维具有一个较稳定的310个氨基酸的α螺旋组成的杆状中心区，杆状区两端为非螺旋的头部区（N端）和尾部区（C端）。头部区和尾部区由不同的氨基酸构成，为高度可变区域。功能：（1）支持和固定作用：支持细胞形态，固定细胞核。（2）物质运输和信息传递作用：在细胞质中与微管、微丝共同完成物质的运输，在细胞核内，与DNA的复制和转录有关。（3）细胞分裂时，对纺锤体和染色体起空间支架作用，负责子细胞内细胞器的分配与定位。（4）在细胞癌变过程中起调控作用。

4、比较微管、微丝和中间纤维的异同。答：微管、微丝和中间纤维的相同点：（1）在化学组成上均由蛋白质构成。（2）在结构上都是纤维状，共同组成细胞骨架。（30在功能都可支持细胞的形状；都参与细胞内物质运输和信息的传递；都能在细胞运动和细胞分裂上发挥重要作用。微管、微丝和中间纤维的不同点：（1）在化学组成上均由蛋白质构成，但三者的蛋白质的种类不同，而且中等纤维在不同种类细胞中的基本成分也不同。（2）在结构上，微管和中间纤维是中空的纤维状，微丝是实心的纤维状。微管的结构是均一的，而中等纤维结构是为中央为杆状部，两侧为头部或尾部。（3）功能不同：微管可构成中心粒、鞭毛或纤毛等重要的细胞器和附属结构，在细胞运动时或细胞分裂时发挥作用：微丝在细胞的肌性收缩或非肌性收缩中发挥作用，使细胞更好的执行生理功能；中等纤维具有固定细胞核作用，行使子细胞中的细胞器分配与定位的功能，还可能与DNA的复制与转录有关。总之，微管、微丝和中间纤维是真核细胞内重要的非膜相结构，共同担负维持细胞形态，细胞器位置的固定及物质和信息传递重要功能。

5、试述微管的化学组成、类型和功能。答：微管的化学组成：主要化学成分为微管蛋白，为酸性蛋白。其他化学成分为微管结合蛋白包括为微管相关蛋白、微管修饰蛋白、达因蛋白。微管的类型：单微管、二联管、三联管。微管的功能：（1）构成细胞的网状支架，维持细胞的形态。（2）参

篇3：第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

本研究用免疫组织化学方法检测人胃癌标本Ezrin、Survivin表达,探讨它们与胃癌临床病理学的关系及二者之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料与试剂

2001年1月～2002年3月手术切除,病理证实为腺癌,临床病理及随访资料齐全的胃癌蜡块标本54例,术前均未行化疗或放疗。男37例,女17例;年龄38～78岁;肿瘤的原发灶大小、深度(T)、淋巴结转移(N)由病理确定,远处转移(M)由病理学和临床确定。其中肿瘤直径<5 cm 37例,≥5 cm 17例;肿瘤浸润深度在浆膜下者15例,浸透浆膜者39例;高分化19例,中分化17例,低分化18例;局部淋巴结无转移29例,有转移25例;远隔无转移42例,有转移12例。根据1997年国际抗癌联盟(IUCC)制定的TNM分期标准进行临床分期,Ⅰ期12例,Ⅱ期14例,Ⅲ期16例,Ⅳ12例。另取正常胃组织15例作对照,标本取自胃溃疡或十二指肠溃疡手术标本中正常的胃组织,并经病理观察证实且排除重度不典型增生。男10例,女5例;年龄44～77岁。

Ezrin单克隆抗体、浓缩型Survivin鼠抗人单克隆抗体购于Santa Cruz公司;SP试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验过程常规HE染色,确定标本的组织分化程度

采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法检测Ezrin和Survivin在胃癌及正常胃组织中的表达。具体操作步骤按常规进行,其一抗工作稀释度分别为1︰100和1︰200。用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照,PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.2.2 结果判断

Ezrin、Survivin表达阳性染色主要定位于细胞胞浆中,为粗细不一的棕黄色颗粒。先于低倍镜下观察,排除肿瘤坏死出血区及边缘反应区,于肿瘤内染色相对密集区选取5个视野进行细胞记数,高倍镜下观察,以阳性细胞数占同类记数细胞的百分比为阳性细胞率。阴性(-):阳性细胞率<5%;弱阳性(+):阳性细胞率为5%～25%;阳性(++):阳性细胞率为25%～50%;强阳性(+++):阳性细胞率>50%。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差表示,Ezrin、Survivin各指标间的相关性研究采用相关分析,各组间数据的比较依据资料的性质,采用t检验或方差分析,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 Ezrin在胃癌组织中的表达

