血管紧张素转化酶基因多态性与特发性肺纤维化相关性

关键词：

特发性肺纤维化是一种慢性炎症性间质性肺疾病, 发病机制尚未完全阐明, 近年来国外有文献报道, 遗传基因对发病过程可能有一定的影响。随着分子生物学技术的不断发展, 己发现大量的细胞因子, 多种细胞表面分子、多种免疫活性细胞, 炎性细胞和多种炎症性介质以不同形式参与了肺纤维化发病机制的调节, 这使我们从细胞水平转向分子水平来研究和阐明肺纤维化的发病机理, 目前ACE及其基因I/D多态性与肺纤维化的关系已逐渐受到人们重视。本研究从64例病人和54例健康人外周静脉血中提取DNA, 探讨特发性肺纤维化患者ACE插入与缺失基因多态性与特发性肺纤维化的关系, 以及特发性肺纤维化患者血中ACE活性和AngⅡ水平的变化。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 IPF组

按照中华医学会呼吸分会2002年《特发性肺纤维化诊断和治疗指南》制定的诊断标准, 选择肺纤维化患者共64例 (男36例, 女28例) , 年龄42～78岁, 平均年龄 (58.4±7.3) 岁, 病例组人群均排除心血管疾病、糖尿病肾病及结节病。

1.1.2 对照组

健康献血者共54例 (男32例, 女22例) , 年龄48～67岁, 平均年龄 (55.8±4.3) 岁。

1.1.3 来源地

研究对象均来自于河北省的汉族人口。

1.2 方法

1.2.1 清晨抽取外周静脉血6mL, 其中4mL抗凝剂静脉血提取血浆置于EP管中, 用于测定ACE、AngⅡ, 另外2mLEDTA抗凝血提取DNA留作ACE基因分型检测。

1.2.2 应用PCR技术扩增IPF组和对照组ACE基因16内含子目的片段。引物设计:正义5′-CTGGAGACCACT-CCCATCC TTTCT-3′, 反义5′-GATGTGGCCATCACA-TTCGTCAGA T-3′。20uL反应体系:包括上、下游引物各2uL、模板DNA2uL、4×dNTP0.5uL、10×Taq缓冲液2uL、Taq聚合酶0.2uL、PCR染料2uL、超纯水11.3uL。反应条件:将扩增反应体系离心混匀, 用2滴液体石蜡覆盖。94℃预变性5min, 94℃变性45s, 56℃退火60s, 72℃延伸60秒, 共30个循环。完成30个循环后72℃再延伸5min终止扩增。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳, 130V电压下30min, 溴乙锭染色后紫外灯下观察结果 (图1) 。

图1ACE基因型的测定:1代表DNA MarkerC (50bp/150bp/300bp/500bp/800bp-/1000bp) ;代表ID基因型;35代表DD基因型;4代表II基因型;取外周静脉血浆1mL, 采用竞争放射免疫分析法测定血管紧张素Ⅱ。放射免疫药盒由中国北京科美东雅生物有限公司提供。

注:*P<0.05, DD genetype compared beteen two groups#P<0.05, ID genetype compared beteen two groups△P>0.05, II genetype compared beteen two groups

注:P<0.05, D allel compared beteen two groups△P<0.05, I allel compared beteen two groups

取外周静脉血浆1mL, 采用紫外吸收法测定ACE酶的值。ACE酶紫外吸收法测定试剂盒由中国北京科美东雅生物有限公司提供。

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行统计学分析, 计量资料均以 (x-±s) 表示。计量资料组间均数的比较采用t检验;组间基因型频率和等位基因频率采用χ2检验。所有统计学处理以 (P<0.05) 为差异显著。

2 结果

2.1 ACE基因I/D多态性在肺纤维化组和健康对照组间的分布情况 (表1)

2.1.1 肺纤维化组DD基因型为32例, 占50.0%, 而对照组为10例, 占18.5%, 2组相比有显著性差异 (χ2=12.662, P<0.05) , 肺纤维化组DD基因型频率较对照组显著升高。

