血吸虫病肝纤维化治疗论文提纲

论文题目：虫源microRNA在日本血吸虫病肝纤维化中的功能及其机制研究

摘要：目前,血吸虫病依然是严重影响我国经济社会发展和人民身体健康的一种重大寄生虫病。日本血吸虫病的主要病变是虫卵引起的肉芽肿和纤维化病变。虽然目前还未完全阐明血吸虫病的发病机制,但一些研究提示了可能参与该过程的一些效应细胞和效应因子。血吸虫病是一种免疫病理性疾病,在血吸虫感染初期,宿主Th1免疫反应（以IFN-γ升高为标志）被适度的激活,从而抵御在宿主体内迁移的童虫和在肠系膜静脉中未性成熟的成虫;随着虫卵在组织中沉积,宿主免疫反应很快转变为Th2免疫反应（以IL-4和IL-13升高为标志）,这些细胞因子对血吸虫病的发生、发展具有决定性作用。在人类和小鼠血吸虫病肝纤维化的模型中,已证实肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是血吸虫病肝纤维化的主要效应细胞。鉴于HSC在肝纤维化发生和发展中的核心作用,HSC已成为防治包括血吸虫病肝纤维化在内的各种肝纤维化疾病的主要靶细胞,而抑制HSC的激活是开发防治肝纤维化新方法的主要思路。尽管已有研究初步阐明了参与血吸虫病的效应细胞和效应因子,但尚不清楚血吸虫致病因子（虫卵）是如何作用于效应细胞以及如何在源头上调控其信号传递和相应的分子机制。microRNA（miRNA）是一种内源性的小分子RNA,具有广泛的功能。近年来,miRNA在包括传染性疾病在内的多种人类疾病致病过程中的作用及其机制研究已取得了重要进展。本实验室前期已经开展了宿主miRNA对血吸虫致病作用及其机制的研究。以日本血吸虫病肝纤维化小鼠为动物模型,通过体内、体外实验证实,TGF-β1和IL-13可通过激活SMAD信号通路促进HSC表达miR-21,而miR-21可通过靶向SMAD7进一步放大SMAD信号通路,从而促进肝纤维化的形成。另外,本实验室最早报道了血吸虫这种病原体存在miRNA。现已有大量研究证实虫源miRNA广泛参与虫体自身的生长发育等调控。近年来已有研究显示,血吸虫miRNA能够通过外泌体（Exosomes）进入宿主细胞,但这些虫源miRNA能否参与对宿主的致病作用,迄今尚未见报道。本课题采用HSC细胞系模型,合成并转染虫源miRNA的mimics,大量筛选并初步鉴定能活化HSC细胞和上调纤维化相关标志基因表达的虫源miRNA。同时,我们分离感染血吸虫小鼠的原代HSC,通过高通量测序鉴定存在于HSC的虫源miRNA。基于体外激活HSC-T6筛选、宿主HSC内高通量测序鉴定虫源miRNA及其特异性方面,我们选取了既能参与宿主肝纤维化调控又能进入宿主HSC的虫源miRNA（即Sja-miR-2162）作为本课题的研究对象,研究其对宿主肝纤维化的调控作用及其分子机制,包括:在体外HSC中确定其活化HSC和促纤维化发生的作用;通过在正常小鼠中过表达虫源miRNA或在感染小鼠中对虫源miRNA进行干预,检测小鼠肝纤维化程度及HSC活化状态,从而确定虫源miRNA在血吸虫病肝纤维化中的功能;通过生物信息学预测虫源miRNA的宿主靶基因,并通过体内、体外实验验证两者的靶向关系及调控的信号通路,从而阐明虫源miRNA调控血吸虫病肝纤维化中的分子机制。本研究取得了以下结果:1.虫源miRNA的筛选与鉴定为从日本血吸虫miRNA中筛选和鉴定出能够活化HSC并促进纤维化相关基因表达的的虫源miRNA,本课题选取了本实验室及其他实验室鉴定的日本血吸虫miRNA共51条,合成其miRNA mimics,并采用HSC细胞系（HSC-T6）作为体外细胞模型进行筛选,虫源miRNA mimics转染HSC-T6,48小时后采用qPCR技术检测HSC活化标志基因（Col1α1、Col3α1和α-SMA）的表达水平。结果显示,Col1α1、Col3α1和α-SMA表达水平相比对照组,表达水平显著升高的有19条虫源miRNAs,表达水平显著下降的有4条虫源miRNAs。23条虫源miRNA中有15条为血吸虫特异性miRNA,8条为保守miRNA。这些结果表明了虫源miRNA可调控宿主HSC的激活。2.