Ezrin阳性表达的黄色颗粒或棕黄色颗粒见于细胞核及胞浆中。本组54例胃癌患者中阴性(-)8例,弱阳性(+)9例,阳性(++)10例,强阳性(+++)11例,强阳性(++++)16例,总阳性表达率为85.2%(46/54)。正常对照组中,阳性表达率为53.3%(8/15),其中弱阳性(+)5例,阳性(++)3例。Ezrin在胃癌中的表达明显高于正常胃组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

2.2 Ezrin在胃癌中的表达及与临床病理因素的关系

Ezrin在胃癌TNMⅠ～Ⅳ期的阳性表达率分别为73.1%和96.4%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);有远隔转移的胃癌Ezrin表达阳性率为100%,显著高于无远隔转移的胃癌组,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);淋巴结转移组的Ezrin阳性表达率96.0%,显著高于淋巴结未转移组的75.39%(P<0.05)。Ezrin的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及浸润深度无明显关系(P>0.05)。见附表。

例(%)

1)P<0.05;2)P<0.01

2.3 Survivin在胃癌组织中的表达

本组实验Survivin表达阳性率为72.2%(39/54);良性胃组织中无1例Survivin呈阳性表达;两组间Survivin的表达差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.4 Survivin在胃癌中的表达及与临床病理因素的关系

胃癌组织中Survivin的表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小不相关(P>0.05),在有无远隔转移的胃癌组织中Survivin表达的阳性率分为83.3%和69.0%,两者表达差异无统计学意义(P>0.05)。在有淋巴结转移和无淋巴结转移的胃癌组织中Survivin表达的阳性率分别为88.0%和58.6%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。Survivin在Ⅰ、Ⅱ期胃癌组织中的阳性表达率为53.8%,在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中的阳性表达率为89.3%,二者相比差异有统计学意义(P<0.01)。在未侵透浆膜和侵透浆膜的胃癌组织中Survivin表达的阳性率分别为46.7%和82.1%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。在高、中、低分化的胃癌组织中Survivin阳性表达率分为72.7%、70.6%和77.8%,三者表达差异无统计学意义(P>0.05)。见附表。

2.5 Ezrin与Survivin在胃癌组织中表达的相互关系

胃癌组织中Ezrin与Survivin的表达呈正相关(r=0.303,P<0.05)。

3 讨论

Ezrin属于ERM家族成员之一,其编码基因位于染色体6 q25-q26,ERM蛋白的C末端与细胞骨架的Actin相连,N末端通过与细胞表面的黏附分子Cadherin、CD44等相连,在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用。Ezrin蛋白以非活化和活化两种状态存在,活化的Ezrin在细胞的运动、迁移、有丝分裂及细胞与细胞、细胞与间质黏附中有重要调节作用,通过调节肿瘤细胞黏附分子和信号转导等途径,来影响肿瘤的侵袭性[4]。

近年来的研究[5]发现Ezrin基因的表达在肿瘤的发生、浸润和转移中起到重要作用。有报道[6]称Ezrin高表达在儿童横纹肌肉瘤和骨肉瘤转移过程中起重要作用,且与肿瘤的预后密切相关。ZHANG等[7]发现Ezrin蛋白与肝癌细胞的增殖侵袭和迁移呈正相关,有研究[8]表明Ezrin蛋白在胃癌组织中高表达,且阳性表达率与胃癌淋巴结转移呈正相关,本次研究结果与上述相符。KHANNA等[9]研究发现骨肉瘤转移时,高表达Ezrin蛋白的癌细胞转移至肺组织24～72 h内,数量基本没有发生变化,而Ezrin蛋白表达受抑制的癌细胞在24 h后则不能被检测到,因为这些肿瘤细胞发生了凋亡,因此认为Ezrin可能通过激活PI3-K/AKT路径阻止到达转移病灶的肿瘤细胞发生凋亡,从而促进肿瘤细胞的转移。除此以外,像妇科肿瘤[10]、肺癌[11]、鼻咽癌[12]、骨肉瘤等[13,14]肿瘤的发生和转移也都与Ezrin蛋白有关。本研究采用免疫组织化学法分析Ezrin蛋白在正常胃黏膜及胃癌组织中的表达,显示Ezrin在胃癌中的表达显著高于正常胃黏膜组织,并且在胃癌不同浸润深度、TNM分期及有无淋巴结转移组内其阳性表达差异有统计学意义,随着胃癌浸润深度的增加和淋巴结转移的发生,Ezrin阳性表达率也增高,说明Ezrin阳性表达可预示胃癌有较高的侵袭性及转移倾向,Ezrin可能对胃肿瘤细胞发生、发展和转移有着重要的促进作用,本结论与文献报道[15]基本一致。