2.1.2 ID基因型在肺纤维化组为19例, 占29.7%, 对照组为31例, 占57.4%, 两者相比有显著性差异 (χ2=9.216, P<0.05) , 肺纤维化组ID基因型频率较对照组明显减少。

2.1.3 II基因型在肺纤维化组为13例, 占20.3%, 对照组为13例, 占24.1%, 2组间的频率差异无显著性 (χ2=0.241, P>0.05) 。

2.2 ACE基因I/D等位基因在肺纤维化组和健康对照组间的分布 (表2)

2.2.1 D等位基因在肺纤维化组占64.8%, 对照组占47.2%, 2组相比有显著性差异 (χ2=7.412, P<0.05) , 肺纤维化组D等位基因频率较对照组显著升高。

2.2.2 I等位基因在肺纤维化组占35.2%, 对照组占52.8%, 2组相比有显著性差异 (χ2=7.412, P<0.05) , 肺纤维化组I等位基因频率较对照组明显减少。

2.3 血浆ACE活性与AngⅡ水平的比较 (表3)

2.3.1 肺纤维化患者血浆ACE活性为 (40.11±11.32) , 对照组为25.65±6.66, 两者相比有显著性差异 (t=8.601, P<0.05) , 肺纤维化患者血浆ACE活性较对照组显著升高。

2.3.2 肺纤维化患者血浆AngⅡ水平为 (57.74±20.68) , 对照组为 (46.13±16.62) , 两者相比有显著性差异 (t=3.380, P<0.05) , 肺纤维化患者血浆AngⅡ水平较对照组显著升高。

3 讨论

研究发现ACE基因存在数种多态性标记如:T93C、T1237C、T5941C、A240 T、I/D和4656 (CT) 2/3等, 研究最多是I/D多态性。ACE基因外显子16上有一种2 87 bp的插入/缺失 (in se r ti on/deletion, I/D) 多态现象, 即存在D和I2种等位基因和三种基因型:II型、DD型和ID型。ACE基因I/D多态性与肺纤维化的关系已有报道, 但目前还没有一致的结果。

本研究发现肺纤维化组DD基因型占50.0%, 而对照组为18.5%, 2组相比差异显著 (χ2=12.662, P<0.05) , 肺纤维化组DD基因型较对照组显著升高。肺纤维化组128个被观察的等位基因中, D等位基因占64.8%, 比对照组47.2%有显著性差异 (χ2=7.412, P<0.05) 。这些数字可能提示了ACE基因多态性与肺纤维化的关系。可以推测, 携带DD基因型和D等位基因的人群易患肺纤维化, DD基因型和D等位基因是肺纤维化发病的危险因素。国外也有学者进行了相关研究, Morrison[1]等发现24例美国白人肺纤维化患者中D等位基因的发生率是69.0%, I等位基因发生率是31.0%, 在48个被观察的等位基因中D等位基因与对照组比较有显著性差异;而DD基因型占42.0%, ID基因型占21.0%, II基因型占4.0%, 这些病人中三种基因型分布与对照组比较没有显著差异性。本研究与Morrison等人的研究比较, D和I等位基因的分布得出的结果相似, 而DD、ID及II三种基因型的分布与他们的研究结果不同, 这三种基因型的分布与对照组比较有差异性, 其中DD基因型在患者中明显升高, ID基因型在对照组中较高, II基因型2组无明显差异。与Morrison[1]等人的报道存在这种差异的原因尚不清楚, 可能有很多因素, 其中种族差异, 遗传及环境因素可能与此有关。同时, 由于采用传统的病例对照研究, 以及样本数量大小不同, 对于病情介定不同都会导致不同结果。

在确定每对等位基因附近多态基因位点的意义可能在本质上仅代表了与肺纤维化不同的许多病理生理过程的一个步骤, 本研究提示了ACE基因多态性和肺纤维化可能有某种联系, 特别是在最近的关于肺纤维化病理生理研究的观点中更证明了这一点。