感染小鼠HSC分离及虫源miRNA的检测（1）原代HSC的分离和检测通过密度梯度离心的方法分离了感染后第42、49及56天共3个时间点的原代HSC,同时还分离了对照组正常小鼠第42和56天2个时间点的HSC。为明确这些分离的小鼠原代HSC未被血吸虫虫卵或其碎片污染,我们选取了日本血吸虫虫卵期特异性表达的2个基因（AY223149和AY812797）,并采用qPCR技术检测这两个基因在两组HSC RNA样本中的表达。结果显示,在正常和感染小鼠HSC的RNA样本中均未检测到这2个基因的表达,表明分离的原代HSC未被血吸虫虫卵污染。（2）二代测序分析感染小鼠HSC中的虫源miRNAs利用上述分离的两组HSC RNA样本进行miRNA建库,并进行二代测序分析。将测序所得的miRNA序列与现有的宿主或日本血吸虫miRNA数据进行比对,从而明确在感染血吸虫的宿主HSC细胞中是否存在来源日本血吸虫的miRNA。判定为血吸虫来源miRNA的标准是:与小鼠所有已知miRNA序列比对存在3个或3个以上碱基差异,且能与已知的血吸虫miRNA序列完全配对。按照上述标准,在感染后的HSC总RNA样本中共鉴定到8条虫源miRNA。按丰度高低排序依次为:Sja-bantam、Sja-miR-190-5p、Sja-miR-125b、Sja-miR-2162-3p、Sja-miR-2a-3p、Sja-let-7、Sja-miR-10-5p和Sja-miR-1。另外,我们分析了这8条虫源miRNA与宿主miRNA保守性,结果显示:其中5条为保守性虫源miRNA,分别为Sja-miR-190-5p、Sja-miR-125b、Sja-let-7、Sja-miR-10-5p、Sja-miR-1;剩余3条为特异性虫源miRNA,分别为Sja-bantam、Sja-miR-2162-3p和Sja-miR-2a-3p。我们进一步采用qPCR技术对上述测序结果进行了验证。结果显示,未感染小鼠HSC样本中均未检测到8条虫源miRNA,而在感染小鼠HSC样本中均能稳定检测到8条虫源miRNA,其丰度和小鼠mmu-miR-203或mmu-miR-96的丰度相近。这些结果表明,在血吸虫感染过程中,部分虫源miRNA确实能进入宿主细胞。3.虫源Sja-miR-2162促进HSC的活化和肝纤维化的发生通过综合分析上述实验结果,本课题选取日本血吸虫Sja-miR-2162为研究对象,分析其在宿主肝纤维化中的作用及其分子机制。（1）Sja-pri-miR-2162过表达质粒的构建及其表达为研究Sja-miR-2162的促纤维化的功能,我们构建了Sja-miR-2162真核表达重组质粒。在Sja-pri-miR-2162基因上下游设计引物,并利用血吸虫成虫基因组DNA作为模板,PCR扩增该基因片段,并连接至8型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）的骨架质粒上。将该重组质粒转染HSC-T6细胞系,48小时后用qPCR技术分别检测Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者的表达,并用血吸虫虫卵RNA作为阳性对照样本。qPCR结果显示:血吸虫虫卵RNA样本能稳定检测到Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者的表达,其表达丰度由高到低依次为Sja-pri-miR-2162、Sja-miR-2162、Sja-pre-miR-2162;转染Sja-pri-miR-2162重组质粒的HSC-T6 RNA样本也能稳定检测三者的表达,三者的丰度由高到低依次为Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162。这些结果表明,虫源Sja-pri-miRNA基因能在宿主细胞中稳定表达且能剪切加工为有功能的成熟miRNA。（2）体外验证Sja-miR-2162对HSC激活的影响为了在体外进一步验证日本血吸虫Sja-miR-2162促纤维化的功能,我们分离正常小鼠原代HSC并进行体外培养,在培养后的第3天转染Sja-miR-2162 mimics或rAAV8-Sja-pri-miR-2162质粒,48小时后采用qPCR检测Col1α1、Col3α1和α-SMA的表达水平。