Survivin基因是1997年由耶鲁大学[16]的ALTIERI等用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来,全长14.7 kb,含有3个内含子和4个外显子。Survivin基因存在于人的各种胚胎组织中,除胸腺和生殖腺外,在人的正常分化成熟的组织中很少检测到Survivin的表达,而当细胞发生转化或者细胞恶变时又重新获得表达,且在大多数人类肿瘤细胞中高表达。有研究报告[17]Survivin可广泛地表达于人类各种肿瘤组织,并且表达水平与肿瘤的发生、发展密切相关,对预后判断有重要意义。

天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate spcific protease,Caspase)是直接导致细胞凋亡解体的蛋白酶系统,其中Caspase3的激活是触发凋亡的关键。Survivin通过BIR中的Trp67、Pro33、Cys84与Caspase-3和Caspase-7结合抑制Caspase的活性;通过α螺旋结构与有丝分裂纺锤体的微管结合,增强Survivin与Caspase相互作用,从而抑制细胞凋亡[18]。

Survivin可以通过以下途径发挥抗凋亡的作用:一是直接抑制凋亡终末效应器Caspase-3和Cas pase-7的活性,阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程[19]。与此同时,还通过与纺锤体纤维的结合,抑制Caspase对纺锤体的水解作用,有利于保护有丝分裂细胞器的完整性,抑制细胞凋亡[20]。而且Survivin能激活CDK-Cyclin复合物,使Rb磷酸化;与CDK结合形成Survivin-CDK4复合体,使p16与CDK4分离,促进细胞有丝分裂[21];使得p21从CDK4的复合体中释放出来,p21与线粒体Caspase-3结合,抑制其活化,阻止细胞凋亡[22]。最后导致细胞无限制增殖这一结果打破细胞增殖与凋亡平衡,最终导致肿瘤的发生。

本研究中,胃癌组织中Survivin的阳性表达率为72.7%,而在良性胃组织中无表达,与同类研究结果[23]一致。Survivin在胃癌组织中表达上调,提示Survivin可能通过抑制胃癌细胞凋亡,对胃癌的发生发展起作用。Survivin的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有明显的相关性,临床分期愈晚,Survivin表达的阳性率愈高。表明Survivin的表达预示胃癌有较高的侵袭性,Survivin对胃癌的发生、发展起着促进作用。测定胃癌组织中Survivin表达率对判断预后有着指导作用。

篇4：第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料、仪器设备

Forcel四点弯曲细胞力学电子加载仪(华西口腔医院正畸科和成都电子科技大学联合研制);细胞加力板:75 cm2聚苯乙烯组织培养瓶(Falcon, USA)瓶璧切割成8 cm×3.5 cm的加力板;荧光倒置相差显微镜(Olympus IX50/IX70, Japan);Leica Applicat图像分析系统(Leica DMI6000B Germany);F-actin直标荧光抗体BODIPY FL Phallacidin(Dako USA),激发波长505 nm、发射波长512 nm;生长培养基:DMEM培养基(Gibco,USA),加入100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素,10%胎牛血清(Hyclone, USA);分化培养基:DMEM培养基(Gibco,USA),加入100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素,5%胎牛血清(Hyclone, USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 加力

采用酶消化法和组织块法联合培养法对hPDLF做原代及传代培养,取传代至第6 代的人牙周膜成纤维细胞,以2×104/ml的密度接种于彻底灭菌的加力板上,每板细胞数量为2 ml。然后将加力板放入培养皿中,待细胞完全贴壁后加入生长培养基,37 ℃、饱和湿度、95%空气、5% CO2孵箱中培养。48 h后,将培养板浸泡于另一培养皿的生长培养基中,继续培养3 d,隔日换液。在细胞加力前1 d,将生长培养基换为分化培养基,在分化培养基中继续培养1 d后使用。