特发性肺纤维化, 与ACE的生物学活性相关。ACE可裂解血管紧张素I (angiotensin I, Ang I) , 产生具有强烈缩血管作用的血管紧张素II (angiotensin II, AngII) 。血管紧张素II通过激活AGTR1 (angiotensin II receptor type 1 gene) , 经自分泌TGF-β作用刺激肺成纤维细胞的增殖。

本研究中, 肺纤维化患者血浆ACE活性和AngⅡ水平较对照组显著升高。这提示ACE及AngII与肺纤维化的病变有一定联系, 这两种物质很可能是该病发生、发展的因素。但是也不能排除患者发生纤维化后继发ACE及AngII升高或者受其它因素影响, 因为ACE是一种酶, 它的活性受许多因素如温度、pH值、激素和药物等影响, 而AngII在血浆中的含量不全是由ACE控制的。尽管在病例的选择上已排除激素和药物的影响, 但是仍然会有其它干扰因素的存在, 所以, 需要做条件更加严格的试验, 进一步的研究。

逐渐增加的证据显示:ACE通过将AngI转化为AngII而与其它多种细胞因子和多态介质相互作用来参与肺纤维化的过程[2]。AngII通过激活血管紧张素I型受体 (AGTR1) , 增加成纤维细胞的促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 活性和DNA合成, 上调TGF-β[3], 而TGF-β其突出作用是增加细胞外基质 (ECM) 合成的同时减少其蛋白降解, 改变ECM合成和降解的正常平衡。本研究推断, ACE水平升高引起AngII活性增加, AngII通过TGF-β和其它促有丝分裂剂诱导肺成纤维细胞的增殖。

体内ACE的活性控制部分血液循环中AngII的水平, AngII与许多细胞因子和其它多肽介质如组织因子相互作用来控制肺和其它器官的纤维化过程。在肺纤维化中把ACE、AngII受体、TGF-β等基因多态性与临床病理的因素联系在一起研究可能有助于阐明这些相互作用。

摘要：目的探讨血管紧张素转化酶 (ACE) 基因多态性与特发性肺纤维化 (IPF) 患者的相关性;监测IPF患者血浆中血管紧张素转化酶 (ACE) 活性、血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 水平的变化。方法应用PCR技术扩增ACE基因目的片段检测基因多态性;采用紫外吸收法测定ACE酶的活性;采用竞争放射免疫分析法测定AngⅡ水平。结果 (1) IPF患者与正常对照组的D等位基因频率及DD基因型分布有显著性差异 (P<0.05) 。 (2) IPF患者与正常对照组的血浆ACE活性与AngⅡ水平有显著性差异 (P<0.05) 。结论 (1) ACE基因I/D多态性与IPF发病有关, DD基因型是肺纤维化发病的危险因素。 (2) 血循环中ACE活性和AngⅡ水平升高与肺纤维化病变有关, 两者可以促进肺纤维化的发生、发展。

关键词：特发性肺纤维化,血管紧张素转化酶,血管紧张素Ⅱ,基因多态性

参考文献

[1] Morrison CD, Papp AC, et al.Increased D Allele Frequency of the Angiotensin-Converting Enzyme Gene in Pulmonary Fibro-sis[J].Hum Pathol, 2001, 32:521～528.

[2] Regina MDay, Yongzhen Yang, Yuichiro J.Suzuki, et al.Bleomycin Upregulates Gene Expression of Angiotensin Converting Enzyme via Mitogen-Activated Protein Kinase and Early Growth Response1Transcription Factor[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2001, 25:613～619.

[3] Kagami S, Border WA, Miller DE, et al.Angiotensin II sti-mulates extracellular matrix protein synthesis through ind-uction of trans-forming growth factor-beta expression in rat glomerular mesangial cells[J].J Clin Invest, 1994, 93:2431～2437.