相比对照组,在转染rAAV8-Sja-pri-miR-2162质粒组的HSC中能稳定检测到Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者的表达。更为重要的是,其Col1α1、Col3α1和α-SMA的表达均显著升高（p＜0.001）,且转染Sja-miR-2162mimics后,原代HSC中Col1α1、Col3α1和α-SMA的表达亦显著升高（p＜0.001）,这表明rAAV8-Sja-pri-miR-2162质粒在原代HSC中能成功表达、加工为成熟miRNA,并上调纤维化相关标志基因的表达。此外,将构建的rAAV8-Sja-pri-miR-2162质粒体外转染HSC-T6细胞系,经qPCR检测同样发现Col1α1、Col3α1和α-SMA基因的表达显著上调（p＜0.01）。（3）Sja-miR-2162诱导小鼠肝纤维化为了观察Sja-miR-2162能否在体内诱导BALB/c小鼠肝脏纤维化,我们构建了能表达Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体。该病毒载体具有高度嗜肝性,能在肝细胞中持续表达外源基因。为了优化rAAV8载体注射剂量和时间,我们首先设计了不同剂量和时间点的实验。剂量梯度:2×10~9 v.g.、2×10~100 v.g.和2×10~111 v.g.;感染时间点:感染后第20、30和40天,以2×10~100 v.g.剂量的rAAV8病毒组和PBS组为对照组。将不同感染天数的各剂量组小鼠肝脏样本进行肝纤维化标志基因（Col 1α1、Col 3α1和α-SMA）表达水平的检测。结果显示:在表达Sja-miR-2162的病毒感染后第40天、剂量为2×10~111 v.g./只的小鼠产生了肝纤维化。同时我们采用qPCR检测了感染后第40天各剂量组小鼠肝脏组织中Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者表达情况,以血吸虫虫卵RNA作为阳性对照。结果显示:在对照组虫卵RNA样本中能稳定检测到Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者的表达,其表达丰度由高到低依次为Sja-pri-miR-2162、Sja-miR-2162和Sja-pre-miR-2162;而在感染rAAV8-Sja-pri-miR-2162病毒的小鼠肝脏样本中,也能稳定检测到三者的表达,且随着感染剂量的升高,三者的表达丰度均各自随之升高。在2×10~111 v.g.剂量组中,三者的丰度由高到低依次为Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162。这些结果表明虫源Sja-pri-miRNA序列能在宿主体内稳定表达且能剪切加工为有功能的成熟miRNA。根据优化的rAAV8载体注射剂量和时间,将7周龄BALB/c雄性小鼠通过尾静脉注射2×10~111 v.g.病毒,在感染后第40天处死小鼠取肝脏检测其肝纤维化指标。利用qPCR技术能稳定检测到Sja-pri-miR-2162、Sja-pre-miR-2162和Sja-miR-2162三者的表达,表明该病毒载体携带的sja-pri-miR-2162可以在宿主肝脏细胞中表达,并能加工剪切成有功能的Sja-miR-2162。另外,qPCR结果显示,与对照组相比,在感染rAAV8-Sja-pri-miR-2162病毒的小鼠肝脏样本中,其羟脯氨酸水平显著升高（p＜0.001）,与肝纤维化相关的基因,如Col1α1、Col3α1、TIMP、Col4α1的表达水平均显著升高（p＜0.001）,rAAV8-Sja-pri-miR-2162病毒感染后第100天Masson三色染色显示,小鼠肝组织中有明显的胶原蛋白沉积。分离各组小鼠的原代HSC并检测相关基因表达,在rAAV8-Sja-pri-miR-2162病毒载体感染组的HSC中,其Col1α1、Col3α1和Col4α1表达水平均显著升高（p＜0.01）。4.中和Sja-miR-2162抑制血吸虫病肝纤维化上述实验已经表明日本血吸虫产生的Sja-pri-miR-2162能分泌至体外,并进入宿主细胞,包括肝脏HSC。