采用Forcel四点弯曲加力装置,对接种了细胞的加力板加力,频率0.5 Hz,位移1 mm,加力板变形量2 000 μstrain(细胞变形量0.2%),按0、0.5、1、4、8、12 h分为6 个加力时间段分别施加张、压应力,每个实验组包含3 个实验样本,3 个实验样本均来自同一瓶计数的细胞,以相同的细胞密度和细胞量接种在3块加力板上。

1.2.2 细胞固定与检测

在设定的时间将实验组与对照组的细胞培养板取出,用PBS液洗2 次;用4%多聚甲醛(4 ℃预冷)固定5 min;PBS液洗2 次;滴加0.1% Triton X-100,处理10 min;PBS液洗2 次,5 min/次;滴加BODIPY FL(1/200稀释),37 ℃孵箱中静置1.5 h后取出,PBS液冲洗3 次,(整个过程注意避光);在荧光倒置相差显微镜下观察细胞骨架形态及其改变情况、采集图像,并用图像处理软件测定细胞的荧光强度。

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件,用方差分析(ANOVA)分别对各加力组和未加力组的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)进行统计学分析,SNK法进行组间两两比较。P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 形态学观察

荧光倒置显微镜下观察,人牙周膜成纤维细胞未加力时,细胞排列比较乱,细胞形态呈典型的梭形,荧光染色强;F-actin纤维呈束状平行排列,纤维较疏松,分布均匀,应力纤维清晰可见(图 1)。加力后细胞形态发生变化:加力1 h可见,细胞排列整齐,形态仍呈梭形,细胞体积稍变小, F-actin纤维呈束状平行排列,压力组细胞F-actin应力纤维开始向细胞膜周围靠近(图 2、3);加力4 h后,细胞开始收缩变圆,边界清晰,细胞间隙增大, F-actin纤维束转变为紧密排列,分布不均匀,F-actin应力纤维多集中于靠近细胞膜处,束状平行排列方向性变差,应力纤维数目变少。张力组细胞长度和宽度都有收缩,细胞短而细,而压力组细胞长度缩短,宽度却有增加,细胞短而粗(图 4、5);加力8 h后,细胞形态进一步发生皱缩,F-actin应力纤维数目更少,形态仍然不规则(图 6、7);加力12 h后,细胞形态恢复呈典型的梭形,荧光染色增强,与未加力组接近(图 8、9)。

2.2 荧光强度测量

各处理组细胞骨架平均荧光染色强度值见表 1。

对不同应变组作单因素方差分析(One-way ANOVA)和SNK法组间两两比较显示:除0.5 h和12 h组外,其余各实验组细胞平均染色强度均较对照组减弱,差异有显著性(P<0.01)。在加力4 h以内,随加力时间延长染色强度有逐渐减弱的趋势;加力4 h以后,随加力时间的延长,染色强度开始逐渐增强,加力12 h后染色强度已与未加力组接近,差异无显著性(P>0.05)。双因素方差分析显示,张力组和压力组之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

随着信号传导研究的深入,人们发现细胞骨架对力学信号的传递起着重要的作用,其功能受到不同信号的调节[1,2]。有学者[3]研究发现,微丝结构可以发生改建和重 排,说明 机 械力可以对微 丝产生影响。聚合态纤维肌动蛋白(F-actin)是微丝的主要成分,参与细胞形态维持及多种细胞功能,其结构重排、聚合和解聚的动态变化,在一定程度上反映了细胞的功能状况。

以往学者研究表明,不同性质的机械力对细胞形态和细胞骨架的作用随作用强度的变化而不同。Norton

(μm 2,±s)

(μm 2,±s)

等[4]利用双轴应变基底膜拉伸装置对牙周膜细胞进行拉伸,观察到细胞形态的变化与施加应变的大小无关。Chiba 等[5]对牙周膜成纤维细胞施加循环牵张力也发现类似的变化。Carano 等[6]发现动态和静态机械拉伸都可导致成纤维细胞直接形变,作用一定时间后,细胞能够适应新的机械环境而引起生物学效应的丧失。麻健丰等[7]采用自制的细胞体外静态机械加载装置用不同的拉伸应变量加力于细胞上,结果显示静态拉伸应变可影响牙周膜成纤维细胞的骨架形态。彭庭莉等[8]对体外培养的人牙周膜成纤维细胞施加静张力和不同的动态张力,结果表明不同张应力可引起体外培养的人牙周膜成纤维细胞的形态和F-actin发生有规律的变化,特别是动态张应力,在细胞投影面积以及细胞平均荧光强度方面均与加力时间呈正比,微丝随加力时间的延长而逐渐变粗。杨美祥等[9]对hPDLF分别施加静压力、周期性牵张力和流体剪切力,流体剪切力作用6 h后,部分人牙周膜成纤维细胞出现收缩、微丝排列等方面的变化;12 h后,部分细胞死亡、脱落。较大的静压力(>100 kPa)作用12 h后,可引起细胞间隙增大等变化,细胞骨架改变较少。

本研究采用的Forcel四点弯曲加力装置原理类似于机械梁四点弯曲加载原理。将体外培养的细胞种植于细胞培养板上,通过该装置的驱动,培养板弯曲变形,其上、下表面积发生改变,一方为张应力,另一方为压应力。通过控制垂直向的位移,可以精确控制细胞所受的应变量,且应变量大小恒定、统一。细胞应变的大小根据公式ε=td/a(L-1.33a)算出,其中ε为应变量,t为培养板的厚度,d为垂直向位移,a为同侧内外支撑点距离,L为两外侧支撑点距离。

本实验对比研究了动态张应力和压应力对体外培养的人牙周膜成纤维细胞的细胞形态和细胞骨架的作用,结果发现加载2 000 μstrain时2 种性质的力在加载4 h内使细胞荧光染色强度逐渐下降,加载12 h后细胞形态恢复正常、染色强度已接近未加力组,动态张、压应力在同一时段对hPDLF细胞骨架的荧光染色强度差异无显著性(P>0.05)。结果提示动态张应力和压应力都能使体外培养的人牙周膜成纤维细胞的细胞形态和细胞骨架发生变化,体外培养的hPDLF细胞骨架对动态张、压应力的敏感度无明显差异。

本实验的结果表明hPDLF细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性,能够适应一定范围的机械力作用,而细胞骨架肌动蛋白表达量在受力后改变表明肌动蛋白在细胞内机械力信号的传导中起作用,初步揭示了机械力作用下细胞骨架形态结构变化的规律,为后续研究提供了方向。

摘要：目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化。方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1000、2000、4000μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化。结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异。结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性。

关键词：人牙周膜成纤维细胞,张应力,压应力,细胞骨架

参考文献

[1]You L,Cowin SC,Schaffler MB,et al.A model for strain am-plification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix[J].J Biomech,2001,34(11):1375-1386.

[2]Moller W,Nemoto I,Matsuzaki T,et al.Magnetic phagosome motion in J774A.1macrophages:Influence of cytoskeletal drug[J].Biophys J,2000,79(2):720-730.

[3]Akisaka T,Yoshida H,Inoue S,et al.Organization of cy-toskeletal F-actin,G-actin,and gelsolin in the adhesion structures in cultured osteoclast[J].J Bone Miner Res,2001,16(7):1248-1255.

[4]Norton LA,Andersen KL,Arenholt-Bindslev D,et al.A me-thodical study of shape changes in human oral cells per-turbed by a simulated orthodontic strainin vitro[J].Arch O-ral Biol,1995,40(9):863-872.

[5]Chiba M,Mitani H.Cytoskeletal changes and the system of regulation of alkaline phosphatase activity in human perio-dontal ligament cells induced by mechanical stress[J].Cell Biochem Funct,2004,22(4):249-256.

[6]Carano A,Siciliani G.Effects of continuous and intermittent forces on human fibroblastsin vitro[J].Eur J Orthod,1996,18(10):19-26.

[7]麻健丰,胡军,张秀华,等.静态拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞的影响[J].实用口腔医学杂志,2003,19(5):439-442.

[8]彭庭莉,杨军,周继祥.不同张应力对体外培养的人牙周膜成纤维细胞形态和纤维型肌动蛋白改变的影响[J].第三军医大学学报,2005,27(9):898-900.