进入HSC的Sja-pri-miR-2162能够上调肝纤维化相关标志基因的表达,导致纤维化的发生。日本血吸虫感染的主要病理变化是肝纤维化的发生,以往的工作已经表明,血吸虫感染诱导宿主产生的一些因子,包括宿主miRNA和IL-13等,是导致宿主肝纤维化的主要因素。根据本课题上述结果,我们提出假设:在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性miRNA（Sja-miR-2162）起到促进肝纤维化的作用。对此,本课题设计了以下实验加以验证。（1）体外细胞模型验证:虫卵分泌的Sja-miR-2162进入HSC并调控肝纤维化相关基因表达为验证日本血吸虫虫卵分泌的Sja-miR-2162能进入宿主HSC细胞并发挥作用,我们设计了一个虫卵与HSC的体内模拟环境模型:在Transwell小室的下层培养原代HSC,在上层培养新鲜分离的活虫卵。两者培养48小时后,用qPCR检测HSC中Sja-miR-2162以及其对Col1α1、Col3α1和α-SMA表达调控作用。结果显示,在共培养后的HSC中可稳定检测到Sja-miR-2162的存在,且显著上调了Col1α1和α-SMA的表达（p＜0.01）。为验证这种激活HSC的作用是否有Sja-miR-2162的贡献,我们预先在HSC中转染Sja-miR-2162抑制剂,再进行与活虫卵共培养。结果显示,与对照组相比,转染Sja-miR-2162抑制剂组的HSC表达Col3α1和α-SMA则显著下降（p＜0.01）。（2）体外下调Sja-miR-2162可抑制HSC的活化分离感染后第56天小鼠原代HSC并进行体外培养,培养至第3天转染Sja-miR-2162抑制剂,24小时后采用qPCR检测Sja-miR-2162水平和HSC活化情况。结果显示:Sja-miR-2162抑制剂能显著减少感染后HSC中Sja-miR-2162的水平。与此同时,下调Sja-miR-2162能显著降低了HSC Col1α1和Col3α1的表达水平（p＜0.05）。此结果表明,在血吸虫感染的小鼠HSC中存在虫源Sja-miR-2162,而采用抑制剂干预该虫源miRNA能降低胶原蛋白的产生。（3）体内验证Sja-miR-2162能促进小鼠肝纤维化的作用为验证虫源Sja-miR-2162在体内能参与血吸虫病肝纤维化的过程,我们构建了能在肝脏中特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体（rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge）。将7周龄BALB/c雄性小鼠感染日本血吸虫后第24天注射1012v.g./只剂量的rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体,其中scramble组、PBS组以及正常小鼠组为对照组,在感染后第56天处死小鼠取肝脏检测其肝纤维化指标。结果显示,rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge组相比scramble组,羟脯氨酸含量显著下降（p＜0.05）,与肝纤维化相关的基因,如Col1α1、Col3α1、α-SMA、TIMP和Col4α1,其表达水平均显著下降（p＜0.001）,Masson三色染色显示肝组织中胶原蛋白沉积明显减少（p＜0.05）,HE染色显示虫卵肉芽肿面积显著减小（p＜0.001）。分离各组小鼠的原代HSC并检测相关基因表达,在rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体感染组的HSC中,其Col1α1、Col3α1、α-SMA和TIMP表达水平均显著下降（p＜0.001）。以上两部分结果验证了我们的假设,即血吸虫Sja-miR-2162可跨物种调控宿主肝纤维化。5.Sja-miR-2162的靶基因及其通路（1）靶基因的预测和验证:我们采用miRDB计算机软件（http://www.mirdb.org/miRDB/custom.html）预测了Sja-miR-2162在宿主细胞中的靶基因。