篇5：第七章细胞骨架与细胞的运动复习提纲

组织器官纤维化是由于胶原合成增加和降解减少所致。目前对胶原降解的研究主要集中在胞外途径, 但关于成纤维细胞吞噬胶原的报道相对较少。Mc Culloch等学者报道胶原吞噬在药物[1]和细菌[2]引起的牙周组织纤维化中起着重要作用。Gersana等[3]发现促进微丝分解的药物抑制牙龈成纤维细胞胶原吞噬早期的步骤。由此可见, 细胞的微丝骨架 (filament actin, F-actin) 在细胞吞噬运动中起着重要作用。

本课题利用激光共聚焦技术、流式细胞术等观察槟榔碱对体外培养的口腔黏膜成纤维细胞 (oral mucous fibroblasts, OMFbs) 胶原吞噬及其F-actin的影响, 旨在初步探讨槟榔碱在OSF发病过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

槟榔碱粉剂, 可溶性Ⅰ型鼠尾胶原蛋白, 2.0μm FITC标记荧光微球 (Sigma公司, 美国) 。FITC-鬼笔环肽 (Fluka公司, 美国) , 流式细胞仪 (BD公司, 法国) , 激光共聚焦显微镜 (ZEISS公司, 德国) 。

1.2 细胞培养及鉴定

在知情同意前提下, 将取自健康志愿者的口腔黏膜上皮组织在无菌条件下以组织块法培养。培养的第3~10代细胞用于实验。倒置显微镜下观察细胞形态。SABC法进行免疫细胞化学波形丝蛋白、角蛋白单抗染色, 光镜下观察染色情况。

1.3 槟榔碱对OMFbs胶原吞噬的影响

槟榔碱粉剂溶于DMEM完全培养基中, 终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。实验组分别加入含上述浓度槟榔碱的培养液, 对照组加入DMEM完全培养液, 继续培养24 h。弃瓶内原培养基, PBS冲洗3遍, 加入无血清DMEM培养基继续培养24 h。在培养基中加入临时制备的胶原包被荧光微球[4], 细胞与胶原微球比值为1∶4。孵育4 h后用0.25%的胰蛋白酶消化液制备单细胞悬液, 调整每组细胞为5×105, 流式细胞仪检测细胞吞噬率 (激发光波长488 nm, 发射光波长560 nm) 。

1.4 槟榔碱对OMFbs、F-actin的影响

将对数期生长的OMFbs按105/ml的密度接种于置有多聚赖氨酸处理过的灭菌盖玻片的六孔培养板。细胞贴壁后分别换槟榔碱浓度为0、5、10、20、40、80μg/ml的完全培养基, 继续培养24 h。细胞无血清培养基饥饿24 h后, 在培养基中加入胶原包被荧光微球, 孵育4 h, 用4%的多聚甲醛固定15 min, 0.2%trixon-X100作用10 min, 滴加5μg/ml的FITC-鬼笔环肽50μl, 室温下染色40 min, 50%缓冲甘油封固。使用共聚焦显微镜的氩离子激光扫描细胞爬片。FITC荧光激发波长为494 nm, 发射波长为518 nm, 显示绿色荧光[5]。

1.5 统计学分析

所有实验均重复3次。实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 OMFbs鉴定

细胞胞质抗角蛋白抗体染色阴性, 波形丝蛋白抗体染色阳性, 证实细胞为来自中胚层的成纤维细胞, 可以用于进一步实验 (图1~2) 。

2.2 槟榔碱对OMFbs吞噬能力的改变

浓度为5μg/ml和10μg/ml的槟榔碱对OMFbs吞噬胶原包被荧光微球的能力有明显的促进作用 (P<0.05) , 但当浓度等于或高于20μg/ml时槟榔碱对OMFbs吞噬胶原微球能力有明显的抑制作用 (P<0.05) (表1) 。

2.3 槟榔碱对OMFbs吞噬胶原时F-actin形态的改变

注:与未加槟榔碱组相比, (1) P<0.05

FITC-鬼笔环肽 (FITC-phalloidin) 标记的细胞F-actin呈绿色, 主要分布在胞膜和胞质内。FITC标记的胶原微球为球形, 亦呈绿色, 对照组OMFbs细胞内F-actin总体分布规则清晰、彼此连接, 保持细胞的正常外形;张力纤维显示束状排列, 并交叉成网格状, 维持正常极性, 可见细胞表面正形成一凹陷, 包绕一颗胶原微球 (图3A) 。

槟榔碱浓度为5μg/ml和10μg/ml时, 细胞F-actin呈粗大束状排列, 张力纤维沿细胞长轴排列, 彼此平行, 排列规律, 细胞极性增强 (图3B、C) 。

槟榔碱浓度为20、40、80μg/ml时, 张力纤维减少或消失, 排列紊乱, 极性消失;F-actin部分区域缺失, 收缩变短;细胞表层 (纤维与质膜平行排列, 通过某些位点连接质膜) 出现大量斑点样染色亮点。细胞膜发生褶皱, 细胞体积缩小, 并随着槟榔碱浓度的增加这种改变更加明显 (图3D、E、F) 。

A:对照组;B:5μg/ml槟榔碱;C:10μg/ml槟榔碱;D:20μg/ml槟榔碱;E:40μg/ml槟榔碱;F:80μg/ml槟榔碱A:Control group;B:5μg/ml arecoline;C:10μg/ml arecoline;D:20μg/ml arecoline;E:40μg/ml arecoline;F:80μg/ml arecoline

3 讨论

3.1 槟榔碱对OMFbs、F-actin的影响及意义

非肌细胞的F-actin在大多数情况下是一种动态结构, 以不同的结构形式来适应细胞活动的需要。肌动蛋白是F-actin的结构蛋白, 以2种形式存在, 即单体和多聚体。两者具有高度的动态性, 即未组装的G-actin与组装成F-actin的F-actin在胞内可以随时组装和解聚。F-actin作为一种与信号传递有关的系统, 把细胞外基质、细胞质和细胞核联系起来, 使外界信息在细胞内发挥作用, 控制核内基因表达, 在细胞的增殖、分化、运动等行为过程中具有重要作用。鬼笔环肽 (phalloidin) 可特异地与真核细胞的F-actin结合, 从而显示F-actin在细胞中的分布。本实验用FITC荧光标记的鬼笔环肽对细胞进行染色, 并结合激光共聚焦技术能够更清晰地观察细胞F-actin的形态及分布。

在共聚焦显微镜照片可以看出, 不同浓度的槟榔碱对细胞F-actin影响不同, 其改变趋势与槟榔碱引起OMFbs吞噬能力改变的趋势具有相关性。在槟榔碱浓度为5、10μg/ml组, 可以见到F-actin重排, 且较粗大张力纤维, 极性增强;而在槟榔碱浓度为20、40、80μg/ml组, F-actin明显减少, 张力纤维减少或消失, 极性减弱, 且有浓度-效应依赖关系。细胞表层斑点状荧光增多, 提示F-actin挛缩, 解聚为小的F-actin片断及低聚物。

槟榔碱是一种胆碱能M-受体激动药物。全细胞膜片夹技术研究[6]表明:低浓度槟榔碱有促Ca2+内流及增加钙通道电流作用, 而高浓度有阻Ca2+内流及降低钙通道电流作用。因此槟榔碱可能通过影响细胞内钙离子浓度调控F-actin的聚合度[7]。另外, 整合素作为细胞表面受体, 介导细胞与ECM的粘附, 使细胞内骨架与细胞外ECM形成整体;同时又参与细胞与细胞间的粘附和细胞内外的信号传递。近年来已有较多关于整合素在纤维化疾病机制中作用的研究[8]。有实验研究表明OSF病变组织中, 成纤维细胞表达与分泌整合素α1、α2的能力显著增强[9,10]。因此槟榔碱可能通过影响整合素的异常表达, 进而改变成纤维细胞F-actin的形态和分布。

3.2 槟榔碱对OMFbs吞噬胶原的影响及意义

吞噬作用是指细胞吞入较大颗粒或超级复合大分子的过程。新近一些研究发现, 机体非吞噬系统的细胞也具有吞噬潜能。国外有学者报道在纤维化形成机制中, 成纤维细胞的吞噬作用在胶原代谢中起着非常重要的作用[11]。本实验结果与Shieh等[12]的研究报道有一定差异, 当槟榔碱浓度低于或等于10μg/ml时, OMFbs吞噬胶原微球的能力升高, 当槟榔碱浓度大于等于20μg/ml时, OMFbs吞噬胶原微球的能力逐渐降低, 并具有浓度-效应依赖关系。我们推测槟榔碱对成纤维细胞的吞噬能力的影响具有双向性, 即低浓度时可以促进细胞吞噬胶原, 高浓度时抑制细胞的吞噬运动。