根据预测结果和纤维化相关通路等综合分析,初步确定了三型转化生长因子受体（transforming growth factor,beta receptorIII,TGFR3）为候选靶基因并进行实验验证。首先采用双荧光素酶报告基因系统进行验证,利用DNA合成的方法将TGFR3 mRNA 3’UTR中的靶位点合成并连接到双荧光素酶报告基因质粒上。将Sja-miR-2162 mimics和该重组质粒共转染293T细胞,并检测荧光蛋白的表达。实验结果显示,野生质粒组中,相比NC对照组,Sja-miR-2162mimics能显著降低带有靶位点质粒荧光蛋白的表达（p＜0.01）。（2）上调Sja-miR-2162可抑制宿主TGFR3的表达随着感染时间的延长,Sja-miR-2162逐渐在肝脏细胞中积累,而TGFR3的表达也随之下降;在HSC-T6细胞系转染Sja-miR-2162过表达质粒后,TGFR3的表达水平则显著下降（p＜0.05）;且在原代HSC中转染Sja-miR-2162过表达质粒后,TGFR3的表达水平亦显著下降（p＜0.001）;利用rAAV载体在正常小鼠肝脏中表达Sja-miR-2162后,肝组织和HSC中的TGFR3的表达水平均显著下降（p＜0.001）。（3）下调Sja-miR-2162促进靶基因TGFR3的表达在感染小鼠后第56天中分离的原代HSC中转染Sja-miR-2162抑制剂后,TGFR3的表达水平均显著升高（p＜0.01）;利用rAAV8载体在血吸虫感染小鼠肝脏中中和Sja-miR-2162后,肝组织和HSC中的TGFR3的表达水平则显著升高（p＜0.01）。小结:本课题通过对日本血吸虫miRNA促纤维化功能的大量体外筛选以及对感染血吸虫小鼠HSC的深度测序,发现了血吸虫特异性虫源Sja-miR-2162在血吸虫感染过程中进入宿主HSC,并在体外细胞模型中显示出促纤维化作用。在此基础上,我们对Sja-miR-2162的促纤维化功能及其分子机制开展进一步的研究。通过体外原代HSC及HSC-T6细胞系研究显示,转染Sja-miR-2162 mimics和过表达载体,均能促进HSC的活化。将表达Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染正常小鼠,后者的肝纤维化相关基因表达升高,同时,实验证实转入的Sja-pre-miR-2162（前体）在宿主细胞能够加工为成熟的miRNA。在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性Sja-miR-2162是否能跨物种调控宿主的肝纤维化,这是本课题的重要科学问题。本课题从不同的角度阐明该科学问题:一是体外验证:采用Transwell小室将虫卵与原代HSC共培养,发现虫源性Sja-miR-2162进入HSC,并使HSC活化,但这种激活HSC作用可以被Sja-miR-2162抑制剂所阻断;二是体内外相结合的验证:分离和培养感染小鼠的原代HSC,并转染Sja-miR-2162抑制剂,发现转染抑制剂的原代HSC其肝纤维化相关基因表达下调;三是体内验证:将特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染感染小鼠,其肝纤维化相关基因表达下降。以上三方面的实验结果表明了虫源性Sja-miR-2162能跨物种调控宿主肝纤维化。本课题最后部分阐明了TGFR3是Sja-miR-2162靶基因,即:Sja-miR-2162是通过靶向TGFR3蛋白,继而上调TGF-β1/SMAD信号通路,提高肝纤维化相关基因的表达。本研究首次证实血吸虫的miRNA可进入宿主细胞并在宿主病理过程中发挥重要调控作用,从而丰富了我们对血吸虫病发病机制的认识,并为预防和治疗血吸虫病提供新的干预靶点和思路。

关键词：日本血吸虫病;肝纤维化;虫源microRNA;跨物种

学科专业：军事预防医学

摘要

Abstract

缩略词表

一、前言

(一)日本血吸虫病流行病学现状及其危害

(二)引起日本血吸虫病的分子机制

(三)人类疾病中microRNA的功能

(四)本课题的立项依据

二、实验材料

(一)主要试剂